响应面法优化荔枝草中总黄酮的提取工艺

兰艳素，潘 乐，黄义橙，周 蝶

（黄山学院化学化工学院，安徽 黄山 245041）

荔枝草（Salvia plebeiaR. Br.）是一种二年生草本植物[1]，又名蛤蟆草、雪里青。我国拥有丰富的荔枝草药材资源，主要分布在安徽、浙江等省[2]。作为传统中药材，荔枝草被应用于传统处方中，对治疗腹泻、痔疮、咳嗽等，均具有较好疗效[3，4]。

药理学角度研究发现，荔枝草具有显著的抗氧化[5]、抗炎、保肝、止咳平喘[6]、镇痛、抗菌、抑制α-糖苷酶、抗肿瘤等作用[7，8]，因此，越来越多的学者加入到荔枝草的研究队伍中，随着研究的不断深入，其中所含的生物活性成分陆续被发现。主要包括黄酮、倍半萜和二萜、苯丙素类化合物，此外还含有少量的挥发油、脂肪酸酯等[9-11]。研究结果还显示：荔枝草中所含的黄酮类成分具有抗炎[12]、抗氧化[13]和免疫抑制等多方面的药理作用[14]，非常具有研究价值。

中药材中总黄酮成分的提取方法很多，常见的有回流提取法、微波辅助提取法、超临界提取法[15，16]，其中微波辅助提取具有省时、提取率高等优点，已被广泛应用于中药材中有效成分的提取[17-19]。

Alara 等[20]利用微波法辅助提取苦杏仁叶中的黄酮类成分，在料液比0.10g/mL、提取温度为100℃、微波功率为416W 的条件下提取7min，黄酮提取率最高，与索氏提取法相比较，微波法提取得到的黄酮量更高，而且具有更高的抗氧化活性。截至目前，将该技术应用于荔枝草中总黄酮提取方面的研究尚未见报道。

本文以黄山本地产荔枝草资源为原料，在单因素试验结果的基础上，通过建立Central Composite Design 方案，并采用Design Expert 8.0.6 优化得到微波法辅助提取荔枝草总黄酮的最佳工艺条件，以期为该地区荔枝草资源的进一步开发利用提供理论依据。

1 仪器与试剂

荔枝草在5 月份采摘于黄山学院南区，经鉴定为唇形科鼠尾草属植物荔枝草的全草。UV-2600型紫外可见分光光度计：日本岛津公司；MCR-3S型常压微波合成萃取仪：巩义市予华仪器有限公司；GZX-9030 MBE 电热鼓风干燥箱：上海博迅实业有限公司医疗设备厂；芦丁对照品：中国药品生物制品检定所，NaNO2、Al（NO3）3、NaOH、乙醇：国药集团化学试剂有限公司均为分析纯。

2 方 法

2.1 标准曲线的制作

参照之前的工作以及文献的方法[21]，用电子分析天平称取0.0110g 芦丁标准品，溶解后配置成0.22mg/mL的标准溶液。用移液枪准确移取一系列体积的芦丁标准溶液，依次加入0.3mL 5%亚硝酸钠，0.3mL 10%硝酸铝，4mL 4%氢氧化钠，用乙醇溶液定容，摇匀后静置15min，在510nm 处测定各溶液的吸光度值，并制作A-C 曲线，得到标准曲线方程为A=11.89C-0.0102（R2=0.9992）。

2.2 荔枝草中总黄酮的提取

新采摘的荔枝草药材，用蒸馏水将泥沙冲洗干净，平铺于实验室阴凉处8h后，放入鼓风干燥箱中，45℃条件下，鼓风干燥20h，粉碎后，过200 目筛后备用。

称取2.000g 已经处理好的药材，加入一定量的乙醇溶液后，将圆底烧瓶放入微波提取腔正中间，进行微波辅助提取。为了减少乙醇挥发，整个提取过程均用冷凝水进行冷凝回流。待提取结束，提取液在室温下冷却，经离心机离心后，定容于50 mL容量瓶中，得到黄酮提取待测液。

2.3 总黄酮含量测定与提取率的计算

取6 个10mL 容量瓶，编号0～5，其中0 号瓶为空白对照组。准确移取2.0mL 待测液于1～5 号瓶中，依次向6 个容量瓶加入亚硝酸钠，硝酸铝，氢氧化钠进行显色，并于510nm处测定溶液吸光度值A。将吸光度值A 代入下面公式，计算得到总黄酮提取率。

