共载姜黄素和甘草酸的微米介孔硅敷料协同蓝光修复小鼠烫伤创面∗

金楠，陈欣，黄李琼

(1. 莆田学院药学与医学技术学院药学系，福建莆田 351100；2. 莆田学院药物分析与检验医学福建省高校重点实验室，福建莆田 351100)

0 引言

烫伤是最具破坏性的皮肤创伤之一[1]，轻者留疤、重者致死[2]，甚至会影响心理健康[3]．作为常见的意外疾病，烫伤影响的全球患者每年可达1 500万人[2]，死亡人数每年可达30万人[4]．烫伤后人体皮肤防御功能被破坏，多种创面渗出物和坏死组织聚集在烫伤部位[2]，加上全身免疫力下降[3]等原因，使得创面易感染细菌[5]，而创面感染又加大死亡概率．此外，烫伤不仅造成局部皮肤组织坏死，还能引发肝脏等远端器官衰竭[4]．肝脏作为上游器官，一旦受损又会通过代谢和免疫功能紊乱导致下游器官损伤[4]．因此，优异的烫伤治疗手段应该能够吸收创面渗液、加快创面愈合、抑制细菌感染和减小肝脏损伤[6]．

临床已有治疗烫伤的药物，比如抗菌药物、银盐等[7]，短期使用有抗感染作用，但长期会造成耐药和嗜中性粒细胞减少，不利于创面恢复[2]，无法兼顾抗菌和优异的组织修复功能，不适合深Ⅱ度以上的烫伤．因为这类烫伤损伤到了真皮全层，坏死的焦痂会阻碍组织再生，导致创面再上皮化缓慢，需要借助敷料、皮肤移植[6]、间充质干细胞疗法[6]进行治疗．但无论是皮肤移植还是间充质干细胞疗法均对医生技术和患者经济条件要求较高[2]．故而急需开发使用简单、价格能惠及广大患者的烫伤创面敷料．

姜黄是治疗烧烫伤的重要中药[7]，其主要成分姜黄素（Curcumin, Cur）已证实对烫伤创面有一定修复作用，能提高创面组织中IL-1β的表达[8]．虽然其单独使用具有一定抗菌活性，但需要在较高浓度下才能发挥作用[9]．而其作为单线态氧产率更高的二代光敏剂，结合蓝光照射在抗菌应用上潜力更大[9]．由甘草组成的经典名方玉红膏，其治疗烫伤的主要有效成分为甘草酸（Glycyrrhizic Acid, GA）[10]．且甘草酸对于烫伤所致的肝损害亦有保护作用．

课题组前期制备出专利制剂――共载姜黄素和甘草酸的微米介孔硅（μm-sized mesoporous silica,μmS）Cur+GA@μmS[11]．微米介孔硅是指具有介孔（2∼50 nm）孔径的商用胶体二氧化硅（silica），是一种粒径为微米的、具有巨大比表面积和三维孔道结构的常见药用辅料[12]，毒性低、价格低廉[13]，常作为片剂中的流动剂．微米介孔硅的商品有很多，当选用其中的AeroperlⓇ300 Pharm作为载体承载姜黄素和甘草酸得到Cur+GA@μmS，前期实验发现其具有如下理化性质[14]：经扫描电镜观察，其结构仍保持载药前的球型，粒径约为50 μm；在室温下放置12个月后，经X射线衍射检测发现其仍能保持无定型态；同超纯水混合后，经流变仪检测，其流变性质符合假塑性，黏度介于甘油和蜂蜜之间，适合涂抹到皮肤上．

本研究拟将上述Cur+GA@μmS应用在小鼠深Ⅱ度烫伤感染模型创面处，联合蓝光照射，通过体重、创面愈合率、组织学评价、创面处的血管内皮生长因子VEGF和肝脏中的炎症因子白介素IL-1β来评估Cur+GA@μmS作为烫伤敷料的愈合效果．通过细菌琼脂平板实验来揭示Cur+GA@μmS对烫伤的愈合能力与对抑菌性能之间的关系．通过检测加入活性氧检测剂的Cur+GA@μmS经蓝光照射后，在410 nm处的吸光度变化来探究抑菌的原因．该项目的完成将为一种新型烫伤修复敷料的临床应用提供前期数据，为广大烫伤患者提供另一种性价比高的选择．

