鹅掌柴蜂蜜中特征性成分鉴定及真实性评价

王琪琦，黄忠连，王 莉，董 捷，林 珣，张根生

（1.哈尔滨商业大学食品工程学院，黑龙江哈尔滨 150000；2.中国农业科学院蜜蜂研究所，北京 100093；3.广西梧州甜蜜家蜂业有限公司，广西梧州 543000；4.江苏鸿祺生物科技有限公司，江苏泰州 225300）

蜂蜜是指蜜蜂采集植物花蜜、植物活体分泌物或在植物活体上吮吸的蜜源昆虫排泄物等生产的天然甜味物质，与其自身分泌的特殊物质结合转化、沉积、脱水、贮藏并留存于蜂巢中直至成熟的一种物质[1]。蜂蜜中主要包含葡萄糖和果糖，此外还含有少量蛋白质、酶、多酚、萜烯类等营养物质[2-4]。这些成分赋予了蜂蜜多种功能活性[5]，如抗菌[6]、抗炎[7]、抗氧化[8]等。鹅掌柴蜂蜜呈浅琥珀色，味甘略带有苦味[9]，主产自广西、广东等地，是我国南方特有的冬季蜜种。以往关于鹅掌柴蜂蜜的研究只有其抗氧化活性[10]，而其特征性成分和真实性评价方法的研究几乎没有。

据统计，蜂蜜是目前十大最易掺假食品之一[11]，其掺假方式主要包括向蜂蜜中掺入糖浆[12-13]和向高价蜂蜜中掺入低价蜂蜜。传统的蜂蜜真实性检测方法多集中在孢粉学和糖浆标志物检测上[14]。然而，孢粉学检测需要专业孢粉学背景，且无法检测多种蜂蜜混合的掺假[15]。糖浆标志物检测缺点是糖浆的种类繁多，不同种类糖浆的标志物不同，特别是有些糖浆通过大孔树脂等过滤可以有效的去除糖浆标志物，这给蜂蜜的真实性检测带来了巨大困难。AOAC 碳同位素检测也只能检测到C4 植物糖浆掺假，对C3 植物糖浆无效[16-17]。核磁共振法和超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱法价格昂贵，且核磁共振需要大量的真蜂蜜样本建立庞大的数据库作为支撑，无法对超出数据库外的样本做出评价[18-19]。

近年来，蜂蜜的真实性检测从对糖浆标志物检测转移到蜂蜜本身化合物检测上。Qiao 等[20]通过对洋槐蜜、椴树蜜、油菜蜜中的特征性成分的研究，发现洋槐蜜中的萜烯类化合物红花菜豆酸、椴树蜜中的萜烯类化合物椴树素、油菜蜜中的酚酸酯类成分丁香酸甲酯可以作为这三种单花蜜的标志性成分，结合标志性成分和指纹图谱，实现这三种单花蜂蜜的真实性评价。林珣等[21]对枸杞蜜中植物化合物分析，发现其中特有的黄酮类成分花旗松素，并将其作为枸杞蜜的标志性成分，以此建立枸杞蜜的真实性评价方法。因此，通过挖掘单花蜜中特征性化合物，通过特征性化合物建立单花蜜的真实性评价方法对单花蜜真实性评价具有重要意义。目前针对鹅掌柴蜂蜜品质评价缺乏系统的方法，因此，本研究通过对鹅掌柴蜂蜜中特征性成分进行分析，挖掘鹅掌柴蜂蜜中的特征性化合物，通过特征性化合物和指纹图谱建立鹅掌柴蜂蜜真实性评价方法，为鹅掌柴蜂蜜的真实性评价提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

鹅掌柴蜂蜜样品 中国农业科学院蜜蜂研究所提供，采自广东、广西、海南等地；甲醇（色谱纯）、乙酸（质谱纯）美国Thermo Fisher 公司；反,反脱落酸、顺,反脱落酸 纯度≥98%，美国Sigma 公司；4-（1’-环乙醚-3’-丁二醇）-3,5,5-三甲基-2-环己烯酮上海源叶生物科技有限公司；3,4,5-三甲氧基苯丙烯醇 纯度≥97%，本实验室合成。

SevenEasyS20 型pH 计 瑞士梅特勒公司；ThermoSorvall 离心机 美国Thermo Fisher 公司；Strata-X-A 固相萃取柱（3 mL）美国Phenomenex 公司；0.22 μm 滤膜 Milipore 公司；安捷伦6500 型QTOF 液质联用仪，配备Phenomenex Gemini C18（150 mm×4.6 mm，3 μm）反相色谱柱 美国Agilent 公司；DN-24W 氮吹仪 上海达洛科学仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 蜂蜜中化合物富集 参考乔江涛[22]的研究方法，称取20 g 蜂蜜样品，加入80 mL 超纯水，制备体积分数为5%的氨水，将蜂蜜样品pH 调为7，放入离心机9000 r/min 离心15 min。保留上清液，合并至烧杯，用3 mL 分析级甲醇活化SPE 固相萃取柱，再用3 mL 超纯水进行平衡，用固相萃取柱进行富集，结束后用2 mL 超纯水清洗，再用2 mL 10%的甲酸甲醇溶液洗脱，收集洗脱液，用氮气吹干后，加入2 mL 色谱级甲醇复溶，0.22 μm 滤膜过滤，装至棕色进样瓶中于4 ℃下保存，用于分析。