2.4 单因素试验

2.4.1 微波提取时间

按液料比为20:1（mL/g），分别加入体积分数为50%的乙醇溶液，在微波功率为450W 的条件下分别提取3min、5min、7min、9min、11min，提取液离心定容后，移取2mL 待测液，按照制作标准曲线的方法进行显色，于510nm处测定溶液吸光度值。

2.4.2 液料比

准确称取荔枝草药材粉末2.000g，分别加入40mL、50mL、60mL、70mL、80mL 体积分数为50%的乙醇溶液，在微波功率为450W 的条件下进行提取，溶液经处理后，移取2mL，并按照2.3 项下的方法，测定提取液的吸光度值。

2.4.3 乙醇体积分数

按液料比为30:1（mL/g），分别加入体积分数为40%、50%、60%、70%、80%的乙醇溶液，并在微波功率为450W 的条件下提取7min，移取2mL 处理后溶液，显色后，测定提取液的吸光度值。

2.4.4 微波功率

准确称取荔枝草药材粉末2.000g，分别加入60 mL 体积分数为50%的乙醇溶液，分别在微波功率为360W、450W、540W、630W、720W 的条件下，进行微波提取7min，提取液离心定容后，移取2mL，按照2.3项下的方法，测定提取液的吸光度值。

2.5 Center Composite Design试验

根据单因素试验的结果，以微波提取时间、液料比、乙醇体积分数、微波功率为自变量，总黄酮提取率为响应值，设计出星点试验方案。准确称取2.000g荔枝草粉末，按照试验方案加入乙醇溶液后，微波法辅助提取荔枝草中的总黄酮，测定提取液的吸光度并计算总黄酮提取率，综合考察4 个试验自变量对总黄酮提取率的影响。

3 结果与分析

3.1 提取时间对黄酮提取率的影响

由图1所示，随着提取时间的延长，荔枝草中总黄酮的提取率呈现出先快速升高后趋于平稳的趋势，当提取时间在3～7min之间时，提取率有明显增加，当提取时间为7min时，黄酮的得率出现最大值，但提取时间超过7min 后，黄酮提取率趋于稳定，再进一步延长提取时间，对总黄酮得率的提高帮助甚微，由于延长提取时间，不仅耗能，而且会导致提取液中的杂质会变多。因此，选择7min为最佳。

图1 不同提取时间的提取效果

3.2 液料比对黄酮提取率的影响

图2为不同液料比对总黄酮提取效果的影响曲线，当药材量一定，加入的提取液体积太多、太少，都不利于总黄酮的提取，液料比为20:1（mL/g）时，提取率比较低，只有1.35%，当液料比扩大到25:1（mL/g）时，黄酮提取率快速升高，并于30:1（mL/g）处达到最大值。继续扩大液料比，35:1（mL/g）增加到40:1（mL/g），总黄酮得率有略微下降，这可能是由于随着液料比的慢慢增加，提取液的体积也随之增加，有利于黄酮成分的溶出，但若液料比过大，当微波提取条件不变，提取过程中所能达到的温度等相关因素都会有所改变，从而导致提取率降低。

图2 不同液料比的提取效果

3.3 乙醇体积分数对黄酮提取率的影响

由图3 可见，乙醇体积分数为30%～50%之间时，总黄酮类化合物的溶出量明显增加，当乙醇体积分数为50%时，提取率为2.03%，效果最好，继续增加乙醇的体积分数，黄酮提取率反而有所下降，可能是由于荔枝草药材中所含黄酮类成分的极性为中等强度极性，过高或者过低极性的溶剂都不利于该类化合物的溶出。

3.4 微波功率对黄酮提取率的影响

从图4 可以看出，当微波功率从360W 增加到630W 时，总黄酮提取率会随着微波功率的增加有明显的升高，且在630W 处黄酮得率最大，持续加大微波提取功率，提取率稍微下降。可能是因为微波功率提高，能够加大微波能对物料的处理强度，从而有效提高黄酮的提取率，但若微波功率过大，使得提取出来的黄酮组分中结构不是很稳定的化合物遭到破坏，所以导致总黄酮提取率略有下降。

图4 不同微波功率的提取效果

3.5 星点试验设计水平及结果

采用Design-Expert 8.0.6 软件中的Central Composite Design 方法进行响应面实验方案设计，得到荔枝草中总黄酮提取的响应面试验因素与水平表见表1。

