烟草DUF538基因家族鉴定及根结线虫胁迫下表达分析

张路阳　张有建　饶聪颖　许燕彪　谢可　李伟　郑聪

摘要：DUF538基因是没有功能注释的蛋白，在根结线虫胁迫的响应过程中，含有DUF538结构域的蛋白质的基因表达发生变化。鉴定烟草DUF538基因家族，为烟草DUF538基因功能研究提供理论依据，有利于筛选防御根结线虫的有效基因。基于烟草全基因组数据，通过BLAST对烟草DUF538基因家族进行鉴定，利用生物信息学的方法分析了该家族成员的理化性质、基因结构、蛋白质结构域、染色体分布、系统进化及启动子，并利用qRT-PCR验证了DUF538基因家族在K326各个组织的表达情况及响应南方根结线虫侵染的表达情况。结果表明，烟草中共鉴定出8个NtDUF538基因，将其分为3类；已知的NtDUF538基因位于不同的染色体上且分布不均匀，所有NtDUF538基因均具有保守的结构域；NtDUF538基因家族启动子区域显著富集生长发育和激素响应的顺式元件，部分NtDUF538基因还具有低温胁迫的作用元件；7个NtDUF538基因在K326不同组织中存在不同程度的表达，NtDUF538-7基因只在叶和花中表达，其中NtDUF538-5和NtDUF538-6在遭受根结线虫侵染后表达量增加。研究结果揭示了烟草NtDUF538基因家族成员在根结线虫侵染过程中起到重要作用，为探究烟草NtDUF538基因家族的生物学功能提供了理论基础。

关键词：烟草；DUF538基因；全基因组鉴定；生物信息学；表达分析；根结线虫

中图分类号：S572.01文献标志码：A

文章编号：1002-1302（2023）20-0034-09

烟草（Nicotiana tabacum L.）是我国重要的经济作物，病虫害是制约其生产的主要因素之一，每年因为病虫害造成的经济损失到达15%以上，其中烟草根结线虫病是烟草上危害程度深、范围广、防治难度大的一类病害［1-3］。目前，有关烟草根结线虫病防治的研究和报道主要在化学防治和生物防治方面，但是烟草根结线虫病并没有得到彻底解决。烟草抗南方根结线虫基因的筛选为南方根结线虫抗性育种提供了新的基因资源，具有重要的理论及实际意义，有着广阔的应用前景［4-6］。未知功能域蛋白（domain of unknown function，DUF）家族是具有1个或多个没有功能注释的保守结构域的蛋白质，目前已有超过20%的蛋白含有未知功能域［7］。DUF538基因家族已被证实具有约19～21 ku的分子量并编码大约170个氨基酸残基。目前DUF538家族已经广泛被发现存在于单子叶和双子叶植物中［8-9］。但是在藻类和蓝细菌中未发现DUF538蛋白［10］。尽管DUF538基因家族未明确功能，但目前已经有大量研究证明DUF538基因家族参与植物多个生长发育和胁迫应答反应。据报道含有DUF538保守结构域的基因参与毛状体的发育，影响叶绿素的合成［8-10］。DUF538基因的表达变化存在于植物发育的各个阶段以及响应各种非生物胁迫。Ashraf等研究表明，DUF538基因（AJ535713）在鸡冠花（Celosia cristata）叶片中表达，在干旱胁迫下该基因显著上调［11-12］。另外，有一些研究顯示DUF538基因也参与生物胁迫。Xu等通过QTL定位大豆（Glycine max）抗根结线虫基因，发现具有DUF538结构域的大豆Glyma10g02180基因可能具有抗根结线虫的功能［13］。在Araujo等的研究中，首次验证了从野生花生分离出来的DUF538基因在转基因拟南芥中过表达可以抵抗根结线虫的侵染［14］。一些报道发现DUF538基因响应真菌病原体的感染。Elagamey等研究发现DUF538基因参与马铃薯（Solanum tuberosum）抵抗黄萎病的途径；Brunings 等发现水稻DUF538基因（Os11g0594800）在感染稻瘟病后显著上调；此外也有报道DUF538基因跟植物抵抗赤霉病和灰霉病相关［15-18］。目前尚未有关于烟草DUF538基因家族及其成员表达的报道，因此，本研究以拟南芥DUF538家族蛋白质序列为比对条件，在烟草全基因组的基础上，利用生物信息学的方法鉴定烟草8个DUF538基因，并分析其家族成员的理化性质、基因结构、系统进化，通过 qRT-PCR 技术研究基因在烟草K326品种不同组织中的表达及接种南方根结线虫后DUF538基因家族的表达情况。通过分析DUF538基因家族在烟草中的表达，为全面了解DUF538基因家族在烟草整个生长发育过程中的生物学功能提供了新的信息，筛选有利于防御南方根结线虫抗病基因。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料为普通烟草K326，由河南农业大学烟草学院育种实验室提供。

