急性胰腺炎小鼠胰腺和远隔脏器组织TRAF6、XIAP表达变化及其与细胞凋亡的关系

谭贞菊，周翔宇，陈霞，3

1 西南医科大学附属医院消化内科，四川泸州646000；2 西南医科大学附属医院甲状腺血管外科；3 成都医学院第一附属医院消化内科

急性胰腺炎（AP）是由多种原因引起的胰腺炎症性疾病，可表现为自限性，也可发展至多器官功能衰竭［1］。AP患者合并器官功能衰竭与胰腺坏死程度有关，坏死性胰腺炎患者的器官功能障碍严重程度与病死率呈正相关［2］。AP并发多脏器功能障碍的发病机制涉及过度炎症反应、缺血再灌注损伤、肠道细菌易位和细胞凋亡等［3］。细胞凋亡在AP发病机制中的作用也备受关注。有报道指出，细胞凋亡在急性重症胰腺炎（SAP）的发生和进展中起重要作用，是SAP多器官功能障碍和感染性并发症的重要影响因素［4］。凋亡基因的激活是AP中细胞凋亡的机制之一。此外，抗凋亡基因也可能同时被激活，这使得在AP状态下，胰腺腺泡细胞凋亡调节更为复杂［5］。既往研究已经证实了细胞凋亡在AP多器官功能障碍中的作用，但对于不同严重程度AP细胞凋亡是否存在差异研究较少。肿瘤坏死因子受体相关因子6（TRAF6）是TRAF家族成员，通过多种信号通路参与多种急性炎症性疾病［6-7］。已有研究表明，TRAF6在多种细胞凋亡介导的相关炎症过程中也发挥着关键作用［8］。凋亡抑制蛋白（IAP）是一种结构相关的蛋白质家族，可负向调节Caspase激活。X连锁凋亡抑制蛋白（XIAP）是八种哺乳动物IAP中最有效的一种，其通过抑制Caspase-3、7、9激活来阻止细胞发生凋亡。急性水肿性胰腺炎（AEP）和急性坏死性胰腺炎（ANP）主要区别在于胰腺损伤的严重程度不同，AEP可导致胰腺组织肿胀、水肿，疾病常呈自限性，预后良好；ANP是胰腺组织出现出血、坏死等损伤性改变，临床病情较重，治疗难度大，死亡风险高。AEP是ANP疾病进展过程的前期阶段，因此早期控制病情极其重要。2019年3月—2023年4月，本研究构建了AEP、ANP小鼠模型，观察胰腺和远隔脏器（包括肠、肺、肝、肾）组织中TRAF6和XIAP表达变化，并分析其与多脏器细胞凋亡的关系。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物与主要材料 雄性C57BL/10SnJ小鼠30只，4 ～ 6周龄，体质量20 ～ 25 g，在西南医科大学实验动物中心室内饲养。饲养环境温度23 ℃，12 h∶12 h光/暗循环，食水不限。本研究经西南医科大学动物保护伦理委员会批准。雨蛙素购自MCE公司，脂多糖购自Sigma公司，总RNA纯化提取试剂盒、反转录试剂盒、RT-qPCR试剂盒购自中国YEASEN公司，BCA蛋白浓度测定试剂盒购自中国碧云天公司，Caspase-3/cleaved Caspase-3、XIAP、TRAF6抗体购自cell signaling Technology公司。

1.2 动物分组及AP模型构建 将30只小鼠随机分为对照组、AEP组、ANP组，每组10只。造模前禁食禁水12 h，AEP组注射雨蛙素50 μg/kg，每小时一次，连续10 h。ANP组注射雨蛙素50 μg/kg，每小时一次，连续13 h，最后一次注射后追加注射一次脂多糖15 mg/kg。对照组注射同等体积的磷酸盐缓冲盐水（PBS）。造模后12 h，采用颈椎脱位法处死小鼠，取出组织标本。取AEP组和ANP组胰腺组织，HE染色，镜下观察到小鼠胰腺腺体明显增大、腺泡空泡化、炎症细胞浸润、明显的间质水肿伴小叶间隔扩张；AEP组胰腺HE染色显示小叶排列紊乱，小叶边缘区腺泡细胞坏死；ANP组胰腺出现点状、局灶性坏死，解剖时可见腹腔内有少量血性渗出物。上述病理检查结果判定为造模成功。

