宏基因组二代测序在器官移植后肺部感染中的应用进展

董志兰 周开华

肺部感染是一种发病率及死亡率均较高的疾病,而实体器官移植(solid organ transplantation,SOT)受者由于手术应激、长期口服免疫抑制剂等危险因素的存在,术后极易发生肺部感染,且一旦发生,病情进展迅速,病死率高[1]。移植受者免疫力低下,容易发生机会性感染、混合感染及罕见细菌感染,可急剧加重病情并导致不良后果,因此快速、准确的微生物学诊断对于早期治疗、改善预后极其重要。常规的病原体检测方法包括肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)培养、血培养、痰培养及涂片、抗原抗体检测、病毒核酸检测等,而这些方法的灵敏度、特异度不能满足临床需求。随着技术的发展,宏基因组二代测序(metagenomic next-generation sequencing,mNGS)作为一种新型检测技术,越来越多地应用于感染性疾病的诊治,尤其适用于复杂、罕见、新型和非典型病原体的检测[2],特别是对于某些RNA病毒,mNGS可能是唯一可行的检测方法[3]。本文将对mNGS在实体器官移植后肺部感染诊治方面的应用情况、研究进展,以及面临的挑战进行综述。

一、器官移植术后肺部感染现状

上个世纪60年代开始的实体器官移植,在提高生活质量的前提下延长寿命,现仍然是许多终末期器官疾病患者的重要治疗选择[4]。随着外科技术的不断提高,由手术引起的相关并发症明显减少,但供体本身携带致病菌、长期服用免疫抑制剂及受者自身疾病较多等因素使感染率大大增加。即使采用各种预防和治疗措施,感染仍然是SOT受者发病和死亡的主要原因[5],而肺脏是各种并发症最容易发生的部位[6],极易进展为重症肺炎,甚至引起多器官功能不全。器官移植受者免疫功能低下,可能会出现特殊病原体甚至是罕见致病菌感染,具有常见病原体的非典型性表现,并且更容易合并混合感染。这类感染的评估是耗时的,也是资源密集型的,需要大量的微生物诊断试验来确定病原体或排除感染。而传统病原体检测的检出率低,培养耗时长,根据临床相关研究,高达60%的感染性疾病的病原体仍然未知[7],这给临床医师带来了巨大的挑战。

二、mNGS技术概述

mNGS作为一种新型的高通量检测技术,可广泛分析临床样品的微生物组,具有标本检测直接、病原体覆盖广等优点。2014年有研究报告了1例14岁病因不明的病例,病程中反复发热、抽搐,且伴有脑积水,通过mNGS检测出钩端螺旋体病,经过精准治疗后得到改善,为mNGS在临床的广泛应用奠定了基础[8]。mNGS对常见病原体的检出率高,同时在罕见或未知病原体检测方面也具有一定优势,现已成为病因诊断中常用且有效的诊断方法[9-11]。随着检测技术的不断提高,mNGS可用于筛选致病菌的耐药突变信息,协助合理选择抗生素,指导临床精准治疗[12]。

三、mNGS在器官移植后肺部感染中的应用进展

1 细菌感染

细菌是SOT后肺部感染的常见病原体之一,SOT术后早期感染为医院获得性肺炎,常见病原体主要是肠杆菌属,尤其是不动杆菌属、铜绿假单胞菌、厌氧菌;在SOT后一年以上的肺部感染多为社区获得性肺炎,流感嗜血杆菌、机会性病原体感染。对于细菌常规的病原体检测方法是涂片和培养,需要较长时间才能获得结果,且培养需要特定的条件,覆盖的病原体范围有限,罕见菌检出阳性率低。SOT患者属于免疫力低下人群,肺部感染时病原体复杂多样,进展迅猛,极易造成进行性缺氧、急性呼吸衰竭,因此快速识别病原体是治疗成功的关键。Lian等[13]的研究显示,mNGS在早期肺移植患者中的检出率高于常规微生物检测(88.24%vs76.47%)。Ju等[14]的一项回顾性研究表明,mNGS检测显示肺移植后肺部感染最常见的病原体是细菌,并且能在较短的时间内识别病原菌,为肺部感染的诊断提供更准确、及时的信息。Parize[15]报道了一项使用mNGS检测免疫缺陷患者样本的多中心前瞻性研究,结果显示mNGS的检出率(36%vs11%)和阴性预测值均高于常规培养。Li等[16]在免疫力低下患者中比较了mNGS和常规检测,结果显示mNGS对细菌感染(92.9%vs50%)和合并感染(68.8%vs48.3%)的敏感度要高得多。Huang等[17]对137例免疫力低下患者进行了回顾性研究,结果显示mNGS识别肺部感染病原菌显著高于传统检测方法(89%vs25.73%)。结核分枝杆菌是一种特殊的细菌,范琳教授团队对纳入的205例疑似结核病患者进行了回顾性分析,比较了mNGS与其他诊断方法(抗酸染色涂片、培养、X-pert)对结核病的诊断价值,结果显示mNGS诊断肺结核的敏感度高于培养法(59%vs26%)和涂片法(59%vs15%),但与Xpert(59%vs52%)无显著差异[18]。有研究探讨了BALF-mNGS对肺结核的诊断价值,研究结果显示BALF-mNGS的敏感度显著高于BALF涂片法和BALF培养法。TB-DNA和Xpert检测在肺结核诊断中起着重要作用,但对于免疫力低下人群的肺结核多为混合感染,诊断困难且病情进展较快,mNGS作为一种新型检测手段,在肺结核的诊断中具有其独特优势。

