嗜酸性粒细胞胞外陷阱与支气管哮喘

张玉 朱振刚

支气管哮喘是一种慢性肺部疾病,由血浆外渗和炎性细胞(如嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、淋巴细胞、巨噬细胞和肥大细胞)内流引起的慢性气道炎症所致,支气管哮喘通常被定义为可逆性气道阻塞,但它可以演变为不可逆的肺功能损害[1-2]。根据涉及的主要免疫-炎症途径,哮喘可分为Th2相关性哮喘、非Th2相关性哮喘和混合型。据报道,嗜酸性粒细胞浸润肺粘膜和间质与2型免疫反应导致的哮喘的严重程度密切相关[3-4]。其中,Th2相关性哮喘的典型特征是气道嗜酸性粒细胞计数升高,非Th2相关性哮喘的典型特征是气道嗜酸性粒细胞计数正常,但气道中性粒细胞计数升高[5]。目前人们对哮喘的分子和细胞机制已经有了较好的认识,但仍尚未完全了解。嗜酸粒细胞胞外陷阱(eosinophil extracellular trap,EET),由活化的嗜酸性粒细胞释放DNA纤维以及颗粒蛋白组成,并在宿主的防御中发挥效应功能,促进炎症和/或有效消除病原体[6-7]。有实验表明,所有哮喘患者的肺泡灌洗液(broncho alveolar lavage fluid,BALF)中均观察到了EET,并且其数量与嗜酸性粒细胞相关[8]。那么究竟EET能否成为哮喘治疗新的靶点,本文就嗜酸性粒细胞胞外陷阱与哮喘的关系进行综述。

一、嗜酸性粒细胞胞外陷阱(EET)

1 嗜酸性粒细胞以及EET

科学家将嗜酸性粒细胞最早描述为炎症渗出液中的“颗粒细胞”,而“嗜酸性粒细胞”这个名称则首次见于名为《关于血液的特定颗粒》的论文中。人类嗜酸性粒细胞是骨髓来源的白细胞,具有特异性的形态学特征,包括双叶核和充满细胞毒性和免疫调节蛋白的细胞质颗粒,他们在骨髓中发育并可释放到外周血和相应的组织中,嗜酸性粒细胞通常只占外周血白细胞的1%至3%[9-10]。

嗜酸性粒细胞通过三种主要机制(包括胞吐、细胞溶解和碎片脱颗粒)对不同刺激作出反应而脱颗粒。最近,除了脱颗粒外,嗜酸性粒细胞释放细胞外DNA陷阱(EET释放)的过程被描述为不同炎症条件下嗜酸性粒激活的重要机制[11]。

EET首次由Shida Yousefi等[12]报道,当嗜酸性粒细胞被激活后,会以活性氧依赖的方式释放DNA结构,DNA结构和颗粒蛋白会在胞外空间形成能够在体外和体内炎症条件下结合和杀死细菌的细胞外结构,但当其释放过多时,则具有一定的致病性。据报道,EET有两种形成方式,一种快速形成,另一种是缓慢形成。快速形成的EET由线粒体DNA网组成,含有阳离子蛋白,通常储存在嗜酸性粒细胞的细胞质次级颗粒中;缓慢形成的EET由富含组蛋白的核DNA组成,其缺乏游离阳离子蛋白[13]。

并非所有的EET都是通过细胞裂解释放的。一方面,有学者发现嗜酸性粒细胞中的EET释放涉及其双叶核的溶解,核膜的破裂,胞质成分的混合和细胞膜的破裂,因此EET最终可能以细胞死亡的方式结束[14]。但另一方面,亦有研究表明,肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavagefluid,BALF)中的嗜酸性粒细胞产生EET后却没有显示任何凋亡或坏死的迹象,均保持较高的活力,这表明DNA释放是一个活跃的过程,不引起细胞的凋亡或坏死[15]。Rodrigo-Muoz等[16]亦已经表明,嗜酸性粒细胞在面对细菌或真菌时能够排出其线粒体DNA而不会死亡。现在人们已经认识到所有EET的产生都是不同的,有些可能是从活细胞中释放出来的,有些则是从溶解(坏死)细胞中产生的。

