初发酮症倾向2型糖尿病与单纯2型糖尿病患者粪便样本中肠道菌群结构差异性分析

闻晓强，阿荣，池海谊，席文琪，王秀清，云庆茹，张洁

1 呼和浩特市第一医院内分泌科，呼和浩特010030；2 齐齐哈尔医学院附属第三医院呼吸与危重症医学科

酮症倾向2型糖尿病（T2DM）是一类不同于1型糖尿病（T1DM）和T2DM的混合型糖尿病综合征。酮症倾向T2DM主要以糖尿病酮症酸中毒或酮症伴严重高血糖起病，多见于体型肥胖者，大多数有糖尿病家族史，男女比例约3∶1，青中年男性较多［1］；发病时表现为胰岛β细胞功能急性暂时性可逆性损伤，大多数患者经过治疗后，β细胞功能可达到胰岛素非依赖性缓解［2］。目前临床上将酮症倾向T2DM均诊断为T2DM，但二者起病特点显著不同。现已发现肠道菌群与T1DM及T2DM的发生发展有关［3-4］。但对于肠道菌群在酮症倾向T2DM发生发展中的作用鲜有报道。肠道菌群系统非常复杂，且数量非常庞大，正常情况下肠道菌群处于动态平衡状态，维持肠道健康状态［5］。肠道菌群失衡是指菌群结构或数量发生改变，进入病理状态，从而破坏人体内环境平衡，导致疾病发生发展［6］。本研究观察并对比初发酮症倾向T2DM与单纯T2DM患者粪便样本中肠道菌群结构的差异，分析差异菌种与酮症倾向T2DM临床代谢指标的相关性，为酮症倾向T2DM防治相关研究提供新的方向。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2021年3月—8月就诊于呼和浩特市第一医院内分泌科的初发酮症倾向T2DM患者和初发单纯T2DM患者各34例，分别纳入酮症倾向T2DM组和单纯T2DM组。酮症倾向T2DM组纳入标准［7］：①符合1999年WHO的T2DM诊断标准；②首次就诊时尿酮体阳性（尿酮体++或以上）、尿糖阳性（尿糖+或以上）或血β-羟丁酸≥0.3 mmol/L，有糖尿病相关症状（多饮、多食、多尿、消瘦等）时间＜6个月且未使用任何口服降糖药物或胰岛素治疗，无明显感染或应激状态等诱因，胰岛自身抗体谷氨酸脱羧酶、抗胰岛素IgG抗体、抗胰岛细胞抗体均阴性，空腹血清C肽≥0.33 nmol/L或胰高血糖素刺激后C肽峰值≥0.5 nmol/L［8］。单纯T2DM组纳入标准［7］：①T2DM患者符合1999年WHO的糖尿病诊断标准；②首次就诊时不伴酮症或酮症酸中毒，有糖尿病相关症状时间＜6个月且未使用任何口服降糖药物或胰岛素治疗，无明显感染或应激状态等诱因。排除标准［7］：①合并有肠道感染性疾病、肝硬化、心脏疾病、高血压、肾脏疾病、自身免疫性疾病及全身或局部感染等疾病；②15 d内使用过抗生素或进食含有益生菌的药物、食物（如酸奶、含益生菌的饮料等）；③出现糖尿病并发症。酮症倾向T2DM组男26例、女8例，汉族28例、蒙古族6例；单纯T2DM组男25例、女9例，汉族30例、蒙古族4例。两组年龄、民族、身体质量指数（BMI）差异无统计学意义（P均＞0.05）；酮症倾向T2DM组甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）、空腹血糖（FPG）、糖化血红蛋白（HbA1c）水平高于单纯T2DM组（P均＜0.05）。见表1。本研究通过呼和浩特市第一医院医学伦理委员会审批，所有受试者知情并自愿签署知情同意书。

