丙泊酚对高糖诱导足细胞损伤的干预作用及其机制

王平，汪洋，巩雪敏，薛艳

湖北省妇幼保健院成人内科，武汉430070

糖尿病肾病为常见的糖尿病并发症，治疗主要是控制血糖、血压及血脂，但治疗效果不佳［1-2］。在糖尿病肾病发病进程中，足细胞损伤起重要的推动作用［3］。足细胞损伤包括足突融合、足细胞活力降低、异常迁移及上皮—间质转化（EMT）激活等，足细胞病理改变是糖尿病肾病发生发展的关键因素，也是药物治疗的重要靶点［4-5］。丙泊酚是一种可控性好、效果佳的静脉全身麻醉药物，也可用于机械通气状态下的镇静治疗及持续重症癫痫患者的麻醉。研究表明，丙泊酚有抗炎症损伤作用，还可增强高糖环境下心肌细胞活力［6-7］，丙泊酚诱导还能有效改善糖尿病患者的高凝状态，降低血清炎症因子水平，保护细胞免疫功能［8-9］，但丙泊酚对高糖环境下糖尿病肾病足细胞的作用及其相关机制尚不清楚。核因子κB（NF-κB）与多种疾病进展密切相关。NF-κB受体激活剂可以通过促进肾小球氧化应激和促炎细胞因子的产生从而诱导糖尿病肾病发病［10］。有研究表明，丙泊酚可通过抑制NF-κB信号通路从而减轻肠上皮细胞炎症损伤［11］。2022年2月—2023年2月，本研究观察了丙泊酚对高糖诱导的足细胞损伤的干预作用，并基于NF-κB信号通路探讨相关机制，为糖尿病肾病的体外研究提供基础。

1 材料与方法

1.1 细胞与主要实验材料 人肾小球足细胞（HGPC）接种于DMEM-F12培养基（含10% FBS及1%的青霉素—链霉素），于37 ℃、5% CO2条件下培养，每隔2 ～ 3 d更换培养液，待贴壁细胞密度达80%时传代，取第4代对数期细胞用于实验，分组前以无血清培养液培养24 h。丙泊酚、D-葡萄糖、NF-κB信号通路抑制剂BAY 11-7082购自上海源叶生物科技有限公司，NF-κB信号通路激活剂Prostratin购自阿拉丁公司，胎牛血清（FBS）、DMEM-F12购自美国Gibco公司，5-乙炔基-2′脱氧尿嘧啶核苷（EdU）增殖测定试剂盒购自北京索莱宝生物科技有限公司，CCK-8试剂盒购自上海翌圣生物科技有限公司，肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素（IL）-6、IL-1β ELISA试剂盒购自泉州市睿信生物科技有限公司，RIPA裂解液购自美国ABW公司，鼠抗人NF-κB p65、p-NF-κB p65、E-钙黏蛋白（E-cadherin）、N-钙黏蛋白（N-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）、β-actin及碱性磷酸酶标记的山羊抗鼠IgG（二抗）购自美国CST公司。细胞培养箱（RYX-150型）购自天津泰斯特仪器有限公司，酶标仪（Multiskan FC型）购自美国Thermo公司，倒置荧光显微镜（MF52-N型）购自广州市明美光电技术有限公司，凝胶成像系统（Champ Gd5000型）购自北京森西赛智科技有限公司。

1.2 丙泊酚作用浓度筛选及细胞分组处理 取第4代对数期HGPC细胞，调整密度为2×105/mL，接种到96孔板。将HGPC细胞分为正常糖组（加入5 mmol/L D-葡萄糖）、高糖组（加入30 mmol/L D-葡萄糖）及丙泊酚组（加入30 mmol/L D-葡萄糖+25、50、100 μmol/L丙泊酚），干预24 h后加入CCK-8溶液10 μL孵育2 h，使用酶标仪测定450 nm波长处的光密度（OD）值，计算细胞活力［（OD高糖组或实验组-OD空白组）/（OD正常糖组-OD空白组）×100%］。正常糖组、高糖组及25、50、100 μmol/L丙泊酚组细胞活力分别为100.00% ±1.91%、30.52% ± 1.93%、40.80% ± 2.35%、65.65% ± 1.91%、83.01% ± 2.88%，高糖组细胞活力低于正常糖组，50、100 μmol/L丙泊酚组细胞活力高于高糖组，选取细胞活力最佳的100 μmol/L 丙泊酚进行后续实验。而后取对数期生长的细胞分为正常糖组、高糖组、丙泊酚组、抑制剂组、丙泊酚+抑制剂组及丙泊酚+激活剂组，正常糖组给予5 mmol/L D-葡萄糖处理；其余组给予30 mmol/L D-葡萄糖处理，丙泊酚组在此基础上给予100 μmol/L丙泊酚，抑制剂组给予1 μmol/L BAY 11-7082，丙泊酚+抑制剂组给予100 μmol/L丙泊酚和1 μmol/L BAY 11-7082，丙泊酚+激活剂组给予100 μmol/L丙泊酚和1 μmol/L Prostratin。每组设置3个重复。干预24 h后进行后续指标测定。