2 影响因素

据报道,众多因素或物质会影响EET的形成,或抑制或参与EET的释放。对于抑制其形成的物质,如表面活性剂蛋白-D(SP-D),这是一种具有免疫调节作用的气道上皮细胞的产物,SP-D可以直接结合到嗜酸性粒细胞膜上,并以浓度依赖性方式抑制人和鼠嗜酸性粒细胞的细胞外DNA陷阱形成。SP-D还抑制嗜酸性粒细胞阳离子蛋白诱导的迁移、脱颗粒[17]。而参与EET形成过程的则有自噬、活性氧(ROS)、重组人脱氧核糖核酸酶(rhDNase)、溶血磷脂酰丝氨酸(LysoPS)等。其中,细胞自噬会参与EET释放及肺部炎症。Silveira等人证明,当小鼠用自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)治疗可减少气道中EET的形成,因此研究者认为3-MA治疗可以成为减少哮喘中肺部炎症、氧化应激、线粒体损伤和EETs形成的一种替代方案[18]。此外,Silveira等人还发现活性氧(ROS)是哮喘中EETs形成所必需的,当用卵清蛋白(OVA)鼻内激发之前,用两种活性氧抑制剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)或二苯碘(DPI)治疗小鼠时,发现DPI和NAC治疗可降低肺嗜酸性粒细胞过氧化物酶(EPO)以及各种促炎细胞因子,并且减少了气道中的EET释放[19]。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸盐以氧化酶依赖性方式诱导EET形成[20]。最近有实验证明,重组人脱氧核糖核酸酶(rhDNase)改善了肺功能和DNA细胞外陷阱,rhDNA酶显著降低了气道阻力,减少了EETs的形成和球状细胞增生[21]。

Kim等[22]的研究则表明溶血磷脂酰丝氨酸(LysoPS)诱导的EET与所检测的几种信号通路(如EGFR-MAPKs、PI3K、NF-γB)无关,但依赖于精氨酸脱氨酶蛋白4(PAD4);并且LysoPS以浓度依赖而不是时间依赖的方式诱导EET。除此之外,不同浓度的胸腺基质淋巴生成素(thymic stromal lymphopoietin ,TSLP)刺激纯化的血液嗜酸性粒细胞时,发现嗜酸性粒细胞以时间和浓度依赖的方式释放细胞外DNA[23]。

3 DNA的来源

对于EET释放DNA的来源一方观点认为来自于线粒体DNA,一方认为来自于核DNA。更早之前的研究认为其是线粒体来源[24],学者发现当哮喘小鼠感染呼吸道合胞病毒(RSV)时,可以在体外肺泡灌洗液中诱导EET,并且RSV以浓度依赖性方式诱导EET的释放,并且证明其释放的DNA为线粒体起源[25];近年来,多数研究学者证明大多数EET由起源于细胞核的组蛋白结合DNA组成,人类嗜酸性粒细胞含有很少的线粒体,表明可以释放的线粒体DNA很少[26]。亦有研究表明,EET-DNA含有(8.72±1.99)%的线粒体DNA,表明EET-DNA主要来源于染色体DNA[4]。半乳糖凝集素-10的帽样积累出现在嗜酸性粒细胞的核叶前,很可能是为了准备与DNA相关的半乳糖凝集素-10的喷射记录喷射的EET含有组蛋白,进一步证实EET由核而不是线粒体DNA组成[13]。而Kim等[22]人的实验发现即使在EET形成后,完整的线粒体也仅存在于细胞内部,释放的DNA中发现瓜氨酸H3,表明染色质去凝聚,线粒体DNA 不太可能存在于EET中。尽管目前研究者们已经发现了EET中DNA结构的释放可能来源于不同的结构,但嗜酸性粒细胞究竟在何种刺激下有选择的释放DNA机构,仍需要进一步的研究探索。

4 嗜酸性粒细胞陷阱与中性粒细胞陷阱

胞外陷阱包括中性粒细胞胞外陷阱、嗜酸性粒细胞胞外陷阱、嗜碱性粒细胞胞外陷阱、肥大细胞胞外陷阱、巨噬细胞胞外陷阱、单核细胞胞外陷阱以及浆细胞样树突状细胞胞外陷阱[27],目前的研究发现中,与哮喘联系较多的当属中性粒细胞胞外陷阱与嗜酸性粒细胞胞外陷阱。那么二者在形成过程中究竟有何异同呢?

