1型糖尿病患者的B细胞及B细胞亚群中程序性死亡受体配体1的表达

李思诚, 郭鹤鸣, 黄 韵, 刘翠平, 方 晨, 胡 吉

(1. 苏州大学附属第二医院 内分泌科, 江苏 苏州, 215004;2. 苏州大学附属第一医院江苏省临床免疫学研究所/江苏省临床免疫学重点实验室, 江苏 苏州, 215006)

1型糖尿病(T1DM)的特征是胰岛β细胞的自身免疫破坏,导致胰岛素缺乏和终身外源性胰岛素依赖[1]。研究[2]表明, B细胞在自身免疫性糖尿病中发挥着不可替代的作用。B细胞消耗性抗体利妥昔单抗可延迟近期发病患者的T1DM进展。程序性死亡受体配体1(PD-L1)被认为是调节性B细胞的重要特征,其可通过与程序性死亡受体-1(PD-1)的直接相互作用调节免疫应答[3]。研究[4]表明, PD-L1阻断加速了非肥胖糖尿病(NOD)小鼠的糖尿病发病,提示PD-L1在T1DM中具有关键的保护作用。本课题组既往研究[5]发现,T1DM患者血清中的可溶性PD-L1水平降低。虽然B细胞的自身抗原递呈被认为可以启动自身免疫,但目前尚不清楚B细胞上的PD-L1是否参与了T1DM的发生。相关研究[6]表明,自身免疫性糖尿病患者循环中B细胞的频率发生了改变。本研究深入探讨这些B细胞,以期能更好地了解T1DM患者循环B细胞中PD-L1的表达。

1 资料与方法

1.1 样本收集

本研究收集了2023年在苏州大学附属第二医院内分泌科就诊的患者血样。T1DM的诊断标准参照参考文献[7]。患者来自T1DM的各个阶段(T1DM组,n=25)。选取年龄、性别与T1DM患者相匹配的健康人群(健康对照组,n=25)。此外,健康人群自述健康,并经口服葡萄糖耐量试验(OGTT)证实无糖尿病,所有糖尿病自身抗体阴性,同时除外炎症、传染病、癌症或任何其他自身免疫性疾病。参与者知情并同意本研究。本研究已获得苏州大学附属第二医院伦理审查委员会批准。

1.2 临床指标收集

记录受试者的年龄、性别和病程等信息。检测肌酐(Cr)、尿素(BUN)、尿酸(UA)、白蛋白/肌酐(ACR)、丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)、空腹血糖(FPG)、糖化血红蛋白(HbA1c)、空腹c肽(FCP)。采用放射配体法检测胰岛自身抗体[谷氨酸脱羧酶自身抗体(GADA)、胰岛素瘤相关抗原2自身抗体(IA-2A)、锌转运蛋白8自身抗体(ZnT8A) ]。

1.3 流式细胞术

通过静脉穿刺收集受试者4 mL外周血样本,采集的真空管中含有EDTA抗凝。在50 μL全血中加入异硫氰酸荧光素(FITC)、藻红蛋白(PE)、降钙素原(PCT)和藻蓝蛋白(APC)标记的抗人单抗,并以相应荧光标记的IgG1或IgG2作为同型对照。具体标色方案为: ① CD19-PE,PD-L1-FITC; ② CD19-PE,CD27-APC,PD-L1-FITC; ③ CD19-PE, CD5-APC, CD1d-PCT,PD-L1-FITC; ④ CD19-PE,CD21-APC, CD23-PCT, PD-L1-FITC。在室温避光孵育30 min后,用Beckman Coulter OptiLyse C裂解液进行红细胞溶解和细胞固定。磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤2次后,取细胞悬液(500 μL/次),用COULTER Epics XL流式细胞仪(Beckman COULTER)检测。

