SPOCK2 在泛癌中的预后和免疫治疗反应中的潜在价值研究

冯忘忧，姜东伯，徐 盈，李 佳，杨 红*

1.空军军医大学西京医院妇产科，陕西 西安710032；2.空军军医大学基础医学院，陕西 西安710032

肿瘤的发生往往由多种因素驱动，导致其高度的复杂性和异质性[1]。 传统的癌症治疗模式，包括放射疗法、化学药物治疗或靶向治疗，其疗效较为有限[2]。免疫检查点抑制剂（immune checkpoint inhibitors,ICIs）作为一种癌症免疫疗法，改变了癌症晚期患者的治疗方式，这是癌症治疗史上的一场革命[3]。 单一的免疫疗法对某些肿瘤患者的治疗效果仍有限，研究表明，传统的治疗方法可以影响肿瘤微环境（tumor micro environment, TME），与ICIs 联合使用具有协同作用[2]。 中医学是我国传承数千年的医学，受到越来越多人的重视，研究表明，中医药可以通过重塑免疫细胞平衡及调节免疫检查点等方式杀伤肿瘤细胞[4]。 因此，中医药以其独特的优势与免疫治疗相辅相成[4]。TME是肿瘤细胞与宿主免疫系统相互作用的主要部位[5]。 越来越多的研究表明，免疫抑制性细胞高浸润是免疫治疗的主要障碍[6]，与不良预后和ICIs耐药性相关[2]。 相反，免疫激活的特点是高促炎免疫物质浸润，这往往预示着良好的免疫治疗效果[7]。 TME是中医肿瘤辨证论治的物质基础，治疗实质就是重塑TME。 因此，探索TME 可以成为中医现代化之路的切入点。例如，研究表明，中药可以调控程序性死亡蛋白-1（programmed cell death protein-1, PD-1）/程序性死亡蛋白配体-1（programmed death ligand-1,PD-L1）免疫通路及相关细胞因子水平抑制胃癌进展[8]。因此，寻找可能影响TME 组分的关键基因至关重要，可以为免疫治疗新时代中西医结合治疗肿瘤提供支撑，也为中医药的作用机制提供理论基础和参考方向[8]。近年来，转录组学和高通量测序的发展导致越来越多的关键驱动基因被发现[9]。 这使得可以在泛癌中分析任何与肿瘤相关的基因，并检查其与临床预后以及对免疫微环境的影响。

睾丸蛋白聚糖2（sparc/osteonectin, cwcvandkazallike domains proteoglycan 2, SPOCK2）是基质细胞蛋白家族的一员，在卵巢癌和子宫内膜癌的生长中起着重要作用[10-11]。此外，研究表明，SPOCK2 在肺癌中的表达与免疫浸润有关，表明SPOCK2 在肿瘤免疫调节中具有重要影响[12]，同时说明SPOCK2 在不同的癌症中具有不同的功能。目前尚无SPOCK2 与免疫微环境相关性的泛癌分析。 本研究利用癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas, TCGA）、临床蛋白质组学肿瘤分析联盟（Clinical Proteomic Tumor Analysis Consortium, CPTAC）数据库及人类蛋白质图谱（Human Protein Atlas, HPA）数据库中的肿瘤图谱对SPOCK2 在泛癌中的预后和免疫治疗的价值进行探讨。

1 材料与方法

1.1 数据收集

从癌症基因组学数据分析平台下载来自TCGA、基因型组织表达数据库的泛癌数据集，为去除测序深度和基因长度等测序数据的技术偏差，该数据集已经过标准化处理，即将数据后台没有处理的原始表达量转变为每千个碱基的转录每百万映射读取的RNA 测序片段，进一步从中提取SPOCK2 在各个样本中的表达数据和相关临床数据。此外，从既往发表在《细胞》杂志上的TCGA 预后研究中获取高质量的预后数据集，并排除样本量＜3 的癌症类型。

1.2 主要试剂

RNA 提取试剂盒（北京聚合美生物科技有限公司，批号：MF036-01），反转录试剂盒（北京聚合美生物科技有限公司，批号：MF166-plus-01），2X 实时定量PCR 预混液（北京聚合美生物科技有限公司，批号：MF015-505）。