表1 荔枝草中黄酮提取的响应面试验因素与水平表

准确称取荔枝草粉末2.000g，共30 份，按照试验设计方案进行提取，提取液经过离心处理后，用移液管移取2.0mL 待测液，依次加入硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠，定容于10mL 容量瓶中，510nm 处测定溶液的吸光度值，并计算黄酮的提取率，试验结果见表2。

表2 实验设计与结果

采用Design Expert 8.0.6 软件对试验所得数据进行响应面分析，得到模型回归方程为：Y=-7.2328+0.4432A+0.0097B+0.1860C+0.0818D-0.0001AB-0.0019AC-0.0005AD-0.0004CD-0.0239A2-0.0025C2-0.0006D2，实验方差分析结果见表3。

表3 方差分析结果

由方差分析表可知，提取时间的P 值小于0.0001，说明其对黄酮提取率的影响非常显著，其次是微波提取功率，液料比对试验结果的影响最弱。在两两因素交互影响中，乙醇体积分数与液料比的交互作用对总黄酮得率的影响极显著（P=0.0007），提取时间与微波提取功率、乙醇体积分数、液料比的交互影响显著，其P 值均＜0.05，微波提取功率与乙醇体积分数、液料比的交互影响的P 值分别为0.8036、0.6999，对黄酮的提取效果影响不大。各因素平方项的影响也达到极显著水平，说明微波提取时间、微波功率，液料比、乙醇体积分数对荔枝草总黄酮得率的影响呈二次曲线关系，而不是简单的线性关系。

总的来看，所得模型的P＜0.0001，影响极显著，R2=0.988，变异系数C.V.只有1.06%，失拟项P 值为0.3298（大于0.05），说明该模型的拟合度较好，能较好预测出荔枝草总黄酮的提取工艺条件，试验结果准确，可靠。

3.6 响应面分析

通过软件分析，得到提取时间与微波提取功率、乙醇体积分数、液料比两两交互作用对总黄酮提取率的影响曲面图见图5。

图5 两两因素交互作用对总黄酮得率的影响曲面图

由图5 可见，提取时间与微波功率、液料比、乙醇体积分数两两因素交互作用对荔枝草总黄酮提取率均有影响，响应面均为开口朝下的曲面，说明随着各因素的变化，黄酮得率也会受到一定影响，呈现出先增加后减小的趋势，并在合适的条件下，可以将荔枝草中总黄酮最大限度的提取出来。

图5（a）为乙醇体积分数与液料比对总黄酮得率的影响曲面，当乙醇体积分数为50%，液料比为30:1（mL/g）时，总黄酮提取率最高可达到2.12%。图5（b）、（c）、（f）的影响曲面图比较陡峭，等高线为椭圆形，说明微波功率与提取时间、液料比与提取时间、乙醇体积分数与提取时间的交互作用对荔枝草总黄酮的提取影响显著。图5（d）、（e）的响应曲面相对平滑，说明在微波辅助提取过程中，液料比与微波功率、乙醇体积分数与微波功率的交互作用对黄酮提取率的影响不显著。

响应面法综合分析后，得到的最佳提取工艺为：微波提取时间6.53min，微波功率623.68W，液料比30.26:1(mL/g)，乙醇体积分数为51.08%，荔枝草中总黄酮的提取率为2.122%。

3.7 最佳工艺验证

准确称取荔枝草粉末2.000g，共10 份。在模型预测得到的最佳条件下进行微波辅助提取，提取液经处理后，测量溶液吸光度值，黄酮含量的计算方法与2.3 项一致。实验结果表明：10 组平行试验的平均总黄酮提取率为2.093%，相对误差为1.386%，说明该模型方程稳定、准确。

4 结 论

实验通过建立Central Composite Design方案，采用Design Expert 8.0.6 进行优化分析，得到微波法辅助提取荔枝草中总黄酮的最佳提取工艺为：微波提取时间6.5min，微波功率623.7W，液料比30.3:1（mL/g），乙醇体积分数为51%。在此条件下，荔枝草中总黄酮的提取率为2.093%。提取效果与已报道的有所差异，可能是因为原材料的产地、采摘季节以及提取的方法对提取率都有一定的影响。验证实验结果表明，利用星点设计-响应面法优化得到的提取工艺具有较好的稳定性和准确性，能较好地预测出荔枝草中总黄酮的提取工艺，能为该资源的进一步开发利用提供参考。