1.4 统计学分析

2 结 果

2.1 2组B细胞和B细胞亚群表达

采用流式细胞术检测外周血CD19+细胞(B细胞)。T1DM组和健康对照组的B细胞频数比较,差异无统计学意义(P=0.08)。流式细胞术在外周血样本中识别出6个主要的CD19+B细胞亚群: 幼稚B细胞(CD19+CD27+)、记忆B细胞(CD19+CD27+)、B10 (CD19+CD5+CD1d+)、边缘区B细胞(MZB)(CD19+CD23-CD21+)、滤泡B细胞(FoB)(CD19+CD23+CD21-)和过渡性T2-边缘区前体B细胞 (T2-MZP)(CD19+CD23+CD21+) 。T1DM组和健康对照组的B细胞亚群频率比较,差异无统计学意义(P>0.05)。在T1DM患者中,B细胞亚群的频率无系统性差异。见图1。

A: B细胞; B: 记忆B细胞; C: 幼稚B细胞; D: B10细胞; E: MZB细胞; F: FoB细胞; G: T2-MZP细胞。

2.2 B细胞亚群上PD-L1的表达

与健康对照组的(14.06±5.72)相比, T1DM组CD19+细胞上PD-L1的表达频率为(6.51±3.92), 差异有统计学意义(P<0.05)。T1DM组患者CD19+CD27+细胞上PD-L1表达为(13.43±10.45), CD19+CD27-细胞上PD-L1表达为(11.17±7.69); 健康对照组CD19+CD27+细胞上PD-L1表达为(23.57±9.81), CD19+CD27-细胞上PD-L1表达为(15.59±6.14)。T1DM组CD19+CD27+细胞、CD19+CD27-细胞上PD-L1的表达频率低于健康对照组,差异有统计学意义(P<0.05), 见图2、图3。2组PD-L1在B10[T1DM组为(18.15±8.48), 健康对照组为(23.44±17.75),P=0.19]、MZB[T1DM组为(19.71±12.89), 健康对照组为(21.22±8.04),P=0.62]和FoB[T1DM组为(41.50±24.15), 健康对照组为(41.77±23.08),P=0.97]细胞上的频率比较,差异无统计学意义。T1DM组PD-L1在T2-MZP细胞中表达频率(35.48±18.17)低于健康对照组(44.92±14.62), 差异有统计学意义(P=0.048 6), 见图4、图5。

A: CD19+CD27+和CD19+CD27-细胞中PD-L1表达的门控策略; B: T1DM组与健康对照组CD19+ CD27+细胞上PD-L1的表达比较; C: T1DM组与健康对照组PD-L1在CD19+ CD27-细胞上的表达比较。

A: CD19+CD5+CD1D+细胞中PD-L1表达的门控策略; B: T1DM组与健康对照组 CD19+CD5+CD1D+细胞上PD-L1的表达比较。每个点代表个体PD-L1的比例。水平线表示平均值。

2.3 临床特征与B细胞亚群PD-L1的相关性

T1DM患者的临床特征见表1。MZB细胞表面PD-L1表达与BUN呈正相关(P<0.01); FoB细胞表面PD-L1表达与LDL水平呈负相关(P=0.016), 与HDL水平无相关性(P=0.268), 见表2。

表1 T1DM患者临床特征

表2 B细胞亚群PD-L1水平与临床特征之间的相关性

3 讨 论

B细胞通过体液免疫直接发挥作用,并作为关键抗原提呈细胞在T细胞介导的自身免疫性糖尿病的启动过程中发挥作用[8]。研究[9]发现, T1DM患者的胰岛功能和血糖水平与B细胞亚群相关。自身免疫性糖尿病与抗PD-1/PD-L1抗体治疗有关,研究[10-11]表明T1DM患者CD4+T细胞中PD-1的表达显著降低,表明PD-1/PD-L1通路在T1DM中对破坏β细胞起关键作用。本研究旨在探讨T1DM患者外周血中不同B细胞亚群上PD-L1的表达情况。本研究的主要发现为T1DM患者外周血B细胞,尤其是T2-MZP B细胞和记忆B细胞上PD-L1的表达水平降低。