1.3 检测SPOCK2 的差异表达

使用基因表达谱交互分析（Gene Expression Profiling Interactive Analysis,GEPIA2.0）和肿瘤免疫评估资源库（Tumor Immune Estimation Resource,TIMER 2.0）评估SPOCK2 信使RNA 的表达[13]。 此外，利用GEPIA2.0 的“病理分期”模块，获得了TCGA 肿瘤不同病理阶段（Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期和Ⅳ期）SPOCK2 的表达情况。 最后利用CPTAC 数据库对SPOCK2 在蛋白水平的表达进行评估，且利用HPA 数据库对部分肿瘤中的差异表达结果进行初步验证。

1.4 生存分析

采用Kaplan-Meier 方法分析TCGA 队列患者的生存期和无进展间隔期（progression-free interval,PFI）。

1.5 基于SPOCK2 相关基因的基因富集分析

基于仙桃平台，筛选出与SPOCK2 共表达的基因，并使用京都基因与基因组百科全书（Kyoto Ency lopaedia of Genes and Genomes, KEGG）富集工具[14]进行分析，以获取SPOCK2 在各种癌症中的潜在机制。

1.6 免疫浸润分析

基于桑格数据分析[15]平台，并通过TIMER2.0、CIBERSORT 算法平台和微环境细胞群计数器（Microenvironment Cell Populations-counter, MCPcounter）等评估SPOCK2 与肿瘤中免疫浸润水平的相关性。TIMER2.0 数据库可以分析TCGA 数据集，其中包含B 淋巴细胞、CD8+T 淋巴细胞、CD4+T 淋巴细胞、中性粒细胞、巨噬细胞和树突状细胞。 CIBERSORT 使用基因表达谱定义复杂组织中的细胞组成。 MCPcounter 根据基因表达矩阵，计算每个样本中8种免疫细胞和2 种基质细胞的绝对丰度分数。 根据每种TCGA 肿瘤类型的中间值将患者分为SPOCK2 高表达组和低表达组，以比较免疫细胞浸润程度。

1.7 免疫组织化学分析

利用HPA 数据库获取肝细胞性肝癌（liver hepatocellular carcinoma, LIHC）、甲状腺癌（thyroid carcinoma,THCA）、皮肤黑色素瘤（skin cutaneous melanoma,SKCM）、卵巢浆液性囊腺癌（ovarian serous cystadenoma, OV）肿瘤组织与相应的正常组织中SPOCK2表达的免疫组化结果。

1.8 荧光定量PCR 反应

按照RNA 提取试剂盒的操作手册提取人卵巢正常组织和肿瘤组织的RNA，将总RNA 逆转录为cDNA 后配制PCR 反应体系共20 μL，反应过程：95 ℃1 min，40 个循环：95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，72 ℃45 s，35 ℃30 s，95 ℃1 min，60 ℃15 s，98 ℃5 s。SPOCK2 正向序列：5'-ATGGAGGACGAGCAATGGCT-3'，反向序列：5'-TGGGTCGGACGAGGGAAC-3'；βactin 正向序列：5'-ACTCTTCCAGCCTTCCTTCC-3'，反向序列：5'-TCTCCTTCTGCATCCTGTCG-3'。 读取FAM 荧光值。 各样本以β-actin 为内参计算SPOCK2的表达量。β-actin 引物由上海生工生物工程股份有限公司提供，SPOCK2 引物由北京擎科生物科技股份有限公司提供。

1.9 统计学分析

基于student's 检验两组之间的差异。 P<0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SPOCK2 的表达在多种肿瘤组织和正常组织中有显著差异