2 病毒感染

SOT受者免疫力低下,一些潜在的病毒易发生机会性感染,同时病毒易发生变异,临床表现多样,诊治困难,而常规检测方法的病毒培养、核酸检测都是基于已知病原体,对特殊及未知的病毒都难以检出。而mNGS可获得完整的基因组序列,不仅可检测各种病毒,同时还能监测病毒变异。一项回顾性研究纳入了32例免疫功能低下患者和21例免疫功能正常的肺炎患者,同时接受mNGS和常规检测,结果提示,在免疫功能低下患者中最常见的病原体为巨细胞病毒(cytomegalovirus,CMV),而EB病毒、呼吸道合胞病毒和肠道病毒也较为常见[19]。CMV感染后可直接导致CMV综合征或终末器官病变,也可影响免疫系统功能,增加被其他病原体和病毒感染的风险,有研究表明免疫力低下患者更多的是混合感染,细菌-真菌-病毒感染是免疫功能低下患者中最常见的组合感染[20]。Peng[21]报道了60例严重免疫缺陷患者疑似肺炎,并分析了mNGS与常规检测对肺炎的诊断疗效,最后得出结论,mNGS对肺部的病毒感染比常规检测更有效。Lewandowska[22]收集了不明病原体肺移植患者的呼吸样本进行重新分析,并且对mNGS检测出的病原菌进行PCR验证,mNGS在4例肺移植患者中检测到病毒感染,而多重PCR检测均为阴性,凸显了mNGS在多项临床检测均为阴性的免疫功能低下患者的病原体检测中具有优势。一例关于肺移植术后感染的报道显示,由于人鼻病毒与人肠道病毒序列同源性高,且缺乏特异性引物,多重PCR结果显示人鼻病毒感染,而mNGS准确鉴定为人肠道病毒C104感染,显示了mNGS的无偏倚优势和识别罕见病毒株的能力[23]。Ren等[24]报道新型冠状病毒(2019 novel coronavirus,2019-nCoV)的发现经过,在5例重症肺炎患者的mNGS检测中均发现未知β-CoV,其核酸相似度为99.9%,根据基因测序确认为2019-nCoV。mNGS可快速识别病原体,为疫情防控和监测起到了重要的作用。新冠病毒肺炎(corona virus disease 2019,COVID-19)已升级为全球大流行,如果感染者的免疫功能正常,病毒一般可以自行消除;而SOT受者免疫功能低下,一般不能及时清除病毒,一旦合并感染时可能导致重症肺炎甚至会引起死亡。因此,mNGS在SOT受者病毒感染的诊断中也具有广阔前景。

3 真菌感染

真菌感染具有危害性强、无典型临床表现的特点,且诊断方法缺乏特异性,导致肺部发生真菌感染时难以诊断,漏诊率较高,而SOT受者属于免疫抑制个体,发生侵袭性真菌感染(invasive fungal infections,IFIs)的风险更高[25],早期准确检出病原菌对于改善预后十分重要。传统的真菌诊断依赖于组织染色、体外培养、血清学检测,这些方法不灵敏且耗时,且大多数抗原抗体检测缺乏敏感度和特异度;在免疫功能低下的患者中,IFIs的诊断更困难,此类患者症状更为隐蔽,而且免疫反应被抑制后,血清学检测敏感度降低,故而传统方法只能识别相对狭窄的真菌类别,费时且容易漏检,同时也导致了经验广谱抗菌药物的滥用。mNGS依赖于对样本中已经存在的DNA进行测序,可以在短时间内完成,相关研究显示mNGS比常规检测到更多的真菌种类,具有更高的敏感度和特异度,在免疫力低下患者中,曲霉菌和耶氏肺孢子菌是最常见的真菌[26]。Lu等[27]探讨了mNGS在耶氏肺孢子菌诊断中的应用价值,发现mNGS的灵敏度和检测速度均优于传统检测方法。根据一项针对HIV阴性免疫功能低下患者的研究,BALF-mNGS诊断肺孢子菌的敏感度和特异度分别为97.40%和85.12%,明显高于BALF镜检和血清G试验,且平均检测时间也明显短于常规方法[28]。Lin对69例疑似肺炎的免疫功能低下患者进行了回顾性分析,结果显示mNGS对真菌检测的诊断准确率高于常规检测(78%vs57%),在亚组分子中更显示了mNGS对肺孢子菌肺炎患者具有较高的敏感度(100%vs28%)[19]。Zhan等将62例mNGS曲霉菌阳性患者分为两组,免疫功能低下患者侵袭性肺曲霉菌病诊断的符合率明显高于非免疫功能低下患者[29]。综上所述,mNGS在鉴定真菌特别是在非典型真菌类群方面也具有较好的检测效能。