1.3 细胞形态观察 取各组干预24 h的细胞，倒置显微镜观察HGPC细胞形态。

1.4 细胞上清液中TNF-α、IL-6、IL-1β检测 采用ELISA法检测细胞上清液中TNF-α、IL-6、IL-1β，按试剂盒说明书操作。

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1.6 细胞迁移能力检测 取各组干预24 h的细胞，胰蛋白酶消化，离心，无血清培养基对细胞重悬，制成悬液，调整浓度为1×105/mL。将Transwell小室放入24孔板中，取200 μL细胞悬液加入Transwell上室，下室加入600 μL培养基，继续培养24 h。取出下室，弃上清，PBS洗涤3次，加入4%甲醇进行固定，晾干，0.1%结晶紫染色，10 min后，PBS洗涤3次，将Transwell小室置于显微镜上，每孔随机选5个不同区域，在显微镜下观察拍照，Image J图像分析软件计算迁移细胞数。

1.8 统计学方法 采用SPSS23.0软件。符合正态分布的计量资料以表示，多组间比较采用单因素方差分析，方差齐时，两两比较采用Dunnett′s t检验；不符合正态分布的计量资料以M（P25，P75）表示，组间比较采用秩和检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

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1.7 细胞中EMT及NF-κB信号通路相关蛋白检测 取各组干预24 h的细胞，加入细胞裂解液，置冰上30 min，之后离心取上清，按照每孔20 μg蛋白样品量上样。采用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，200 mA恒流转膜，5%脱脂牛奶封闭2 h，加入稀释后的一抗NF-κB p65（1∶2 000）、p-NF-κB p65（1∶1 000）、E-cadherin（1∶5 000）、Vimentin（1∶20 000）、N-cadherin（1∶5 000）、β-actin（1∶5 000），4 ℃孵育过夜，TBST洗涤3次。加入碱性磷酸酶标记山羊抗鼠IgG二抗稀释液，孵育2 h，弃液，TBST洗涤3次。凝胶成像系统中拍照记录，以目的蛋白条带灰度值与内参蛋白条带灰度值的比值表示目的蛋白相对表达量。

1.5 细胞增殖率测算 取各组干预24 h的细胞，EdU染色，去除细胞培养液，加入4%多聚甲醛，15 min后牛血清白蛋白（BSA）洗涤，用0.3%聚乙二醇辛基苯基醚去除BSA，静置10 min，洗涤3次；每孔加Click反应液200 μL，室温避光孵育30 min，洗涤3次；加入Hoechst染液，孵育10 min，用3% BSA洗涤3次；装片，随机选取3个视野，显微镜下拍照，用Image J软件处理图片，分析并计算细胞增殖率。细胞增殖率=阳性细胞数/总细胞数×100%。

2 结果

糖尿病肾病起病较为隐匿，易发展成为终末期肾病，严重危害患者健康。随着对糖尿病肾病的研究不断深入，足细胞生物功能障碍被认为是推动糖尿病肾病发生发展的重要原因之一。足细胞是一种高度特化的细胞，功能多样，其受到外部刺激发生损伤后出现活力降低、异常迁移及EMT等现象，最终导致疾病的发生［12］。因此，研究足细胞生物学功能可为临床治疗糖尿病肾病提供一定的理论依据。

2.2 各组细胞上清液中TNF-α、IL-6、IL-1β水平比较 见表1。

表1 各组细胞上清液中TNF-α、IL-6、IL-1β水平比较（）

表1 各组细胞上清液中TNF-α、IL-6、IL-1β水平比较（）

注：与正常糖组相比，*P＜0.05；与高糖组相比，#P＜0.05；与丙泊酚组相比，&P＜0.05。

组别正常糖组高糖组丙泊酚组抑制剂组丙泊酚+抑制剂组丙泊酚+激活剂组TNF-α 2.43 ± 0.48 9.23 ± 0.11*5.23 ± 0.10#5.01 ± 0.03#3.23 ± 0.10&7.95 ± 0.06&TNF-α 2.43 ± 0.48 9.23 ± 0.11*5.23 ± 0.10#5.01 ± 0.03#3.23 ± 0.10&7.95 ± 0.06&IL-6 4.13 ± 0.15 12.63 ± 0.31*7.62 ± 0.32#7.43 ± 0.22#5.25 ± 0.14&10.74 ± 0.41&IL-1β 3.24 ± 0.13 10.97 ± 0.19*6.27 ± 0.12#6.25 ± 0.08#3.98 ± 0.09&9.53 ± 0.21&