1.3 小鼠胰腺和远隔脏器组织中TRAF6、XIAP mRNA及蛋白检测

1.3.1 TRAF6、XIAP mRNA检测 每只小鼠收集50 ～ 80 mg新鲜胰腺组织，用TRIzol提取总RNA。将RNA进行逆转录，并对互补DNA进行RT-qPCR检测。TRAF6基因上游引物序列为5′-GCCGAAATGGAAGCACAG-3′，下游引物序列为5′-CAGGGCTATGGATGACAACA-3′；XIAP基因上游引物序列为5′-GTGAAGAAGCCAGATTGAA-3′，下游引物序列为5′-TGTTCTGACCAGGCACGAT-3′；β-actin上游引物序列为5′-CGTGAAAAGATGACCCAGAT-3′，下游引物序列为5′-ACCCTCATAGATGGGCACA-3′。所有样本每次实验设置3个复孔，取均值。以β-actin为内参，以2-ΔΔCt表示目的基因相对表达量。

1.3.2 TRAF6、XIAP蛋白检测 采用Western blotting法。将各组小鼠新鲜的胰腺、肠、肝、肺、肾组织，用RIPA裂解缓冲冰上裂解30 min，4 ℃ 12 000 r/min离心15 min，提取组织总蛋白。取50 μg总蛋白加样于凝胶中，80 V电泳30 min，120 V电泳1 h，然后转移至PVDF膜。使用5% BSA室温封闭PVDF膜1.5 h，TBST洗膜3次，每次10 min，加入TRAF6、XIAP一抗，4 ℃孵育过夜。TBST洗膜后，在室温下将膜用二抗孵育1 h。TBST洗膜3次，每次10 min。用蛋白质印迹专用试剂显色成像。以β-actin为内参。使用ECL Plus化学发光系统进行显影，Image J软件分析条带灰度值，计算目的蛋白相对表达量。实验重复3次，取均值。

1.4 小鼠胰腺和远隔脏器组织细胞凋亡率测算及凋亡蛋白检测 将各组小鼠的胰腺、肠、肝、肺、肾组织切片脱蜡，水化，蛋白酶工作液37 ℃孵育30 min，将载玻片置于含有200 mL的0.1 mol/L柠檬酸缓冲液的塑料瓶中，用350 W微波辐照5 min。载玻片用PBS冲洗两次，与末端脱氧核苷酸转移酶和核苷酸混合物在潮湿盒子中孵育60 min，阴性对照只添加50 μL标记溶液。孵育后PBS冲洗3次。加入50 μL过氧化物酶孵育30 min，滴加DAB工作液室温显色10 min。PBS漂洗切片3次，用苏木精染色，脱水，密封，显微镜下拍照。凋亡细胞胞核呈棕色。每项检测都设置阴性对照。显微镜拍照后用Image J软件统计阳性细胞占比。细胞凋亡率=凋亡细胞数/每个视野总细胞数×100%。采用Western blotting法检测各组小鼠的胰腺、肠、肝、肺、肾组织中的cleaved Caspase-3蛋白，方法参考“1.3.2”。

1.5 统计学方法 采用SPSS25.0统计软件。计量资料以表示，多组比较采用单因素方差分析，两组比较采用t检验。相关性分析采用Pearson相关分析法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组胰腺和远隔脏器组织中TRAF6、XIAP mRNA及蛋白表达比较 ANP组、AEP组、对照组胰腺组织中TRAF6 mRNA相对表达量分别为1.54 ±0.06、1.23 ± 0.10、0.94 ± 0.08，XIAP mRNA相对表达量分别为1.29 ± 0.06、0.56 ± 0.07、0.97 ± 0.07。AEP组胰腺组织中XIAP mRNA表达低于ANP组（P＜0.05）。ANP组胰腺、肺组织中TRAF6蛋白表达与对照组差异有统计学意义，ANP组各组织中XIAP蛋白表达高于对照组（P均＜0.05）；AEP组各组织中TRAF6蛋白表达高于对照组，AEP组胰腺、肺、肾组织中XIAP蛋白表达高于对照组（P均＜0.05）。AEP组胰腺、肠、肝、肺、肾组织中TRAF6蛋白表达高于ANP组，XIAP蛋白表达低于ANP组（P均＜0.05）。见表1。