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 药品与试剂

微米介孔硅AeroperlⓇ300 Pharm，德国Evonik Industries AG；磷酸盐缓冲液（PBS，pH 5.4，0.01 mol/L，批号：20220930），厦门江标检测科技有限公司；姜黄素（纯度≥98%，批号：D9053003），上海历鼎生物技术有限公司；甘草酸（纯度≥95%，批号：P1850507），上海泰坦科技股份有限公司；无水乙醇（AR，批号：G2222283），阿拉丁试剂有限公司；1,3-二苯基异苯并呋喃（DPBF，批号：J2209318），上海阿拉丁生化科技股份有限公司；4%多聚甲醛，武汉卡诺斯科技有限公司；小鼠白介素1β酶联免疫试剂盒（批号：202211），上海臻科生物科技有限公司；小鼠血管内皮生长因子（VEGF）酶联免疫试剂盒（批号：202211），上海臻科生物科技有限公司；无菌生理盐水（批号：F23IR207894），上海源叶生物科技有限公司．

1.1.2 实验动物

SPF级C57BL/6小鼠60只，雌雄各半，体重（18±2）g，6∼8 w．购自中国上海斯莱克实验动物有限责任公司．动物实验均经莆田学院实验动物伦理委员会批准：伦审（2022）-013．

1.1.3 主要仪器设备

HTLD-4II-FF3020-NH型蓝光持续点光源，深圳市海特奈德光电科技有限公司；U-3010型紫外分光光度计（UV），日本Hitachi公司；CF15RN型台式高速冷冻离心机，日本Hitachi公司；HZQ-C型数显恒温振荡器，金坛市精达仪器制造公司；AR124CN型电子天平，常州奥豪斯仪器有限公司；DZG-6050型真空干燥箱，上海森信实验仪器有限公司；KQ-250DE型超声波清洗器，昆山超声仪器有限公司；OMNI型超纯水机，厦门锐思捷水纯化技术有限公司；KZ-III-F型低温组织研磨仪，武汉赛维尔生物科技有限公司；INFINITE F50型酶标仪，瑞士TECAN公司．

1.2 实验方法

1.2.1 制剂的制备及吸水性测试

42.58 mg姜黄素和341 mg甘草酸溶于3.41 mL二甲基亚砜（DMSO）中（Cur/DMSO=1︰88，w/w；Cur/GA=1︰8，w/w）得到药液，用注射器滴加药液于微米介孔硅AeroperlⓇ300 Pharm后即加即搅拌，确保载药均匀．于60 ℃真空干燥12 h，得制剂Cur+GA@μmS，载药量经紫外分光光度计检测计算为1.68%±0.12%[15]．分别将20 mg的载药制剂或空白载体与100 μL超纯水混合后，观察样品中水分随着时间的吸收情况．

1.2.2 烫伤模型的建立及给药

60只小鼠随机平均分为空白组、空白蓝光组、烫伤模型组、模型蓝光组、Cur+GA@μmS组、Cur+GA@μmS蓝光组、Cur原料药组、Cur原料药蓝光组、未载药μmS组、未载药μmS蓝光组．小鼠腹腔注射5%水合氯醛（0.01 mL/g）进行麻醉，背部中央2 cm×2 cm脱毛，生理盐水清洗后采用无菌纱布擦拭．用酒精灯烧热40 s的半径1 cm圆形铁片，在其背部烫出近圆形烫伤区，接触时间为10 s．背部给予相应的制剂，每天1次，连续11天，姜黄素用量为10 mg/kg．涉及到蓝光的组别，波长450 nm、光照功率为511 mW·cm-2的蓝光在给药30 min后，照射给药处3 min，照射后避光静置10 min．

1.2.3 烫伤药效学检测指标

1）体重和创面愈合率测量

第1天、第5天、第7天分别对各组烫伤创面的愈合、结痂和体重进行拍照观察和测量．游标卡尺测量各组烫伤创面长宽，根据公式（1）计算创面面积，根据公式（2）计算创面愈合率．

式中：r1为短轴半径，r2为长轴半径．

2）创面组织病理切片

第12天，处死小鼠并剪下小鼠背部皮损部位，经4%中性甲醛液固定过夜，处理好的组织用PBS（pH 7.2）清洗，洗去组织表面残存的多聚甲醛固定液，然后用乙醇组织脱水，进一步将组织浸泡在纯二甲苯中，组织变为透明状态后取出放于液体石蜡中包埋，待石蜡充分凝固即可切片．切片用苏木精-伊红（HE）染色，完成后封片，在光学显微镜下观察各组创面愈合情况．

