肾癌组织中RRM2、ANXA1表达变化及其与患者预后的关系

万勇军，阮先国，张学勤，殷妮，张大虎

1 湖北医药学院附属襄阳市第一人民医院泌尿外科，湖北襄阳441100；2 襄阳市中心医院泌尿外科

肾癌是常见的泌尿系统恶性肿瘤［1］，病理类型以肾透明细胞癌最为常见，约占所有类型的80%。肾癌起病隐匿，约有30%肾癌患者初次就诊时已出现远处转移，对于局部进展期肾癌患者，即使经手术、靶向治疗等综合治疗，术后仍可能发生肿瘤复发或转移，导致不良预后［2］。目前肾癌患者预后评估主要依靠TNM分期，但即使相同分期患者预后仍然差异较大。核苷酸还原酶亚单位M2（RRM2）是核糖核酸还原酶的催化亚基，能够催化核糖核苷酸形成脱氧核糖核苷酸，参与DNA修复及细胞周期等过程。近年来发现，RRM2在膀胱癌、肺癌等恶性肿瘤中表达升高，能促进肿瘤细胞增殖及免疫逃逸，导致肿瘤恶性进展，是潜在的肿瘤预后标志物［3-4］。膜联蛋白A1（ANXA1）是膜联蛋白A超家族成员，参与膜聚集、细胞信号转导等多种生物学过程［5］。研究表明，乳腺癌［6］、甲状腺癌［7］等肿瘤中ANXA1表达上调，通过诱导肿瘤上皮—间质转化，促进肿瘤侵袭和转移。本研究观察了肾癌组织中RRM2、ANXA1表达变化，探讨两者与肾癌临床病理参数及无进展生存预后的关系。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2018年3月—2020年3月收治的肾癌患者102例纳入研究。纳入标准：初次诊治，年龄＞18岁；均接受肾癌根治术，术后病理检查明确为肾癌；患者同意参加本研究并签署知情同意书，相关临床病理和随访资料完整。排除合并严重心肺疾病、合并其他恶性肿瘤患者，一般状况差、不能耐受手术的患者，转移性肾癌或肿瘤原发灶来源于其他器官的患者，妊娠、哺乳期女性。102例中，男60例、女42例；年龄33 ～ 79（63.59 ± 7.60）岁；透明细胞癌80例，非透明细胞癌22例；TNM分期Ⅰ期58例，Ⅱ ～ Ⅲ期44例；Fuhrman分级Ⅰ ～ Ⅱ级52例，Ⅲ ～ Ⅳ级50例；合并淋巴结转移11例，无淋巴结转移91例。本研究经医院伦理委员会审批通过（伦理号2023KY044）。

1.2 肾癌组织中RRM2、ANXA1蛋白检测 取术中获取的部分肾癌组织和癌旁正常肾组织，10%中性甲醛固定16 h，石蜡包埋切片，二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化，磷酸盐缓冲液中100 ℃热修复10 min，3%过氧化氢溶液10 min，RRM2、ANXA1一抗工作液（稀释比均为1∶1 000）4 ℃孵育过夜，二抗工作液室温孵育1 h，DAB显色液显色5 min，苏木精复染，二甲苯透明，中性树胶封片，镜下观察染色情况。由两位病理医师双盲阅片，根据着色程度和染色面积进行半定量染色评分，着色程度为无染色计0分，弱染色计1分，强染色计2分；染色面积＜10%计0分，10% ～ 25%计1分，25% ～ 50%计2分，＞50%计3分；两项得分相乘，＞2为阳性，≤2为阴性。

1.3 预后观察 患者出院后开始定期随访，以门诊复查方式进行，包括体格检查、B超及腹盆腔CT检查等。分别于术后1、6、12个月随访1次，以后每年随访1次。随访内容为有无肿瘤复发、转移及患者生存情况。肿瘤进展定义为随访中发现肿瘤局部复发、远处转移或患者死亡。随访截至2023年4月。随访终点为随访时间结束或出现肿瘤进展。