丙泊酚是一种临床常用麻醉药，可减轻细胞炎症，增强细胞活力。研究表明，丙泊酚联合阿托伐他汀能够抑制核苷酸寡聚结构域样受体热蛋白结构域相关蛋白3炎症小体，减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤［13］；对无抽搐电休克治疗的老年精神分裂患者使用丙泊酚复合依托咪酯进行全麻诱导安全有效，能延长脑癫痫运动发作时间，减少对认知功能的影响和不良反应的发生［14］。吴双等［15］研究发现，丙泊酚可增强缺氧复氧条件下肠上皮细胞活力。LIU等［16］研究发现，异丙酚可能通过上调肺组织SIRT1蛋白表达，通过抑制焦亡来减轻急性肺损伤。另有研究表明，丙泊酚可减轻糖尿病大鼠肾缺血再灌注损伤［17］，还可通过抑制Wnt信号诱导的EMT降低乳腺癌细胞的侵袭迁移能力［18］。

2.4 各组迁移细胞数比较 正常糖组、高糖组、丙泊酚组、抑制剂组、丙泊酚+抑制剂组、丙泊酚+激活剂组迁移细胞数分别为100.33 ± 2.52、447.67 ±5.03、262.33 ± 3.51、250.67 ± 12.74、137.33 ±5.69、351.67 ± 2.89。高糖组迁移细胞数高于正常糖组，丙泊酚组、抑制剂组迁移细胞数低于高糖组（P均＜0.05）；与丙泊酚组比较，丙泊酚+抑制剂组迁移细胞数降低，丙泊酚+激活剂组细胞迁移细胞数升高（P均＜0.05）。见OSID码图3。

2.5 各组细胞中EMT及NF-κB信号通路相关蛋白表达比较 高糖组E-cadherin蛋白表达低于正常糖组，N-cadherin、Vimentin、p-NF-κB p65蛋白表达高于正常糖组（P均＜0.05）；丙泊酚组和抑制剂组E-cadherin蛋白表达高于高糖组，N-cadherin、Vimentin、p-NF-κB p65蛋白表达低于高糖组（P均＜0.05）；与丙泊酚组相比，丙泊酚+抑制剂组E-cadherin蛋白表达升高，N-cadherin、Vimentin、p-NF-κB p65蛋白表达降低，丙泊酚+激活剂组E-cadherin蛋白表达减少，N-cadherin、Vimentin、p-NF-κB p65蛋白表达升高（P均＜0.05）。见表2。

表2 各组细胞中EMT及NF-κB信号通路相关蛋白表达比较（）

表2 各组细胞中EMT及NF-κB信号通路相关蛋白表达比较（）

注：与正常糖组相比，*P＜0.05；与高糖组相比，#P＜0.05；与丙泊酚组相比，&P＜0.05。

组别正常糖组高糖组丙泊酚组抑制剂组丙泊酚+抑制剂组丙泊酚+激活剂组p-NF-κB p65 0.23 ± 0.02 0.65 ± 0.03*0.35 ± 0.03#0.33 ± 0.02#0.19 ± 0.03&0.58 ± 0.02&E-cadherin 0.77 ± 0.02 0.21 ± 0.02*0.45 ± 0.02#0.43 ± 0.02#0.65 ± 0.02&0.26 ± 0.02&N-cadherin 0.21 ± 0.02 0.75 ± 0.02*0.35 ± 0.02#0.33 ± 0.02#0.13 ± 0.02&0.54 ± 0.01&Vimentin 0.22 ± 0.01 0.84 ± 0.02*0.46 ± 0.01#0.41 ± 0.02#0.17 ± 0.02&0.65 ± 0.01&NF-κB p65 0.73 ± 0.02 0.75 ± 0.04*0.77 ± 0.02#0.75 ± 0.02#0.73 ± 0.02&0.77 ± 0.02&