3）创面处VEGF和肝脏中IL-1β测定

取各组小鼠背部皮肤或肝脏组织，剪成3 mm碎片，以1︰9（w/v）比例加入PBS（pH 7.4，0.01 mol/L）．分别放入3个直径为3 mm和2个直径为4 mm的研磨专用钢珠后，置于低温组织研磨机按以下参数运行：4 ℃、运行频率70 Hz、运行时间60 s、暂停时间30 s、运行次数4次．匀浆液继续放入高速冷冻离心机按照21 100×g（4 ℃）离心20 min后，收集上清液，0.45 μm滤膜过滤去除杂质后进行酶联免疫吸附实验（ELISA）．即在96孔板中依次加标准品和小鼠皮肤上清液50 μL及酶标记检测抗体100 μL；封板后置于37 ℃摇床孵育60 min；甩干后迅速加入250 μL洗涤液静置30 s，重复如上操作5次并拍干板；在避光处依次加入50 μL显色剂A和50 μL显色剂B十字型震荡，静置15 min后加入终止液．立即通过酶标仪在450 nm波长处测量OD值．

1.2.4 制剂抗菌效果与机制研究

1）在体抗菌效果评价

烫伤模型小鼠处死前，用无菌生理盐水1 mL冲洗烫伤创口，重复3次，收集3 mL冲洗液，于生物安全柜操作台中取出10 μL接种于琼脂平板，置于37 ℃恒温箱内培养24 h．随后肉眼观察菌落分布情况．

2）蓝光照射下制剂对活性氧检测试剂吸光度变化的测定

在滴加一滴DMSO于待测制剂后，加入同超纯水pH接近的PBS（pH 5.4）溶液，使其中姜黄素浓度为10 μg/mL．置于超滤离心管中（MW 1K），25 ℃、14 000×g离心15 min后取滤液，从中精密量取2 mL与等体积的0.064 mmol的DPBF混合，立即倒入直径为1 cm的小烧杯，用光照功率大约为100 mW·cm-2的450 nm蓝光照射90 s后立即置于DPBF的最大吸收波长410 nm处测定吸光度A．根据公式（3），计算吸光度降低率，用来推测各制剂在蓝光照射下的活性氧产生情况．

式中：A0为空白介质与DPBF混合后的吸光度．

2 结果与分析

2.1 制剂吸水性测试

如图1所示，未载药μmS和Cur+GA@μmS分别与水混合后，在60 min内可吸收一半的水分，暗示该制剂作为敷料能吸收烫伤创面的渗出液、促进创面愈合[16]．

2.2 各组给药后创面及体重变化

各给药组涂于烫伤创面连续11天后的愈合情况如图2所示．建模第1天，各组均出现水泡及红肿现象．第5天全部测试组出现痂皮．第11天，烫伤模型组痂皮脱落，可见脓肿，暗示细菌感染；其它各组脓肿消失，说明给药各组具有一定抗菌作用；但只有Cur+GA@μmS蓝光组的创面愈合率和模型组有显著性差异（图3A）．给药各组对于体重的变化，只有空白组和空白蓝光组的体重呈增加趋势，其它各组均呈下降趋势（图3B）．蓝光照射虽能帮助对应组增加体重，但只有Cur+GA@μmS蓝光组和Cur+GA@μmS组之间有显著性差异（P<0.05）．原料药及单纯未载药载体组是否照射蓝光对体重影响不大（P>0.05）．

图3 各组小鼠烫伤创面愈合率和体重变化

2.3 创面病理变化

烫伤会带来蛋白质变性和凝固，毛细血管通透性增加诱发水肿．如图4所示，烫伤模型组表皮损伤严重、结构不清晰、真皮全层胶原呈嗜酸性均质化改变[17]，真皮网状层深部胶原纤维增生[18]、胶原蛋白空泡变形、纤维排列紊乱[19]、大量炎症细胞浸润，证实了通过本研究方法能获得深Ⅱ度烫伤．而Cur+GA@μmS蓝光组显著减少了胶原蛋白空泡变形和炎症细胞浸润，恢复了表皮和真皮胶原纤维结构，说明该组已经重建功能化皮肤．且Cur+GA@μmS蓝光组相比Cur+GA@μmS组，表皮层厚度明显较低，说明蓝光促进了愈合过程，较早出现成熟的、较薄的上皮结构[1]．其余组别上皮组织恢复慢、炎症细胞残留多、真皮纤维排列松散．各组照射蓝光后恢复效果更好，很可能是因为姜黄素在蓝光照射下具有杀菌作用，使得烫伤后皮肤易感染的金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌等定植减少，利于恢复皮肤结构．该推测通过在体抗菌检测进行验证．