1.2.2 色谱分析条件 流动相A：0.2%乙酸的纯水，流动相B：0.2%乙酸的甲醇，柱温箱温度35 ℃、反相色谱柱（C18）、样品进样量20 μL、鹅掌柴蜂蜜的检测波长270 nm、总流速0.7 mL/min。鹅掌柴蜂蜜的梯度洗脱方法：0～10 min，9%～14% B；10～18 min，14%～15% B；18～28 min，15%～17% B；28～40 min，17～26% B；40～44 min，26～33% B；44～54 min，33～34% B；54～64min，34～35% B；64～69 min，35～37%B；69～74 min，37～38% B；74～84 min，38～41% B；84～89 min，41～44% B；89～96 min，44～54% B；96～126 min，54～65% B；126～135 min，65～80% B。

1.2.3 质谱分析条件 电喷雾ESI 离子源，出口电压为125 V、喷射电压为4 kV、加热温度350 ℃、氮气（N2）流速为12 L/min、雾化气流速为80 kPa、雾化器压力40 psi、碰撞气体为氦气、扫描范围为100～900 Da[23]。

1.2.4 特征性成分定性分析 首先通过一级质谱信息确定化合物的分子量及化学式，通过二级质谱数据与数据库比对，并通过二级质谱碎片信息得到化合物大致化学结构，结合化合物的极性、最大紫外吸收，推测出化合物结构。通过购买商业标准品进行验证。

1.2.5 特征性成分定量分析 称取一定质量的苦蜜素B、3,4,5-三甲氧基苯丙烯醇、反,反式脱落酸、顺,反脱落酸，配制成10 ml 标准品储备液，按照梯度进样方法进行HPLC 分析，根据不同的上样量和不同的峰面积建立标准曲线；其中x 为标准品的上样量（ng），y 为峰面积，如表1 所示。由于苦蜜素C 无商业标准品，但苦蜜素C 和苦蜜素B 是同分异构体，具有相同的分子量、相同的最大紫外吸收，并且其化学结构也相似。因此苦蜜素C 含量以苦蜜素B 的标准曲线来定量。

表1 标准品的相关信息Table 1 Information of standards

1.2.6 HPLC 指纹图谱的建立 将鹅掌柴原料蜜样品的高效液相色谱图，通过中药色谱指纹图谱软件进行相似度分析，在此过程中对比并记录各个样品中的色谱峰相似度，并在允许范围内进行多点校正，即可得到鹅掌柴蜂蜜的标准指纹图谱。

1.2.7 真实性评价方法 a.按照1.2.1 方法对蜂蜜中的特征性化合物进行富集，在1.2.2 的色谱条件下得到样品色谱峰。b.将样品色谱峰与标准指纹图谱比对，差异较大或有明显异常色谱峰的样品均不是鹅掌柴蜂蜜。c.色谱图与标准指纹图谱较一致的样品再对其中的特征性成分进行定量分析。d.样品中鹅掌柴蜂蜜的标志性成分3,4,5-三甲氧基苯丙烯醇的含量应大于或等于原料蜜中最低限量，可判定其为真正的鹅掌柴蜂蜜。

1.3 数据处理

实验所有数据分析基于SPASS 26.0 软件计算平均值及标准偏差，MassHunter 10.0 分析质谱数据，ChemBioDraw Ultra 10.4 绘制化合物结构式，使用中药色谱指纹图谱相似度评价软件建立鹅掌柴蜂蜜的指纹图谱并且分析其相似度。每组实验均为3 次平行。