1.2 试验时间及地点

本试验于2022年9月在河南农业大学育种实验室进行。

1.3 根结线虫的培养

南方根结线虫在番茄（Solanum lycopersicum L.）感病品种中扩繁，由河南农业大学烟草学院育种实验室提供。待番茄根部大量根结形成时，对有南方根结线虫卵块的根结进行挑选，用1% NaClO溶液消毒，去离子水冲洗多次，去除表面的NaClO，然后放置于26 ℃恒温培养箱中孵化。3 d左右，收集孵化出来的二龄幼虫（J2s），在显微镜下计数，然后制成500条/mL的J2s悬浮液，悬浮液需在24 h内进行接种处理［19］。

1.4 烟草DUF538基因家族成员鉴定及序列特征分析

从拟南芥数据库（www.arabidopsis.org）中下载拟南芥所有的DUF538蛋白序列，在茄科基因组数据库（https：//solgenomics.net/）中进行比对（BLASTP，E值<100），获得普通烟草DUF538蛋白的氨基酸序列。通过在线网站（https：//web.expasy.org/protparam/）分析烟草DUF538蛋白的氨基酸数目、等电点（pI）、相对分子量大小、亲水性等理化性质。

1.5 烟草DUF538基因家族的进化关系分析

将烟草DUF538基因家族蛋白序列与模式植物拟南芥的DUF538基因家族蛋白序列，利用MEGA 11软件进行Clustal W比对，使用邻接法（neighbor-joining method，NJ），设置参数自展值（bootstrap replications）为1 000，利用J-T-T（Jones-Taylor-Thornton）模型构建系统进化树。蛋白质序列比对使用DNAMAN软件，使用默认参数。

1.6 烟草DUF538基因结构、保守基序及结构域分析

通过MEME在线网站（http：//meme-suite.org/tools/meme）对烟草DUF538蛋白序列进行motif分析，CBLs设置Motif数量为10，其他设置使用默认参数。保守结构域（Domain）分析采用NCBI中的CDD（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi）；利用TBtools中Gene Structure View进行Motif和保守结构域的可视化。

1.7 烟草DUF538基因家族染色体定位

从烟草基因组的数据中获得DUF538基因在染色体上的位置信息，利用Tbtools（v1.082）软件构建可视化染色体定位图［20］。

1.8 烟草DUF538基因家族顺式作用元件分析

通过软件TBtools对烟草DUF538家族基因起始密码子上游1 500 bp的启动子区序列进行提取，然后通过PlantCARE数据库（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）对烟草DUF538家族基因启动子区序列进行顺式作用元件分析，最后利用TBtools对结果可视化。

1.9 表达模式分析

利用植物总RNA提取试剂盒，分别提取根、茎、叶、花瓣、幼蕾、萼片的RNA。然后进行反转录，取RNA溶液9 μL，（dT）18 引物 4 μL，在70 ℃反应 10 min；加入5×buffer 4 μL，dNTP（10 nm）  2 μL，反转录酶0.5 μL，RNA酶抑制剂 0.5 μL，在40 ℃反应2 h，70 ℃反应15 min，在-20 ℃保存。

检测cDNA的质量，确认反转录成功后，再进行荧光实时定量PCR。根据烟草NtDUF538的CDS设计引物（表1），将引物序列交给北京擎科生物科技有限公司进行合成。荧光实时定量PCR采用诺唯赞生物公司的Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix，采用的20 μL体系是：2×Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix 10 μL；模板0.4 μL；水 8.8 μL；引物0.8 μL。荧光实时定量PCR程序：95 ℃ 预变性30 s；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，40个循环；95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s，生成熔解曲线。采用2-ΔΔCT法对基因相对表达量进行计算［21］。

2 结果与分析

2.1 烟草DUF538基因家族鉴定及基本特征分析

以拟南芥AtDUF538核苷酸序列为检索序列，基于烟草全基因组数据库，总共鉴定出8个烟草NtDUF538基因（表2）。烟草DUF538基因家族编码的氨基酸长度范围为170～203个氨基酸，分子量范围为19.119～21.967 ku，等电点的值范围为8.66～9.65。除了DUF538-1蛋白GRAVY值为正，其他烟草DUF538蛋白的GRAVY值为负，表明它们都是亲水性的蛋白。