图4 HE染色观察小鼠创面组织病理变化（200×）

2.4 创面处VEGF和肝脏中IL-1β测试

如图5A所示，Cur+GA@μmS组在蓝光照射下同空白组有显著性差异（P<0.05），但同模型组的VEGF无显著性差异（P>0.05），可能是因为尚处于愈合前期，这和其它报道姜黄素制剂对烫伤创面处VEGF的影响一致[17]．

图5 各组制剂对烫伤创面VEGF和肝脏IL-1β的影响

如图5B所示，Cur+GA@μmS蓝光组、Cur原料药蓝光组、空白组相比烫伤模型组均有显著性降低（P<0.05），而Cur+GA@μmS蓝光组的IL-1β含量又低于Cur+GA@μmS组、Cur原料药蓝光组和Cur原料药组（P<0.05）．因此，Cur+GA@μmS蓝光组被认为是加速烫伤创面愈合最显著的一组，该推论也和上述伤口愈合率及病理切片结果一致．

2.5 在体抗菌效果评价

烫伤创面受到细菌感染后，会导致创面加深、愈合延迟，甚至威胁患者生命[16]．金黄色葡萄球菌作为烫伤创面较为常见的致病菌[10]，被本研究用于评价各制剂的在体抗菌效果．图6证实在体条件下，Cur+GA@μmS蓝光能有效杀菌．可能是因为姜黄素在蓝光照射下能产生活性氧，进而对金黄色葡萄球菌产生杀菌作用[9]．而抑制细菌毒素可促进创面愈合[10]，这和伤口愈合率及病理切片结果一致．令人意外的是，未载药的μmS对细菌也有一定抑制作用，为了验证这是否也和活性氧有关，本研究进行了体外活性氧产生量的测定．

图6 各组制剂的在体抗菌平板图

2.6 蓝光照射下制剂对活性氧检测试剂吸光度变化的测定

本研究利用DPBF可捕获活性氧[20]进而降低吸光度的原理[21]来推测各制剂产生活性氧的能力．如图7所示，和其它检测制剂相比，姜黄素原料药（Cur RDP）在同等量蓝光照射后，对DPBF的吸光度降低率最低（P<0.05），说明姜黄素仅以原料药状态存在时，活性氧的产生率最低．当Cur RDP和甘草酸物理混合后，吸光度降低率几乎未增加．但当姜黄素载入μmS后，无论是否有甘草酸的参与，载药制剂的吸光度降低率相比原料药均显著增加（P<0.05），说明载入μmS后活性氧产生能力大大增强，这可能是因为μmS表面和内部有大量硅醇基所致[22]．

图7 各组制剂的吸光度降低率

3 分析与讨论

毛细血管的重构是烫伤皮肤组织进行修复的关键环节，它的新生情况可通过血管内皮生长因子VEGF来表示．VEGF的增加可加速肉芽组织的形成，促进烫伤创面中晚期的愈合[19]，暗示皮肤修复的速度和质量[23]．烫伤后机体出现应激反应，大量分泌白介素IL-1β[10]，会引发后续的多器官功能不全综合症和全身炎症反应综合症．本研究中，姜黄素和甘草酸载入微米介孔硅后，对VEGF的促进作用和对IL-1β的降低作用均不够明显，即自身促进伤口愈合效果并未与模型组自身恢复有显著性差异，但是当照射蓝光后，出现显著性优势．且微米介孔硅便宜易得，表面自带硅醇基，具有吸湿效果，适合应用在烫伤创面吸收渗出液．

4 结论

本研究以敷料对水的吸收程度，烫伤后各组小鼠创面愈合率、体重差、病理切片、创面处金黄色葡萄球菌生长情况和VEGF含量、肝脏中的IL-1β含量为评价指标，检测共载姜黄素和甘草酸的微米介孔硅作为烫伤敷料的潜力．经实验验证，该敷料具有一定吸水性能，符合烫伤敷料能吸收渗出液的要求；在蓝光照射下能增加创面愈合率、有效杀菌、增强VEGF表达、降低肝脏中IL-1β表达，即使在维持体重方面和空白组具有一定差异，但蓝光照射在其中已起到一定积极作用．因此，共载姜黄素和甘草酸的微米介孔硅在蓝光协助下将是具有临床应用潜力的烫伤创面敷料．