1.4 统计学方法 采用SPSS26.0软件。计数资料以率表示，组间比较采用χ2检验。相关性分析采用Spearman秩相关分析法。采用Log-Rank检验比较不同RRM2、ANXA1表达肾癌患者3年无进展生存率的差异。采用单因素及多因素COX回归分析肾癌患者无进展生存预后影响因素。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肾癌组织中RRM2、ANXA1表达变化及其相关性 肾癌组织RRM2、ANXA1阳性染色主要位于细胞质和细胞膜。肾癌组织RRM2、ANXA1阳性表达率分别为70.59%（72/102）、66.67%（68/102），均高于癌旁正常肾组织的7.84%（8/102）、5.88%（6/102），P均＜0.05。见图1。肾癌组织中RRM2与ANXA1表达呈正相关（r=0.702，P＜0.05）。

图1 肾癌组织和癌旁正常肾组织RRM2、ANXA1表达情况（免疫组化染色，×200）

2.2 不同临床病理参数肾癌组织中RRM2、ANXA1表达比较 不同肿瘤TNM分期、Fuhrman分级肾癌组织中RRM2、ANXA1阳性表达率差异具有统计学意义（P均＜0.05）。不同性别、年龄、病理类型之间比较，差异无统计学意义（P均＞0.05）。见表1。

表1 不同临床病理参数肾癌组织中RRM2、ANXA1表达比较［例（%）］

2.3 不同预后患者肾癌组织RRM2、ANXA1表达比较 102例肾癌患者，肿瘤进展21例，3年无进展生存率为79.41%。RRM2阳性者、阴性者3年无进展生存率分别为75.00%（54/72）、90.00%（27/30），ANXA1阳性者、阴性者3年无进展生存率分别为73.53%（50/68）、91.18%（31/34），RRM2阳性、ANXA1阳性患者3年累积无进展生存率分别低于RRM2阴性、ANXA1阴性患者（P均＜0.05）。见图2。

图2 不同RRM2、ANXA1表达情况肾癌患者3年无进展生存情况比较

2.4 RRM2、ANXA1表达对肾癌患者无进展生存预后的影响 以随访3年内患者是否出现疾病进展为因变量（是=1，否=0），将肾癌临床病理参数及RRM2、ANXA1表达纳入单因素及多因素COX回归分析，结果显示，TNM分期Ⅱ ～ Ⅲ期、Fuhrman分级Ⅲ ～ IV级、RRM2阳性及ANXA1阳性表达是肾癌患者无进展生存预后的影响因素。见表2、表3。

表2 肾癌患者无进展生存预后影响因素单因素COX分析结果

表3 肾癌患者无进展生存预后影响因素多因素COX分析结果

3 讨论

既往研究发现，约1/3的肾癌患者术后可发生肿瘤复发或转移，复发转移是肾癌患者死亡的主要原因［8］。虽然近年来分子靶向治疗药物及免疫检查点抑制剂治疗转移性肾癌有一定临床疗效，但患者仍存在耐药或治疗低应答率的问题［9］。因此，寻找新的、敏感的肾癌肿瘤标志物评估肾癌进展及预后，对于提高肾癌临床诊治效能具有重要意义。