B细胞在T1DM发生发展中的重要性已经在NOD小鼠中得到证实,缺乏B细胞的NOD小鼠不会发生T1DM[12]。同样,通过抗CD20单克隆抗体选择性消耗B细胞,可防止糖尿病的发生[2]。提示B细胞在T1DM的发生发展中有重要作用。B细胞亚群在免疫调节方面也发挥了重要作用,调节性B细胞通过白细胞介素-10 (IL-10)依赖的方式调节T细胞应答,在炎症、感染和自身免疫性疾病中发挥调节功能[13]。MZB细胞和FoB细胞作为重要的抗原递呈细胞,尤其是抗原特异性抗原递呈细胞,能够有效激活并促进CD4+T细胞增殖[14]。自身抗原通过Toll样受体(TLR)激活B细胞,通过FasL诱导致病性T细胞凋亡,并通过分泌TGF-β抑制抗原递呈细胞的功能来破坏免疫耐受。本研究发现, CD19+B细胞频率在T1DM组和健康对照组中无显著差异,这与既往研究结果相一致。本研究中, B细胞亚群频率在T1DM组和健康对照组中无显著差异。有研究[9]表明,与健康对照组和2型糖尿病(T2DM)患者相比, T1DM或LADA患者MZB细胞百分比增加,FoB细胞百分比降低。研究人群数量不足可能是导致这种差异的原因。

本研究还关注了B细胞上PD-L1的表达。PD-1/PD-L1在T细胞上的研究较多,在B细胞上的研究较少,但已知PD-1及其配体PD-L1可参与调节B细胞功能[15]。一项研究[16]表明, Treg上PD-1上调需要B细胞上PD-L1的表达,即B细胞通过PD-L1向Treg提供激活信号,从而抑制免疫应答。同时, B细胞可通过上调PD-L1的表达,抑制自身免疫病中的炎症反应,高表达PD-L1的B细胞通过减弱T细胞的活化和抗体的产生[17]而显著抑制体液反应。相反,缺乏PD-L1可能向T细胞提供抑制信号,导致免疫应答的激活。本研究发现, T1DM患者CD19+B细胞上PD-L1的表达低于健康对照组,提示PD-L1的表达减低,导致对免疫应答的抑制减弱,进而导致了T1DM的发生。除总B细胞(CD19+)外,本研究还评估了B细胞亚群上PD-L1的表达。研究发现,与健康对照组相比,初始B细胞上的PD-L1表达无差异,但记忆性B细胞上的PD-L1表达较低。已有研究[18]表明,记忆性B细胞比初始B细胞反应更快、更剧烈。首先,记忆性B细胞比初始B细胞被更早招募进入分裂,经历更多的分裂轮数;其次,记忆B细胞具有更多细胞表面受体,如CD21、CD27和TACI, 这使得记忆B细胞能够更快、更迅速地对共刺激信号做出反应[19-20]; 再次,记忆性B细胞表达高水平的CD80和CD86, 这有助于向辅助性T细胞寻求帮助。因此提出以下假设: 由于PD-L1的表达水平减低,使记忆B细胞在T1DM的发病机制中发挥了更强的作用。

研究[21]表明,产生IL-10的B细胞(Breg)在T1DM的启动中发挥着不可或缺的作用。相关研究[22-23]在胶原诱导的关节炎小鼠模型中,发现分泌IL-10的B细胞表型为CD21+CD23+。Breg细胞可以通过增加PD-L1的表达来抑制自身免疫病中的炎症反应[17]。因此, Breg细胞上PD-L1表达的降低可能促进自身免疫性糖尿病的炎症反应。本研究纳入的B细胞亚群中,只有T2-MZP上的PD-L1表达降低。这表明抑制T1DM中炎症的Breg可能是T2-MZP。探究B细胞亚群PD-L1水平与临床特征之间的相关性时,发现PD-L1在FoB细胞上的表达与LDL呈负相关,与既往研究[24]中血糖、血脂与免疫细胞相关的结果一致。

综上所述, T1DM患者B细胞表面PD-L1的表达频率较健康对照组低。PD-L1可能在T1DM的发病中起保护作用。PD-L1高表达的B细胞可能为自身免疫性糖尿病的治疗提供新的有效策略。但本研究存在一定局限,本研究未检测到IL-10和TGFb等炎性细胞因子,因此无法直接探讨PD-L1对B细胞功能的影响,还需进一步深入研究。