2 结果与分析

2.1 鹅掌柴蜂蜜中特征性成分鉴定

鹅掌柴蜂蜜样品的高效液相色谱图如图1 所示。

图1 鹅掌柴蜂蜜样品的HPLC 图谱Fig.1 Chromatograms of heptapleurum honey

根据化合物的保留时间、最大紫外吸收波长、二级质谱碎片信息，标准品验证分析，确定出鹅掌柴蜂蜜中的5 个特征性成分。表2 为鹅掌柴蜂蜜样品的成分鉴定结果。

表2 鹅掌柴蜂蜜样品中化合物信息Table 2 Composition information on heptapleurum honey

化合物1 在正离子模式下有m/z 241.1424[M+H]+、m/z 263.1248[M+Na]+、m/z 481.2785[2M+H]+的 准分子离子峰（图2），负离子模式下有m/z 239.1276[M-H]-的准分子离子峰，因此判断该化合物的分子量为240。根据其精确质量可计算出化学组成为C13H20O4。由m/z 241.1439[M+H]+脱水产生碎片离子m/z 223.1308[M+H-H2O]+，说明化合物含有羟基；由 m/z 241.1439 [M+H]+到 m/z 197.1171[M+HCH3CHO]+，说明化合物含有“-CH（OH）CH3”片段；由m/z 137.0956 到m/z 109.1014 是脱CO，说明化合物结构具有羰基，由m/z 179.1171 到m/z 123.0805，分析结构为环烯，脱去2-甲基丙烯。该化合物在245 nm 处有最大紫外吸收峰，结合相关文献报道初步判定化合物1 是4-(1’-环乙醚-3’-丁二醇)-3,5,5-2-环己烯酮[24]。后通过标准品对其进行验证，明确化合物1 是4-（1’-环乙醚-3’-丁二醇）-3,5,5-2-环己烯酮。研究表明，环烯醚萜类物质往往带有苦味[25]，通过Virtual Taste 软件[26]对化合物1 苦味度进行预测分析，值为0.77 接近于已知的苦味物质乙酰氨基酚的苦味度0.81[27]，推测4-(1’-环乙醚-3’-丁二醇)-3,5,5-2-环己烯酮是鹅掌柴蜂蜜苦味的来源之一，因此，我们将其命名为苦蜜素B。

图2 化合物1 在正负离子模式下的一级和二级质谱图Fig.2 HPLC-MS and HPLC-MSMS spectrum of compound 1 in positive and negative ion mode

化合物2 在正离子模式下有m/z 225.1476[M+H]+、m/z 471.2662[2M+Na]+的准分子离子峰（图3），确定其分子量为224。如表1 所示，该化合物的最大紫外吸收波长为268 nm，二级特征离子碎片为m/z 181.1218 [M+H-CH3CHO]+,m/z 151.1104[M+HCH3CHO-OCH3]+,m/z 121.1005[M+H-CH3CHOOCH3-OCH3]+，判断该化合物的分子式为C12H16O4，计算其环加双键值为5，可以确定分子结构中有苯环。结合碰撞能量分析，由m/z 225.1465 到m/z 181.1218 相差44，通过元素拟合中性丢失为CH3CHO，m/z 181.1218 到m/z 151.1104 相差30，由m/z 151.1104到m/z 121.1005 相 差30，由m/z 121.1005 到m/z 91.0531 为连续断裂3 个甲氧基，根据以上断裂规律，初步推测该化合物为3,4,5-三甲氧基苯丙烯醇，后通过标准品验证，确定该化合物为3,4,5-三甲氧基苯丙烯醇，由于首次在蜂蜜中鉴定出该成分，将其定为鹅掌柴蜂蜜的标志性成分。

化合物3 在正离子模式下有m/z 241.1444[M+H]+、m/z 263.2697[M+Na]+的准分子离子峰（图4），负离子模式下有m/z 239.0523[M-H]-的准分子离子峰，因此判断该化合物分子量为240。化合物3 和化合物1 互为同分异构体。两个化合物的二级质谱断裂碎片也都接近，表明两个化合物的化学结构接近。比较化合物3 和化合物1 的碎片离子m/z 137.0958和m/z 153.0526 的丰度可知，化合物1 中碎片离子m/z 137.0958 是m/z 179.1084 经过H 重排后断裂来的，化合物3 中m/z 137.0958 可以通过m/z 179.1084经过H 重排和m/z 153.0526 的RDA 碎裂而来。因此，判断化合物1 的环氧共轭在C6 和C7 上，而化合物3 的环氧共轭在C8 和C9 上。初步断定化合物3 可能为：4-(1’2’-二羟基-3’环氧丙烷)-3,5,5-2-环己烯酮。通过Virtual Taste 软件对化合物3 苦味度进行预测分析为0.80，推测化合物3 也可能是鹅掌柴蜂蜜的苦味来源之一，因此我们将其命名为苦蜜素C。

图4 化合物3 在正负离子模式下的一级和二级质谱图Fig.4 HPLC-MS and HPLC-MSMS spectrum of compound 3 in positive and negative ion mode

化合物4 在正模式下有m/z 265.1414[M+H]+准分子离子峰（图5），负离子模式下有m/z 263.1259[M+H]-、m/z 527.2657[2M-H]-的准分子离子峰，因此，判断其分子量为264。如表1 所示，该化合物在263 nm 下有最大紫外吸收峰，结合实验室前期鉴定成果及加入标准品验证[28]，确定该化合物为反,反式脱落酸。