人核糖核苷酸还原酶参与催化核糖核苷二磷酸转化为2′-脱氧核糖核苷二磷酸，合成DNA合成修复所需的2′脱氧核糖核苷5′-二磷酸。RRM2是维持人核糖核苷酸还原酶活性的重要催化亚基。研究表明，非小细胞肺癌等恶性肿瘤中RRM2表达升高，促进肿瘤的发生及恶性转化，是新的分子诊断学和预后预测的标志物［10］。本研究中，肾癌组织RRM2表达升高，提示RRM2参与肾癌的发生。肾癌中RRM2表达升高与抑癌基因多溴蛋白1突变有关。研究表明，40%肾癌中存在抑癌基因多溴蛋白1突变，其编码蛋白不能构成SWI/SNF染色质重塑复合物，导致RRM2基因过度表达，促进免疫抑制性CD4+T淋巴细胞浸润，导致肿瘤恶性进展［11］。本研究中，肾癌组织RRM2表达与TNM分期及Fuhrman分级有关，提示RRM2促进肾癌进展。分析原因，RRM2的表达升高不仅能够通过促进细胞周期G1/S期的进行，促进DNA损伤修复及肿瘤细胞恶性增殖，还能够抑制干扰素基因刺激因子通路，抑制肿瘤杀伤性CD8+T淋巴细胞浸润，促进肿瘤免疫逃逸，导致肿瘤进展［12］。本研究发现，RRM2阳性表达的肾癌患者无进展生存率较低，提示检测肾癌组织中的RRM2有助于评估患者预后。分析其原因，一方面是RRM2阳性表达的肾癌患者肿瘤TNM分期及Fuhrman分级高，肿瘤侵袭和转移潜能大，术中可能残留微小转移灶，造成术后肿瘤复发和转移；另一方面，有学者发现，RRM2阳性表达的肾癌细胞对靶向药物治疗及免疫检查点抑制剂治疗的有效性较差，导致肿瘤不易被彻底清除，肿瘤复发转移，导致不良预后［13-14］。

ANXA1属于膜联蛋白家族成员，分子量为38 kD，参与细胞增殖、分化和凋亡等生物学过程。近年来发现，胰腺癌中ANXA1作为一种致癌因子，能够与硫酸乙酰肝素结合，促进肿瘤侵袭和转移等恶性生物学行为［15］。本研究中，肾癌组织ANXA1表达明显升高，提示ANXA1参与肾癌的发生。研究发现，ANXA1通过激活丝裂原活化蛋白激酶通路促进肾癌细胞恶性增殖［16］。本研究中，ANXA1表达与肾癌患者不良临床病理特征有关，提示ANXA1表达可促进肾癌的恶性进展。有学者报道，ANXA1表达能够通过磷酸化激活下游蛋白激酶B和细胞外信号调节激酶，促进肾癌细胞的侵袭和转移，导致肿瘤恶性进展［17］。还有学者发现，转移性肾癌患者肿瘤组织中ANXA1表达上调还能降低肾癌细胞对舒尼替尼治疗的敏感性，是评估转移性肾癌患者靶向治疗预后的生物标志物［18］。本研究也证实，ANXA1阳性是影响肾癌患者无进展生存预后的独立危险因素，表明ANXA1有望作为肾癌无进展生存预后的肿瘤标志物。有学者在肾癌细胞系Caki-1中发现，过表达ANXA1能够上调缺氧诱导因子1A表达，促进启动子区含有缺氧反应原件的基因如血管内皮生长因子、葡萄糖转运蛋白1等表达，促进肿瘤血管新生及代谢重编程，导致肾癌术后复发、转移潜能增高［19］。

本研究进一步分析发现，肾癌组织中RRM2、ANXA1表达呈正相关，提示两者在肾癌发生发展中可能存在协同作用。有学者报道，肾癌中RRM2表达上调能够与ANXA1蛋白相互作用，稳定ANXA1的表达并磷酸化激活蛋白激酶B，促进肿瘤细胞增殖及对舒尼替尼的耐药［20］。因此，肾癌组织中RRM2可能是通过ANXA1发挥促进肿瘤进展，针对两者的靶向治疗可能成为新的肾癌治疗方案。

综上所述，肾癌组织中RRM2、ANXA1表达上调，两者表达与肿瘤TNM分期及Fuhrman分级有关。TNM分期Ⅱ ～ Ⅲ期、Fuhrman分级Ⅲ ～ Ⅳ级、RRM2阳性及ANXA1阳性表达是影响肾癌患者无进展生存预后的因素。以上研究结果有助于指导医生早期对肾癌患者预后进行评估，对于高危肾癌患者予以积极治疗及随访，以改善患者远期生存率。然而本研究样本量有限，未能对不同病理类型的肾癌患者进行分层分析，有待今后扩大样本量进行深入研究。