SPOCK2 在脑低级别胶质瘤（brain lower grade glioma, LGG）、子宫内膜癌（uterine corpus endometrial carcinoma, UCEC）、乳腺癌（breast carcinoma,BRCA）、食管癌（esophageal carcinoma, ESCA）、胃腺癌（stomach adenocarcinoma, STAD）、头颈部鳞状细胞癌（head and neck squamous cell carcinoma, HNSC）、LIHC、THCA、SKCM、OV、胰腺腺癌（pancreatic adenocarcinoma, PAAD）、子宫癌肉瘤（uterine carcino sarcoma, UCS）、嗜铬细胞瘤和副神经节瘤（pheochromocytoma and paraganglioma, PCPG）和胆管细胞癌（cholangiocarcinoma, CHOL）14 种肿瘤表达较高。在多形性胶质母细胞瘤（glioblastoma multiforme, GBM）、肺腺癌（lung adenocarcinoma, LUAD）、肾乳头状细胞癌（kidney renal papillary cell carcinoma, KIRP）、结肠腺癌（colon adenocarcinoma, COAD）、肾透明细胞癌（kidney renal clear cell carcinoma, KIRC）、肺鳞状细胞癌（lung squamous cell carcinoma, LUSC）、直肠腺癌（rectum adenocarcinoma, READ）、睾丸生殖细胞瘤（testicular germ cell tumors, TGCT）、急性淋巴细胞性白血病（acute lymphoblastic leukemia, ALL）、急性髓系白血病（acute myeloid leukemia, AML）、肾上腺皮质癌（adrenocortical carcinoma, ACC）和肾嫌色细胞癌（kidney chromophobe, KICH）12 种肿瘤中表达较低，详见图1A。 通过GEPIA2.0 进一步验证了其中6 个肿瘤的结果，发现除胸腺癌（thymoma,THYM）外，其余5 种肿瘤的结果均与图1A 一致，详见图1B。使用GEPIA2.0 发现SPOCK2 在THYM中高表达，图1A 数据所得结果不包含THYM。使用“病理分期”模块进一步发现在SKCM、THCA、STAD 和KICH 4 种肿瘤中，SPOCK2 的表达在较高的分期显著升高，详见图1C。 此外，HNSC、OV、KIRC、PAAD、GBM 和LUAD 中肿瘤细胞与正常组织的SPOCK2 蛋白水平有显著差异，详见图1D。 以上结果说明在基因水平和蛋白表达水平上，SPOCK2基因在多种肿瘤类型的肿瘤组织中的表达与在正常组织中的表达有显著差异。 这一发现也表明，SPOCK2基因在表达上调和下调肿瘤中的功能有差异。

图1 SPOCK2 在泛癌肿瘤组织与正常组织中的差异表达分析

2.2 SPOCK2 高表达在大多数癌症中与良好的预后相关

根据SPOCK2 表达水平将病例分为高表达组和低表达组，并使用TCGA 数据集检验其在不同肿瘤类型中的预后意义。 从Kaplan-Meier 总生存分析结果来看，SPOCK2 是OV 患者的危险因素（P=0.007），是BRCA（P=0.003）、THCA（P=0.021）、口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma, OSCC）（P=0.028）、HNSC（P<0.001）、PAAD（P=0.025）、SKCM（P<0.001）患者的保护因素，详见图2A。 PFI 分析结果显示，SPOCK2 是前列腺癌（prostate adenocarcinoma, PRAD）患 者 的 危 险 因 素（P=0.005），是HNSC（P<0.001）、SKCM（P=0.001）、BRCA（P=0.005）、CHOL（P=0.002）、LIHC（P=0.032）和LGG（P=0.001）患者的保护因素。详见图2B。

图2 SPOCK2 表达与患者预后的关系

2.3 KEGG 富集分析发现SPOCK2 参与免疫相关的通路

使用富集分析方法探讨SPOCK2 在PAAD、HNSC、LIHC、LUAD、SKCM、LAML、BRCA、PRAD 和OSCC 9种肿瘤中的功能及其相关通路。 选取每种肿瘤中与SPOCK2 呈正相关的前300 个基因。 KEGG 分析的结果表明SPOCK2 与T 细胞、T 辅助细胞的激活和分化、趋化因子信号通路、T 细胞受体信号通路、细胞因子受体活性、T 细胞受体复合物、淋巴细胞分化和抗原受体介导的信号通路有关，详见图3。 T 细胞活化是免疫反应的核心，是抗肿瘤作用的关键。 因此，SPOCK2 参与了这些肿瘤中T 细胞的激活和分化，是其对某些肿瘤具有保护作用的重要原因。 这些途径都与免疫反应和免疫调节过程有关，表明SPOCK2可以调节肿瘤免疫微环境。