表1 两组年龄、BMI、血脂及血糖指标比较（）

表1 两组年龄、BMI、血脂及血糖指标比较（）

注：与单纯T2DM组相比，*P＜0.05。

组别酮症倾向T2DM组单纯T2DM组HbA1c（%）11.84 ± 2.36*9.50 ± 1.93 n 34 34年龄（岁）43.71 ± 11.56 49.15 ± 11.28 BMI（kg/m2）26.73 ± 4.34 27.16 ± 3.31 TG（mmol/L）3.53 ± 3.14*2.14 ± 1.35 TC（mmol/L）5.51 ± 1.85*4.56 ± 1.00 FPG（mmol/L）18.81 ± 6.22*13.23 ± 4.87

1.2 粪便样本获取及肠道菌群检测

1.2.1 粪便样本获取 嘱两组患者将粪便排在清洁袋上，随后立即装入粪便样本盒中，迅速封口，从粪便排出到装入粪便样本盒的时间短于2 min，同时粪便样本中避免混入尿液、血液等。每个样本分装5管，每管留取粪便样本250 ～ 350 mg，将粪便样本盒及5管分装瓶放入-80 ℃冰箱中储存待用。从粪便排出到冻存于冰箱的时间短于2 h［9］。

1.2.2 肠道菌群检测 用MOBIO粪便DNA提取试剂盒进行粪便样本肠道细菌DNA提取。进行PCR扩增，16 S rRNA引物序列27 F为5′-AGRGTTTGATYNTGGCTCAG-3′，1 492 R为5′-TASGGHTACCTTGTTASGACTT-3′。构建好的文库使用PacBio公司提供的建库试剂盒（SMRTbell_Template_Prep_Kit）对产物进行损伤修复、末端修复及连接接头，最终磁珠纯化回收后，由美国Pacific_Biosciences公司生产的单分子实时技术平台进行测序。将Effective_CCS序列进行聚类，获得操作分类单位（OTU）数量，进一步对OTU进行菌种注释及丰度统计。然后在界、门、纲、目、科、属、种各水平统计各样本的菌种组成，并进行α、β多样性和显著性菌种差异性分析。

1.3 统计学方法 采用SPSS25.0统计软件。符合正态分布且方差齐的计量资料以表示，采用t检验；计数资料采用χ2检验。相关性分析采用Spearman相关分析法。采用QIIME2软件进行α多样性指数分析；采用PERMANOVA_test进行β多样性指数分析；采用显著性差异标准测试（克鲁斯卡尔—沃利斯检验和两两Wilcoxon测试）和线性判别分析法进行组间差异显著菌种分析；选择Rstats包中的wilcox.test函数或STAMP软件中的Welch′st-test进行组间差异分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组粪便样本肠道菌群组成比较

2.1.1 α、β多样性分析结果 单分子实时测序共获得851 377条CCS序列，每个样本至少产生7 909条CCS序列。在97.0%的相似度水平下将Effective_CCS序列进行聚类，获得351个OTU，666 563个序列条数。酮症倾向T2DM组α多样性指数Chao1 Index、Shannon Index分别为139.52 ± 5.41、3.91 ±0.15，单纯T2DM组分别为128.57 ± 5.93、4.06 ±0.16，两组差异无统计学意义（P均＞0.05），考虑两组间菌种多样性和丰度差异较小；β多样性分析中主坐标分析法结果显示两组距离矩阵差异无统计学意义（P＞0.05），提示两组有明显聚类倾向，菌种及结构分布相似度较大。见OSID码图1。

2.1.2 肠道菌群门、属、种水平分布情况 共检测出9个门水平菌种。两组肠道菌群以厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidetes）和变形菌门（Proteobacteria）为主要优势菌（占比均超过10%）；疣微菌门（Verrucomicrobia）、放线菌门（Actinobacteria）也相对丰富。在属水平上，以粪杆菌属（Faecalibacterium）、拟杆菌属（Bacteroides）、大肠杆菌属（Escherichia）占比较高。在种水平上，主要以普拉梭菌（Faecalibacterium_prausnitzii、）大肠杆菌（Escherichia_coli）、单形巨单胞菌（Megamonasfuniformis）、普通拟杆菌（Bacteroide vulgatus）丰度较高。见表2及OSID码图2、3。