表1 各组胰腺和远隔脏器组织中TRAF6、XIAP蛋白表达比较（）

表1 各组胰腺和远隔脏器组织中TRAF6、XIAP蛋白表达比较（）

注：与对照组相比，*P＜0.05；与ANP组相比，#P＜0.05。

组别ANP组胰肠肝肺肾AEP组胰肠肝肺肾对照组胰肠肝肺肾n5 TRAF6蛋白XIAP蛋白0.75 ± 0.03*0.38 ± 0.02 0.64 ± 0.20 0.19 ± 0.03*0.58 ± 0.08 1.01 ± 0.07*0.99 ± 0.08*1.00 ± 0.04*0.91 ± 0.12*0.99 ± 0.02*5 0.98 ± 0.07*0.77 ± 0.13*#1.10 ± 0.17*#0.98 ± 0.05*#0.98 ± 0.04*#0.47 ± 0.11*#0.77 ± 0.01#0.64 ± 0.07#0.62 ± 0.08*#0.72 ± 0.02*#5 0.26 ± 0.14 0.66 ± 0.03 0.44 ± 0.09 0.38 ± 0.06 0.54 ± 0.10 0.30 ± 0.22 0.25 ± 0.02 0.34 ± 0.10 0.37 ± 0.03 0.42 ± 0.07

2.2 各组胰腺和远隔脏器组织细胞凋亡率及凋亡蛋白表达比较 对照组胰腺及远隔脏器组织中凋亡细胞较少，AEP组和ANP组凋亡细胞均增加，AEP组凋亡细胞较ANP组明显增多（图1）。AEP组胰腺、肠、肝、肺、肾组织细胞凋亡率均大于ANP组，AEP组和ANP组胰腺、肠、肝、肺、肾组织细胞凋亡率大于对照组，AEP组胰腺、肠、肝、肺、肾组织中cleaved Caspase-3表达高于ANP组和对照组，ANP组肠、肺、肾组织中cleaved Caspase-3表达高于对照组（P均＜0.05）。见表2。

图1 各组胰腺、肠、肝、肺、肾组织细胞凋亡情况（DAB染色，×200）

表2 各组胰腺及远隔脏器细胞凋亡率、cleaved Caspase-3蛋白表达比较（）

表2 各组胰腺及远隔脏器细胞凋亡率、cleaved Caspase-3蛋白表达比较（）

注：与对照组相比，*P＜0.05；与ANP组相比，#P＜0.05。

组别ANP组胰肠肝肺肾AEP组胰肠肝肺肾对照组胰肠肝肺肾n5细胞凋亡率（%）cleaved Caspase-3 7.73 ± 1.00*9.30 ± 0.82*9.25 ± 0.93*5.14 ± 0.45*11.14 ± 3.67*0.84 ± 0.15 0.85 ± 0.02*0.64 ± 0.14 0.76 ± 0.12*0.72 ± 0.04*5 14.67 ± 0.86*#25.87 ± 2.78*#20.71 ± 0.64*#9.13 ± 1.26*#21.04 ± 2.67*#1.12 ± 0.03*#1.09 ± 0.02*#1.03 ± 0.14*#1.02 ± 0.05*#0.95 ± 0.08*#5 0.67 ± 0.06 0.65 ± 0.02 0.44 ± 0.09 0.44 ± 0.11 0.51 ± 0.03 1.33 ± 0.58 2.27 ± 1.36 2.50 ± 0.46 2.34 ± 1.10 2.53 ± 0.25

2.3 胰腺炎小鼠胰腺和远隔脏器组织组织中凋亡指标与TRAF6、XIAP表达的相关性 胰腺炎小鼠胰腺、肠、肝组织细胞凋亡率与TRAF6蛋白表达呈正相关（r分别为0.934、0.770、0.834），胰腺、肠、肝、肺组织细胞凋亡率与XIAP蛋白表达呈负相关（r分别为-0.928、-0.846、-0.973、-0.681）；胰腺炎小鼠胰腺、肠、肝、肺组织中cleaved Caspase-3蛋白与TRAF6蛋白表达呈正相关（r分别为0.797、0.973、0.478、0.441），胰腺、肝、肺组织cleaved Caspase-3蛋白表达与XIAP蛋白表达呈负相关（r分别为-0.798、-0.842、-0.846），P均＜0.05。