4 其他病原体感染

SOT受者长期服用免疫抑制剂,易出现各种机会性感染,Ramirez等[30]研究显示,免疫功能正常组发生诺卡菌、非结核分枝杆菌(non-tuberculous mycobacteria,NTM)感染概率明显低于免疫功能低下组。诺卡菌是一种罕见的机会性感染,主要影响肺部,它还可能导致其他器官的感染。Luu等[31]报道了1例影像学提示肺部多部位病变,通过血液mNGS检出诺卡菌感染,与肺活检病理结果一致,mNGS可以无创、及时地识别病原菌,有助于诺卡菌的临床诊断和治疗。NTM的发生可能与肺部基础疾病、器官移植后使用的免疫抑制剂有一定相关性,随着科技的进步,器官移植以及免疫抑制剂应用越来越多,NTM患病率不断升高,mNGS是菌种鉴定分辨率最高的手段,在NTM疾病的诊断中发挥着重要的作用。军团菌肺炎也是一种罕见的肺部感染,病死率很高,宿主对军团菌的主要防御机制是细胞免疫。随着免疫治疗的兴起,免疫抑制药物对军团菌肺炎发病率的影响不容忽视[32]。mNGS技术可以在识别军团菌感染的同时还能对合并感染病原体进行鉴定,特别是对易合并多种病原体感染的免疫抑制患者的抗感染治疗具有关键的指导作用[33]。Wang等[34]研究了mNGS在混合型肺部感染中的应用,结果显示mNGS的敏感度远高于常规检测(97.2%vs13.9%),且可以检测到范围更广的病原体种类。器官移植患者肺部感染的病原体是复杂多样的,与传统培养方法相比,mNGS在检测特殊病原体、新发病原体、复杂混合感染病原体方面更具优势,有助于临床诊治。

四、存在的问题与挑战

mNGS技术理论上能够无偏倚地检测各种微生物,但在临床实际应用于肺部感染的诊断中还存在一些问题。(1)背景核酸干扰:mNGS检测利用鸟枪测序原理,检测到的读数大多来自人类宿主,因此限制了病原体检测的整体敏感度,难以区分定植菌和致病菌。(2)污染:mNGS的步骤多,影响因素也就随之增多,在样品采集、运输、处理、上机测序等各个环节都容易受试剂、容器、环境的微生物核酸污染[35]。(3)缺乏统一标准:病原体检测没有统一的阈值,不同的测序平台使用不同的数据库,研发、实验和解释方面的专家也不尽相同,最终的结果由于缺乏统一的标准会有所不同。(4)存在假阳性、假阴性:由于大多数RNA病原体容易降解,运输和保存不当可能导致假阴性结果。mNGS检测可以获得几乎所有的病原体信息,但有些病原体不致病,这增加了假阳性率,因此检测结果应由临床医生和微生物学家结合患者临床表现和其他微生物检测进行判定。(5)测序成本高:mNGS价格昂贵,临床可及性有待提高,重复性低;临床医生应根据患者具体情况评估是否应用mNGS检测。(6)病原体基因组数据库不完善:mNGS检测结果需要与已建立的微生物基因组数据库进行对比,但目前没有统一、全面、准确的参考数据库,可能会遗漏罕见病原体。(7)细胞内细菌和部分真菌检出率较低:对于一些细胞壁比较厚的病原(如结核杆菌、军团菌、布鲁氏菌、真菌等),常规核酸提取方法效能低,需要采用一些特殊的破壁方法,否则会存在漏检。(8)耐药基因检出率低:mNGS阅读核酸序列相对较短,不容易获得耐药基因的全长序列,且耐药基因之间存在一致性,因此存在无法检测耐药基因、无法提供病原体药敏结果等问题。

五、小结与展望

器官移植后肺部感染的患者免疫功能低下,为了缩短经验治疗时间,改善预后,应尽早送检mNGS以发现复杂、罕见条件致病菌,同时注意检测结果必须结合常规检测结果、临床表现、影像学特点等加以甄别,不能盲目全覆盖。新型病原体靶向测序技术(targeted next-generation sequencing, tNGS)的出现,不依赖传统微生物培养,直接扩增临床样品中的核酸,接着进行高通量测序,再与参考数据库进行比对分析,具有病原谱范围准确,测序成本经济低的优点。相信随着检测技术的不断完善和发展,mNGS的测序成本将会降低,对于耐药基因能准确识别,并形成统一的判断标准,必将为急危重症和疑难感染患者提供准确的病原体诊断依据,协助临床医生的诊疗,从而提高治愈率、减少重症率、降低死亡率,挽救更多患者的生命。