图3 SPOCK2 相关基因的KEGG 富集分析

2.4 SPOCK2 表达水平与免疫浸润水平相关

进一步分析SPOCK2 与免疫细胞的相关性以明确其免疫学功能。 TIMER2.0 算法分析结果显示，在大多数肿瘤中，SPOCK2 与B 淋巴细胞、CD4+T 淋巴细胞、CD8+T 淋巴细胞、中性粒细胞、巨噬细胞和树突状细胞浸润呈正相关，详见图4A，这与MCPcounter 数据库得到的结果相对一致，详见图4B。 虽然，MCPcounter 数据库算法比TIMER2.0 评估更多的免疫细胞类型，但仍发现SPOCK2 对一些癌症的免疫细胞浸润水平影响较小，包括OV、CHOL、ACC、THCA、间皮瘤、LGG、PCPG、GBM、THYM 和UCS，低免疫浸润提示预后不良。 因此，SPOCK2 可作为OV、UCS、ACC 预后不良的生物学标志物。 利用CIBERSORT 数据库的免疫细胞浸润数据共获得34种肿瘤类型的22 种免疫细胞浸润评分，详见图4C。22 种免疫细胞包括浆细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞，以及各种类型的B 淋巴细胞、T 淋巴细胞、自然杀伤性细胞、巨噬细胞、树突状细胞和肥大细胞。 结果表明，SPOCK2 与静息B 淋巴细胞、CD8+T 淋巴细胞、CD4+T 淋巴细胞、M1 型巨噬细胞呈正相关，而与静息自然杀伤细胞、M0 型和M2型巨噬细胞、静息肥大细胞和嗜酸性粒细胞呈负相关。

图4 免疫细胞浸润分析

2.5 SPOCK2 在多种肿瘤类型中与免疫检查点相关基因具有相关性

目前，阻断免疫检查点是免疫疗法的主要手段，而免疫微环境是影响肿瘤免疫治疗的重要因素。 因此进一步探讨SPOCK2 是否具有调节免疫微环境的作用，且是否与免疫检查点相关的基因具有相关性是有必要的。 本文评估了SPOCK2 与五类免疫途径的相关性，包括趋化因子、受体、主要组织相容性复合体标记基因的表达、免疫抑制因子和免疫刺激因子[16]，详见图5A。 SPOCK2 的表达与趋化因子CCL2、CCL4、CCL5 和CCL7 及其受体CCR2、CCR4、CCR5和CCR7 呈正相关。 进一步提取SPOCK2 和包括抑制性和刺激性两类免疫检查点通路在内的60 个基因，详见图5B。 分析发现，SPOCK2 在大多数肿瘤类型中与衰竭T 细胞标记基因、免疫激活基因和癌症免疫抑制基因、T 细胞免疫球蛋白免疫受体酪氨酸抑制基序结构、细胞程序性死亡蛋白1（programmed cell death 1, PDCD1）、淋巴细胞活化基因-3、细胞毒性T 淋巴细胞相关蛋白4（cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4, CTLA4）、表面抗原分化簇274 等与免疫治疗相关的基因具有正相关性。 结果表明，SPOCK2 在TME 中起着至关重要的作用。

图5 SPOCK2 与免疫调节、免疫检查点基因的相关性

2.6 免疫组织化学分析

从HPA 数 据 库LIHC、THCA、SKCM 和OV 肿瘤组织及其相应的正常组织中SPOCK2 的免疫组织化学结果，详见图6。这些结果支持TCGA 的发现，即SPOCK2 在LIHC、THCA、SKCM 和OV 组织中的表达高于正常组织。

图6 免疫组织化学分析SPOCK2 在不同肿瘤组织与正常组织的差异表达

2.7 荧光定量PCR 分析

以上结果均基于数据库得到，为了进一步验证SPOCK2 在正常组织和癌症组织的表达差异，选取正常卵巢上皮组织和OV 组织为代表，经过荧光定量PCR 分析可以发现，OV 组织中SPOCK2 mRNA 的表达水平确实高于正常卵巢上皮组织，与GEPIA2.0和HPA数据库得到的结果一致，详见图7。