3 讨论

2.1 各组细胞形态比较 干预24 h后，正常糖组细胞胞体呈透明状，树突状，相邻突起相互交叉连接；高糖组细胞足突间交叉连接减少，胞体缩小，细胞间隔增大；丙泊酚组和抑制剂组足细胞足突较高糖组增多，胞体变大，细胞间隔缩小；丙泊酚+抑制剂组足细胞足突较丙泊酚组增多，胞体变大，细胞间隔进一步缩小；丙泊酚+激活剂组足细胞足突较丙泊酚组足突减少，胞体变小，细胞间隔进一步增加。见OSID码图1。

2.3 各组细胞增殖率比较 正常糖组、高糖组、丙泊酚组、抑制剂组、丙泊酚+抑制剂组、丙泊酚+激活剂组细胞增殖率分别为54.48% ± 0.68%、9.19% ±0.29%、32.2% ± 0.89%、31.14% ± 0.83%、48.7% ±0.65%、19.39% ± 0.62%。高糖组细胞增殖率低于正常糖组，丙泊酚组、抑制剂组细胞增殖率高于高糖组（P均＜0.05）；与丙泊酚组比较，丙泊酚+抑制剂组细胞增殖率升高，丙泊酚+激活剂组细胞增殖率降低（P均＜0.05）。见OSID码图2。

兔抗人Glut-1多克隆抗体、鼠抗人HIF-1α单抗、兔抗人p-Akt多克隆抗体及兔抗人PI3K-p85亚单位多克隆抗体(均由上海赛默飞世尔公司生产)。

观察组经护理干预后无痛、轻度疼痛例数明显多于对照组,中、重度疼痛例数明显少于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05)

目前，关于丙泊酚在糖尿病肾病中的作用鲜有报道。本研究通过高糖刺激足细胞建立体外糖尿病肾病模型，观察丙泊酚对足细胞损伤的干预作用。本研究结果显示，与正常糖组比较，高糖组细胞足突间交叉连接减少，胞体缩小，细胞间隔增大，细胞TNF-α、IL-6、IL-1β、EMT相关蛋白表达及迁移细胞数增加，细胞增殖率降低；与高糖组比较，丙泊酚组和抑制剂组足细胞足突较高糖组增多，胞体变大，细胞间隔缩小，细胞TNF-α、IL-6、IL-1β、EMT相关蛋白表达及迁移细胞数减少，细胞增殖率升高。这提示丙泊酚可维持高糖刺激的足细胞形态，促进细胞增殖，抑制细胞炎症、迁移及EMT。

NF-κB信号通路是由NF-κB、NF-κB受体及免疫调节蛋白等组成的高度保守的信号转导通路，参与细胞炎症反应、增殖及迁移等多种生物学进程［19］。研究发现，G蛋白偶联受体C5B蛋白可通过抑制NF-κB信号通路，减轻肾小球炎症反应，促进细胞增殖［20］；小檗碱可能通过AKT/NF-κB信号通路减轻高糖诱导的足细胞损伤、抑制足细胞凋亡、减弱足细胞迁移能力［21］。另有研究发现，丙泊酚可通过阻断NF-κB信号通路抑制内毒素诱导的大鼠肺泡巨噬细胞活力及炎症因子释放［22］。但丙泊酚是否可通过NF-κB信号通路影响糖尿病肾病足细胞的功能尚未可知。本研究结果显示，与正常糖组比较，高糖组细胞p-NF-κB p65蛋白表达升高；与高糖组比较，丙泊酚组和抑制剂组p-NF-κB p65蛋白表达降低；与丙泊酚组比较，丙泊酚+抑制剂组足细胞足突增多，胞体变大，细胞间隔缩小，细胞TNF-α、IL-6、IL-1β、N-cadherin、Vimentin、p-NF-κB p65蛋白表达及迁移细胞数降低，E-cadherin表达及细胞增殖率升高，丙泊酚＋激活剂组与丙泊酚+抑制剂组趋势相反。这提示丙泊酚可能是通过阻断NF-κB信号通路，维持高糖刺激下足细胞形态，促进细胞增殖，抑制细胞炎症、迁移及EMT。

在材料、生物、环境等科学领域，构效关系研究在宏观、介观及微观层面展开，本文讨论的是分子尺度的化合物构效关系。

综上，丙泊酚可维持高糖诱导的足细胞正常形态，减轻炎症反应，促进细胞增殖，抑制细胞迁移和EMT，这些作用可能与抑制NF-κB信号转导通路有关。下一步可深入探究丙泊酚干预糖尿病肾病足细胞损伤的其他作用机制，为丙泊酚的临床应用提供数据支撑。但本研究为临床前研究，尚未进行动物实验验证，且丙泊酚作为麻醉剂和镇定剂，在治疗糖尿病肾病的同时可能会由于过量使用而导致心脏或呼吸抑制等问题，其适用剂量仍需要进一步探索。