2.2 烟草DUF538基因家族结构分析

基因结构分析（图1）显示，烟草的8个DUF538基因家族成员结构比较简单，全部具有编码区域（CDS），NtDUF538-3和NtDUF538-4不具有非翻译区（UTR），8个基因都具有内含子，且所有基因都具有DUF538结构域（图2）。

此外，为了更好地了解烟草DUF538蛋白序列的结构（motif）特征，采用MEME软件分析对保守motif和数量进行分析，鉴定了5个不同的保守基序（图3），依次命名为motif 1～motif 5。结果发现，烟草DUF538家族成员保守基序均呈现一定的排列方式，为motif 5-motif 2-motif 1-motif 3-motif 4。每个亚组内的DUF538蛋白大部分具有高度保守的motif，而不同的亚组具有不同的保守motif。

2.3 烟草DUF538基因家族成员的系统进化树分析及染色体定位

为了分析烟草DUF538基因家族的进化关系，本研究选用了模式植物双子叶植物拟南芥与烟草共同构建系统进化树。8个烟草DUF538蛋白和13个拟南芥蛋白在系统进化树中呈现了明显的聚类现象。在图4中，根据基因聚类DUF538基因家族可分为3类。8个烟草NtDUF538基因中NtDUF538-1分为一类；NtDUF538-2、NtDUF538-3和NtDUF538-4分为一类；NtDUF538-5、NtDUF538-6、NtDUF538-7和NtDUF538-8归为一类。

从NtDUF538基因的染色体分布情况来看，在8个烟草NtDUF538基因中，4个基因在1条染色体上呈现不均匀分布，其余4个基因位于未组装到染色体上的重叠群上，其余染色体不含烟草NtDUF538基因（图4）。

2.5 烟草DUF538家族基因启动子区的顺式作用元件分析

为进一步了解烟草DUF538启动子区域顺式作用元件特征，利用TBtools提取其转录起始位置上游1 500 bp序列上传到 PlantCARE网站查找各类顺式作用元件。发现4个烟草DUF538存在光信号响应顺式作用元件，推测其功能与光响应通路有关。还鉴定到5种激素响应元件，其中2个烟草DUF538基因含有赤霉素响应元件（Gibberellin-responsive element），这部分家族成员会响应赤霉素的应答反应；1个烟草NtDUF538基因含有水杨酸响应（Salicylic acid responsiveness）元件，這部分基因家族成员会响应水杨酸的应答反应；5个烟草NtDUF538基因含有茉莉酸甲酯响应（MeJA-responsiveness）元件，这些基因家族成员会响应茉莉酸的应答反应；4个烟草NtDUF538基因含有脱落酸响应（Abscisic acid responsiveness）元件，这些基因家族成员会响应脱落酸的应答反应；1个烟草NtDUF538基因含有生长素响应（Auxin-responsive）元件，这些基因家族成员会响应生长素应答反应。另外，还有与生长发育和逆境胁迫相关的顺式作用元件，主要包括玉米蛋白代谢调节（Zein metabolism regulation）和低温响应（Low-temperature responsiveness）（图5）。综上，DUF538基因家族可能参与烟草生长发育调控及多种胁迫调控途径。

2.6 烟草DUF538基因家族成员的表达分析

2.6.1 烟草DUF538基因在不同组织的表达分析 为了分析NtDUF538基因在不同组织或器官中的表达情况 本研究利用qRT-PCR技术分析了8个NtDUF538基因在烟草K326根、茎、叶、花、蕾、萼片中的表达情况。结果显示，在K326中不同的NtDUF538基因的表达差异较大，NtDUF538-1、NtDUF538-3、NtDUF538-4和NtDUF538-5基因主要蕾中表达较高；NtDUF538-4、NtDUF538-5、NtDUF538-6、NtDUF538-7和NtDUF538-8在叶中表达相对较高；NtDUF538-2基因在萼片中表达较高；所有NtDUF538基因在茎中的相对较低；NtDUF538-7基因在叶和花中表达较高，在其他部位几乎不表达（图6）。

2.6.2 南方根结线虫侵染后烟草DUF538基因的表达分析

为了验证NtDUF538基因对南方根结线虫胁迫下的表达情况，本研究利用qRT-PCR技术分析了8个NtDUF538基因在南方根结线虫侵染烟草0、7、14、21 d的表达情况。结果表明：NtDUF538-1基因在遭受根结线虫7 d时相比未接种的烟草基因表达量增加；NtDUF538-2和NtDUF538-3基因在根结线虫侵染后基因表达量降低，在7、14 d時基因表达量与对照相比无显著差异，在21 d时表达量与对照具有显著差异；NtDUF538-4在遭受根结线虫侵染7 d后表达量降低，然后升高再降低，而对照在遭受根结线虫侵染后表达量逐渐降低；NtDUF538-5在根结线虫侵然后表达量增高，在 21 d 时与对照表达量相当；NtDUF538-6在根结线虫侵染后7 d表达量增加，在14 d时显著降低；NtDUF538-8在根结线虫侵染后表达量先降低再升高，在14 d时表达量最低，而对照基因表达量逐渐降低，在21 d时表达量最低（图7）。