表2 两组粪便样本肠道菌群门水平分布情况（%）

2.1.3 差异菌种分析 LDA_Score柱状图及进化分支图显示绝对值大于2、差异有统计学意义的菌种。见OSID码图4、5。酮症倾向T2DM组特异性菌种主要包括副溶血链球菌（Streptococcus_parasanguinis）、韦荣氏球菌科（Veillonellaceae）、Dialister_invisus、普雷沃氏菌科（Prevotellaceae）、普氏菌（Prevotellacopri），P分别为0.048 9、0.003 1、0.027 9、0.030 5、0.034 6；单纯T2DM组特异性菌种主要包括Fusicatenibacter_saccharivorans、Anaerostipes_hadrus、乳酸明串珠菌（Leuconostoc_lactis），P分别为0.005 7、0.007 6、0.030 5。

2.2 粪便样本差异菌种与酮症倾向T2DM组临床代谢指标的相关性 酮症倾向T2DM组差异菌种韦荣氏球菌科丰度与TG呈正相关（r=0.267，P＜0.05），但与FPG、HbA1c、TC无显著相关（r分别为0.225、0.098、-0.048，P均＞0.05）；普雷沃氏菌、普氏菌与FPG、HbA1c呈正相关（r分别为0.294、0.260、0.337、0.295，P均＜0.05），但与TG、TC无显著相关（r分别为0.229、0.163、0.197、0.085，P均＞0.05）；Dialister_invisus、副溶血链球菌丰度与FPG、HbA1c、TG、TC均无显著相关（r分别为0.209、0.136、0.009、-0.149、-0.209、-0.127、0.069、-0.011，P均＞0.05）。

3 讨论

酮症倾向T2DM不同于T1DM和T2DM的发病特点，主要以糖尿病酮症酸中毒或自发性酮症起病，发病率较高，病因不明。肠道菌群可以调节宿主的能量储存与代谢，被认为与糖尿病的发生发展密切相关。酮症倾向T2DM发病与肠道菌群的相关性尚不明确。肠道菌群在机体内会受到多种因素影响，如生活环境、饮食结构、抗生素、肠道疾病及合并其他疾病等［10］。为了更加准确地研究酮症倾向T2DM患者与单纯T2DM患者肠道菌群的差异，首先排除生活环境及饮食结构因素的影响，故入组患者均选择长期居住在呼和浩特市市区的居民，且通过饮食结构表得出两组患者在饮食摄入习惯方面无显著差异。本研究结果显示，两组年龄、性别、民族、BMI差异无统计学意义，而FPG、HbA1c、TG、TC差异有统计学意义。酮症倾向T2DM除了以酮症伴高血糖起病外，其临床特征与T2DM相似，酮症倾向T2DM组FPG、HbA1c高于单纯T2DM组而两组BMI差异无统计学意义符合这一临床特点。此外，酮症倾向T2DM组高TG水平与既往研究结果一致，高水平的TG可导致机体内血浆游离脂肪酸含量增高，可能进一步诱发、加重胰岛素抵抗并促进酮体的产生［11］。

酮症倾向T2DM以酮症起病的机制可能还与精氨酸代谢异常有关。精氨酸可参与生理代谢及维持细胞功能，如刺激胰岛素分泌［12］。KASHYAP等［13］报道，典型T2DM患者与健康对照组相比血浆精氨酸水平相似。而MULUKUTLA等［12］研究发现酮症倾向T2DM患者与健康对照组相比血浆精氨酸浓度降低了25%，由此考虑酮症倾向T2DM患者精氨酸储备受损。也有研究表明，精氨酸缺乏会导致胰岛素减少［14］。由此推测酮症倾向T2DM患者的精氨酸储备及利用率降低，导致胰岛素分泌不足；同时，胰岛素分泌减少，机体糖代谢紊乱，不能利用葡萄糖供能，从而利用脂肪酸，产生了乙酰辅酶A，进而导致酮体生成增多。