Brinkmann及其同事[28]首次在中性粒细胞中描述了DNA胞外陷阱释放(neutrophil extracellular traps, NETs)现象。NET是由脱缩染色质组成的纤维网状结构,装饰有抗菌颗粒成分,包括中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)和髓过氧化物酶(MPO),在NET形成过程中,核染色质被缩聚,加载颗粒状蛋白质并最终释放到细胞外空间[29]。

NET和EET在稳定性方面具有不同的属性,与中性粒细胞相比,嗜酸性粒细胞含有更少的蛋白酶,因此嗜酸性粒细胞染色质免于内源性蛋白酶消化[30],性质较为稳定。亦有研究称,由于嗜酸性粒细胞颗粒中蛋白酶的活性较低,这些嗜酸性粒细胞DNA纤维比中性粒细胞更厚、更稳定,这表明EETs可能比NETs产生更持久的效果[31]。

在结构上,中性粒细胞DNA陷阱中DNA丝的直径为15～17nm,许多直径约为25nm的球形物质(很可能是蛋白质)与DNA结合[32],相比之下,嗜酸性粒细胞DNA陷阱主要由25～35nm染色质纤维组成,核心组蛋白是DNA陷阱中最丰富的蛋白质,将近2米的DNA包装成一个小细胞核,是丰富酶的靶标[33]。

完整颗粒的释放而非颗粒化蛋白的释放被认为是嗜酸性粒细胞和中性粒细胞DNA陷阱的主要区别[22]。

二者除不同点外还存在着一些共性。研究发现,嗜酸性粒细胞和中性粒细胞都通过释放细胞毒性蛋白、活性氧,以及可能的细胞外陷阱参与气道上皮损伤。并且NETs和EETs均具有抗感染和促炎特性的网状DNA结构,其都会参与哮喘的病理生理学[34]。而且EET和NET的形成都取决于NADPH氧化酶的活化[35]。

二、EET与哮喘及严重哮喘的关系

研究发现,EETs使用药物和遗传方法增强实验性非感染相关性哮喘中的杯状细胞增生、粘液产生、炎症细胞浸润和2型细胞因子的表达。多种临床相关的变应原部分通过体内胸腺基质淋巴细胞生成素触发EET形成。在机制上,EET通过CCDC25-ILK-PKCα-CRTC1途径激活肺神经内分泌细胞,该途径由嗜酸性粒细胞过氧化物酶增强[36]。在EETs中所含的各种颗粒蛋白中,嗜酸性粒细胞阳离子蛋白能够引起哮喘患者的组织损伤[37]。

严重哮喘(SA)患者的嗜酸性粒细胞比来自非严重哮喘(NSA)患者的嗜酸性粒细胞更活跃,形成EET的嗜酸性粒细胞与基线FEV1%呈负相关预测值,并与哮喘患者的血清EDN水平呈正相关。从SA患者中分离的外周血嗜酸性粒细胞在以ROS依赖性方式激活IL-5和LPS后表现出EET产生增加[38]。最近一项研究表明,当哮喘患者分为SA患者和NSA患者时,血清细胞角蛋白(CK)18水平显著升高,并且SA患者的CK18特异性IgG水平明显高于NSA患者,CK18特异性抗体能够诱导嗜酸性粒细胞脱颗粒,导致EET形成。这些EET进一步刺激AEC释放CK18,增强SA中的嗜酸性粒细胞炎症,导致形成恶性循环[39]。此外,EETs可以通过介导SA的自身免疫反应来诱导哮喘进展;从严重哮喘患者收集的痰液自身抗体可触发 SA 患者的嗜酸性粒细胞溶解和EET形成[40]。

有学者发现,重症哮喘患者释放的EET诱导了上皮细胞衍生的细胞因子,如IL-1α、IL-1β、CXCL-1、CCL24、IL-33和TSLP,而这些因子都会加重哮喘的发生。此外,EET治疗后肺ILC2的数量及活化增加,通过产生IL-5和IL-13导致2型气道炎症[41]。重度哮喘患者的循环NET水平高于轻度或中度哮喘患者或健康对照组,与NET水平相反,循环EET水平与哮喘严重程度无关[42]。最近的研究亦表明,嗜酸性粒细胞释放的细胞外陷阱和囊泡,可以增强与气道上皮相互作用的2型免疫反应,在严重嗜酸性粒细胞性哮喘的发病机制中起重要作用[43]。

而EET不仅与哮喘关系密切,在慢性鼻炎-鼻窦炎[15]、塑型性支气管炎[44]、特异性皮炎[45]等疾病的发生有一定的关联,这里我们不再一一叙述。

三、结语

综上所述,来自活化嗜酸性粒细胞的EET是哮喘诊断和治疗的新靶点。进一步了解 EET 的形成机制将有助于更好地诊断和治疗哮喘及严重哮喘。同时一些研究者也提出了关于EET的进一步研究方向,如关于EET的更准确的触发因素[47];不同的嗜酸性细胞亚型是否同样会导致EET的释放;预防或溶解EET的方法;EET释放的DNA网状结构与蛋白颗粒之间的关系等,这些问题仍需要进一步探索。而随着技术的不断进步,对EET研究力度的不断加强,EET可能成为哮喘的新的潜在治疗靶点,将更好的指导哮喘的临床治疗。