图7 荧光定量PCR 验证SPOCK2 mRNA 在OV组织中的表达水平（n=3）

3 讨论

随着对肿瘤生物学和免疫学的探索，过去十年ICIs 在肿瘤的临床治疗中取得了重大进展[17]。 由于肿瘤特性极度复杂，免疫治疗也存在有效人群比例低、产生耐药性、过度进展等问题。 只有大约20%的患者可以从ICI 单药治疗中获益。 近年来中医药辅助免疫治疗在肿瘤治疗中展现出强大的优势，两者相辅相承。中医认为扶正祛邪法是治疗肿瘤的关键，通过调整阴阳、扶助正气使机体达到平衡状态，使患者能够带瘤生存。 现代医学中免疫治疗从免疫逃逸机制出发，研发出的ICIs 大大改善肿瘤治疗效果，这种利用患者自身免疫功能杀伤肿瘤的治疗理念，与中医扶正抑瘤的理念具有异曲同工之妙[18]。 但无论是传统中医还是现代医学都注重个体化治疗，因此，寻找新的生物标志物对帮助临床医生预测癌症的预后和中西医联合免疫治疗效果至关重要。SPOCK2 在某些肿瘤中可作为帮助诊断的生物标记物。 本研究对SPOCK2 在泛癌中的预后和免疫治疗价值进行了系统的分析。

SPOCK2 在14 种肿瘤中高表达，在12 种肿瘤低表达。 HPA 数据库的免疫组织化学结果也显示在LIHC、THCA、SKCM 和OV 中SPOCK2 的表达高于正常组织。 且SPOCK2 在大多数具有统计学意义的癌症中是保护因素，但仅在OV 中是危险因素。之前的研究发现在OV 中，随着hsa-miR-363-3p-SPOCK2轴的促进，SPOCK2 被下调，它可以调节肌动蛋白细胞骨架，阻断OV 的分期进展[11]，这与本次研究结果一致。 此外，SPOCK2 的表达与临床分期相关，提示SPOCK2 在 指 导SKCM、THCA、STAD、KICH 4 种肿瘤不同分期患者的治疗方面具有临床意义。

KEGG 分析发现SPOCK2 与T 细胞和辅助T 细胞的激活和分化有显著相关。 辅助性T 细胞和功能性T 细胞都在免疫微环境中发挥重要作用。 且在大多数癌症中，SPOCK2 的表达与发挥主要免疫功能的免疫细胞也密切相关，包括B 淋巴细胞、CD4+T淋巴细胞、CD8+T 淋巴细胞、中性粒细胞、巨噬细胞、癌症相关成纤维细胞、NK 细胞、免疫检查点和免疫调节相关基因。 这些结果表明，SPOCK2 在调节TME 中起着至关重要的作用。

对 于BRCA、THCA、HNSC、PAAD 和SKCM 来说，SPOCK2 高表达与其瘤内高免疫浸润水平相关，这也解释了SPOCK2 在这些肿瘤中起保护作用的现象。 相反，SPOCK2 是OV 和PRAD 的危险因素，虽然该基因在肿瘤中高表达，但其免疫浸润水平较低。这种情况表明，在免疫抑制的情况下，SPOCK2 的功能受到限制。影响肿瘤微环境的因素很多。例如，肿瘤浸润的调节性T 细胞可以诱导免疫抑制微环境，这是肿瘤免疫治疗成功的主要障碍[19]。因此，当其他抑制因子在免疫微环境中占据优势时，SPOCK2 的免疫激活功能可能受到限制。

此外，SPOCK2 与PDCD1 和CTLA4 基 因在多种肿瘤里呈正相关，例如在SKCM，READ，LUSC 等肿瘤中，且PD-1 抑制剂和CTLA4 抑制剂均已在临床广泛应用，尤其在SKCM 及LUSC 等实体肿瘤中治疗效果明显，表明SPOCK2 可以作为一种生物标志物来指导免疫治疗药物的使用。 本文初步分析了SPOCK2 在泛癌中的作用，发现SPOCK2 与调节免疫微环境的刺激分子及抑制分子相关，具有调节免疫微环境的作用。因此，在某些肿瘤中，可预测免疫治疗敏感性。当然，这还需要更深入的研究去验证。综上所述，本文评估了SPOCK2 在癌症中预后和免疫治疗反应预测的作用，并发现其在不同的癌症中发挥不同的功能。 该研究为SPOCK2 在恶性肿瘤中的应用提供了一个新的角度，这有助于科学家寻找更好的治疗癌症患者的方法，也可为中医药作用靶点以及分子生物学领域的研究提供参考方向。