图5 化合物4 在正负离子模式下的一级和二级质谱图Fig.5 HPLC-MS and HPLC-MSMS spectrum of composition 4 in positive and negative ion modes

化合物5 在正离子模式下有m/z 529.2759[2M+H]+准分子离子峰（图6），负离子模式下有m/z 263.1285[M+H]-、m/z 527.2643[2M-H]-的准分子离子峰，因此，判断其分子量为264。结合表1 可知，化合物5 与化合物4 的分子量、最大紫外吸收波长及二级断裂碎片均相同，保留时间不同，因此推测两者可能互为同分异构体。结合实验室前期鉴定成果及加入标准品验证[29]，确定该化合物为顺,反式脱落酸。

图6 化合物5 在正负离子模式下一级和二级质谱图Fig.6 HPLC-MS and HPLC-MSMS spectrum of composition 5 in positive and negative ion modes

2.2 鹅掌柴蜂蜜中特征性成分定量分析

将Y01～Y10 不同产地的鹅掌柴原料蜜中的特征性成分进行定量分析，结果如表3 所示。其中，顺,反式脱落酸含量最高，平均含量14.46±0.34 mg/kg，反,反式脱落酸的平均含量为6.85±0.52 mg/kg，苦蜜素B 和苦蜜素C 的平均含量分别为5.97±0.26、11.13±0.45 mg/kg。鹅掌柴蜂蜜的标志性成分3,4,5-三甲氧基苯丙烯醇的平均含量为2.30±0.25 mg/kg，最低含量为1.73±0.18 mg/kg。

表3 鹅掌柴原料蜜中化合物含量（mg/kg）Table 3 Contents of compounds in heptapleurum raw honey samples (mg/kg)

2.3 鹅掌柴蜂蜜HPLC 指纹图谱建立

将10 个鹅掌柴原料蜜样品的高效液相色谱图导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统，在可允许范围内进行多点校正，样品间相似度均高于0.8。鹅掌柴原料蜜样品生成的指纹图谱及鹅掌柴蜂蜜的标准指纹图谱见图7 和图8。

图7 鹅掌柴原料蜜样品生成的指纹图谱Fig.7 Fingerprints of heptapleurum raw honey samples

图8 鹅掌柴蜂蜜的标准指纹图谱Fig.8 Fingerprints of heptapleurum honey

2.4 市售鹅掌柴商品蜜的真实性评价

根据上述建立的鹅掌柴蜂蜜真实性评价指标，对市售的6 个品牌鹅掌柴蜂蜜进行真实性评价。从HPLC 色谱图（图9）中可以看到，品牌A、B 和C 样品的色谱图与标准指纹图谱较一致，在三个品牌中，均检测到了在鹅掌柴蜂蜜中鉴定出的5 个成分（表4），其含量范围分别为4.12～6.65、1.98～2.72、4.57～11.23、4.96～8.25、10.92～14.68 mg/kg，标志性成分含量均大于1.73 mg/kg，与原料蜜样品中含量较接近。因此，这三个品牌为品质较好的鹅掌柴蜂蜜。在品牌D 和E 中，虽然也检测到在鹅掌柴蜂蜜中鉴定出的5 个成分，但与标准指纹图谱相比，存在较明显差异，且品牌D 中出现含量较高的异常峰。因此，推测品牌D 和E 可能混入了其他单花蜜，纯度较低。在品牌F 中，均未检测到在鹅掌柴蜂蜜中特征性成分，且与标准指纹图谱差异较大。因此，我们推测品牌F 不是鹅掌柴蜂蜜。

表4 鹅掌柴商品蜜中化合物含量（mg/kg）Table 4 Contents of compounds in heptapleurum commercial honey samples (mg/kg)

3 结论

通过HPLC-Q-TOF-MSMS 在鹅掌柴蜂蜜中共鉴定出5 个特征性成分，分别为苦蜜素B、3,4,5-三甲氧基苯丙烯醇、苦蜜素C、反,反式脱落酸、顺,反式脱落酸。首次在蜂蜜中发现3,4,5-三甲氧基苯丙烯醇，将其定为鹅掌柴蜂蜜的标志性成分。通过中药色谱指纹图谱软件，建立鹅掌柴蜂蜜的HPLC 指纹图谱，通过结合特征性成分和指纹图谱，建立了鹅掌柴蜂蜜的真实性评价方法。对市售的6 个鹅掌柴蜂蜜进行真实性评价，其中3 个品牌为品质较好的鹅掌柴蜂蜜，2 个品牌为鹅掌柴蜂蜜中可能混入其他蜂蜜，1 个品牌中未检测到鹅掌柴蜂蜜的标志性成分，并且色谱图与指纹图谱存在明显差异，推测其不是鹅掌柴蜂蜜。本研究为鹅掌柴蜂蜜的质量标准建立，提供了重要的理论依据。