3 讨论

3.1 烟草DUF538家族基因的结构特征及功能预测

DUF538基因已经被证明广泛分布在植物中，并在多个生长发育和胁迫应答过程起作用。目前的研究已经在多种植物中鉴定出DUF538家族基因，玉米含有DUF538成员20个，水稻和大麦都有14个，菠萝中有8个，甘蓝型油菜有40个，大豆有22个，拟南芥有13个，葡萄有9个。本研究对烟草DUF538基因家族成员[JP+2]进行了鉴定和分析，共鉴定了8个烟草DUF538基因，低于其他物种中DUF538基因数量［22］。

目前，顺式作用元件在植物生长发育、植物激素反应和胁迫反应中具有重要的作用。烟草DUF538基因家族包含了大量的顺式作用元件，如光响应的元件、激素响应元件、低温响应元件等（图5）。烟草DUF538基因家族亚细胞定位分析显示烟草DUF538蛋白位于细胞核中，NtDUF538s基因可能是烟草重要的一类转录调控基因，参与了烟草生长发育和抵抗逆境胁迫的调控过程。尽管DUF538尚未明确功能，但最近的研究表明，它们可能在植物胁迫反应中发挥重要作用，在40多种植物中发现，DUF538基因表达行为响应各种非生物胁迫，包括干旱、高温、碳水化合物缺乏和氮毒性。据报道，DUF538蛋白还参与角质蜡的细胞内运输，影响叶片表面渗透性和水分损失控制［12，23-26］。

3.2 根结线虫胁迫下，烟草DUF538基因家族的表达

当植物受到病原物侵染后，体内的抗性基因上调表达促进寄主发生抗性反应，破坏病原物的生存环境，阻止其生长发育。植物中的抗根结线虫病基因，如番茄中的Mi基因、辣椒中的N基因等，在遭受根结线虫侵染时会产生过敏（HR）反应，同时该基因表达量显著升高。在本研究中具有相似的情况，NtDUF538-5和NtDUF538-6基因在遭受根结线虫入侵时，NtDUF538基因表达上调，未接种根结线虫的根系NtDUF538基因相对表达量差异较小（图7），这表明根结线虫的入侵促进了NtDUF538基因的上调表达［27-28］。而且从进化关系看，NtDUF538-5和NtDUF538-6亲缘关系最近 同属一个分支（图4），同时也与拟南芥根结线虫抗性基因距离较近。在之前的研究中已经验证了DUF538基因在3种不同植物物种（花生、大豆和拟南芥）的RKN易感基因型中的过表达可以提高根结线虫的抗性，这也是DUF538基因的首次验证［14］。NtDUF538-5和NtDUF538-6还具有响应茉莉酸和水杨酸的顺式作用元件（图5）。水杨酸（SA）和茉莉酸（JA）是参与许多植物抗病途径的主要植物防御激素。对于RKN侵染，植物在取食部位受到其分泌效应物的影响，导致体内SA和JA生物合成途径相关基因的表达降低，从而降低SA和JA水平并抑制植物防御［29-30］。基于以上研究，烟草NtDUF538-5和NtDUF538-6可能与根结线虫的抗性具有一定联系。

4 结论

本研究利用生物信息学技术，鉴定了烟草8个NtDUF538基因，进行了理化性质、遗传进化和表达模式分析，并研究了烟草K326侵染根结线虫后其表达情况，研究结果发现烟草NtDUF538-5和NtDUF538-6基因遭受根结线虫侵染后表达量发生显著变化，这证明了南方根结线虫入侵时，DUF538基因起到了关键作用。本研究结果将为烟草NtDUF538基因的功能研究奠定坚实的理论基础，筛选有利于防治根结线虫的抗性基因。

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收稿日期：2023-01-06

基金项目：浙江中烟工业有限责任公司项目（编号：NYK2022-04-03）。

作者简介：张路阳（1997—），男，河南郑州人，硕士研究生，主要从事烟草育种研究。E-mail：zhangluyang97@126.com。

通信作者：郑 聪，硕士，农艺师。E-mail：npyczc@163.com。