本研究发现，与单纯T2DM组相比，酮症倾向T2DM组以副溶血链球菌、韦荣氏球菌科、Dialister_invisus、普雷沃氏菌科、普氏菌等为主要差异性菌种。一项研究发现，链球菌属参与分解精氨酸［15］。同时，有学者发现精氨酸脱亚胺酶系统（ADS）是一种多酶反应途径（由操控子编码），可以将精氨酸分解为鸟氨酸和二氧化碳等［16］。该系统多数存在于原核生物中，平时处于非表达状态。一些细菌拥有一整套基因可以诱导ADS表达，其中包括副溶血链球菌。由此推测，酮症倾向T2DM组的差异菌种副溶血链球菌可能导致精氨酸减少，进而诱导了酮症的发作。有学者发现韦荣氏球菌科可以产生乙酸和丙酸［17］。乙酸是结肠中主要的短链脂肪酸，是肝脏胆固醇及脂肪酸合成的底物，高水平乙酸可促进高甘油三酯血症和高胆固醇血症的形成［18］。目前对于丙酸的作用仍存在争议，但现已证实其可以通过激活G蛋白偶联受体43或游离脂肪酸受体2，抑制脂肪分解。动物实验结果显示，丙酸能增加小鼠脂肪合成和抑制脂肪分解［19］。由此也解释了与单纯T2DM组相比，酮症倾向T2DM组中的TG、TC水平明显增高的可能原因。SERENA等［20］发现，普雷沃氏菌科（科水平）、普氏菌（种水平）可以产生琥珀酸，同时也明确指出，细胞外的琥珀酸是从存在特定肠道菌群的肠道内产生。琥珀酸可以作为合成丙酸的关键中间体，促进丙酸的合成。

本研究分析了差异菌种丰度与酮症倾向T2DM组临床代谢指标的相关性，发现酮症倾向T2DM组韦荣氏球菌科丰度与TG呈正相关，推测韦荣氏球菌科丰度增高促进了TG生成增加。而且LECOMTE等［18］的研究也表明韦荣氏球菌科与体质量及TG变化呈正相关。韦荣氏球菌科产生的乙酸会导致高甘油三酯血症。本研究结果与之基本一致。

一项研究表明，普氏菌与血糖、HbA1c呈正相关，考虑普氏菌丰度降低会导致血糖、HbA1c水平下降［19］。还有研究显示，普氏菌、普雷沃氏菌可诱导胰岛素抵抗，导致血糖、HbA1c升高［21］。本研究还发现普氏菌丰度与FPG、HbA1c呈正相关，与以上研究结论基本一致。然而，有研究表明普氏菌可通过产生的琥珀酸作为糖异生底物，或产生丁二酸激活肠道糖异生，从而改善葡萄糖耐受性及胰岛素敏感性［20］。对于以上结论差异，考虑肠道菌群之间可能存在相互作用，因此不能仅通过单菌种作用下结论，需要进一步深入研究。

研究发现，Dialister_invisus可以产生乙酸及丙酸，从而促进TG和TC生成［18］，推测Dialister_invisus与FPG、HbA1c、TG、TC存在相关性。但本研究未发现它们之间的相关性。考虑与其他研究相比，本研究入组对象含有蒙古族患者，因此可能与种族差异有关；其次，酮症倾向T2DM患者肠道菌群相对丰富，是否因为菌种之间相互作用而导致此结果，需要进一步完善菌种功能预测加以论证。对于副溶血链球菌与血糖、血脂指标的相关性，暂无明确报道，仍需进一步明确。

总之，与初发T2DM相比，酮症倾向T2DM的肠道菌群相对丰富，其肠道菌群的结构特征更容易导致酮体的生成及TG、TC的合成。由此推测酮症倾向T2DM患者肠道差异菌种可能是导致其酮症起病的原因之一。但肠道菌群系统非常复杂，仅靠几种菌种无法做出确切结论，以上结论仍需证实。粪便微生物组移植可作为未来治疗代谢疾病和胃肠道疾病的新方向［22］。饮食干预肠道菌群组成也有望作为预防代谢性疾病或其他疾病的一种选择。