3 讨论

AP严重程度的调控机制目前尚未完全阐明。现有研究表明，AP状态下细胞凋亡与多器官功能损伤的发生有关［9］。本研究结果显示，随着AP病理改变的加重，多器官组织细胞凋亡的程度也有所不同。在肠、肝、肺、肾等胰腺远隔脏器均可见细胞凋亡，且AEP组细胞凋亡较ANP组更明显。然而，细胞凋亡在AEP向ANP进展中的作用及详细机制仍有待进一步研究。与远隔脏器的细胞凋亡情况类似，胰腺组织细胞凋亡与AP的严重程度也有关。在以往实验研究的重症胰腺炎动物模型中，器官组织以坏死为主，凋亡较少，而轻度胰腺炎模型坏死较轻，但凋亡程度较高［10］。已有证据表明，胰腺腺泡细胞凋亡被认为是一种保护性反应，可以减轻AP的严重程度［9］。由此推测，胰腺腺泡细胞凋亡可能有助于控制AP重症的发生发展。

细胞凋亡是一种复杂的生物学现象，它受各种调控途径的诱导，同时也受多种调控基因的影响。有许多细胞因子与细胞凋亡有关。目前普遍认为，细胞凋亡的共同途径是Caspase的激活。Caspase-3是细胞凋亡的关键执行者，是细胞凋亡信号转导过程中的核心环节。当细胞接收到凋亡信号时，胞质内的Caspase-3激活被剪切为cleaved Caspase-3活性状态，cleaved Caspase-3继续活化其下游底物如PARP、Caspase-6等，从而发挥促进凋亡的作用，因此测定cleaved Caspase-3可以反映细胞凋亡水平［11］。AP状态下一些致病因素诱导Caspase-3激活可能是胰腺细胞凋亡的机制之一。本研究结果显示，AEP组胰腺、肠、肝、肺、肾组织中cleaved Caspase-3蛋白表达高于ANP组，这种表达趋势与细胞凋亡结果相一致。

TRAF6是一种E3泛素连接酶，是肿瘤坏死因子（TNF）超家族和toll样/白细胞介素（IL）-1受体超家族的关键适配器分子。TRAF6可介导多种信号通路，激动或抑制TRAF6表达有望实现对多种相关疾病的治疗目的［12］。除了在免疫调节和肿瘤发病中的作用外，TRAF6在多种细胞凋亡介导的炎症过程中发挥着关键作用［8］。TRAF6对细胞凋亡的抑制或促进作用取决于器官和炎症刺激的类型。有研究报道，TRAF6可促进卡介苗诱导的巨噬细胞凋亡［13］。抑制或竞争性结合TRAF6可促进胶质瘤细胞、内皮细胞、人乳腺癌细胞的凋亡［14-15］。本研究结果显示，TRAF6 mRNA在AEP和ANP小鼠中的表达均被激活。但既往有研究表明，TRAF6不是在转录水平上发挥作用，而是在翻译后的蛋白水平进行对凋亡的调控［16］。也有关于AP的研究提示，TRAF6通过调节腺泡细胞凋亡在雨蛙素诱导的轻度AP中发挥胰腺保护作用［16］。这一研究结论与本研究结果类似，AEP组胰腺、肠、肝、肺、肾组织中的TRAF6蛋白表达高于ANP组，且AEP组胰腺和远隔脏器组织细胞凋亡率及cleaved Caspase-3表达高于ANP组，cleaved Caspase-3表达与TRAF6蛋白表达呈正相关，提示TRAF6蛋白可能通过诱导细胞凋亡在轻度AP进程中发挥保护胰腺的作用。

凋亡调控基因XIAP是一种E3泛素连接酶，是IAP家族中最强的凋亡抑制因子。XIAP能通过抑制Caspase和其他方式调节细胞凋亡。当抑制Caspase-3和Caspase-7活性时，XIAP的BIR2结构域与活性位点底物沟槽结合，阻断正常蛋白进入，从而阻断细胞凋亡进程。有报道显示，胰腺炎状态下，XIAP是关键的Caspase调节因子，抑制XIAP可使胰腺淀粉酶水平和NF-κB活性降低，TNF-α和IL-6释放减少，Caspases活性增加，胰腺腺泡细胞凋亡增强，坏死减少［17］。在雨蛙素诱导的大鼠胰腺炎模型中，降解XIAP可促进Caspase激活，XIAP表达与胰腺细胞凋亡及Caspase-3、7、9表达呈负相关［18］，这一结论与本研究结果一致。本研究中，与ANP组相比，AEP组胰腺及肠、肝、肺、肾等远隔脏器中XIAP蛋白表达明显下调，导致XIAP对胰腺及远隔脏器细胞凋亡的抑制作用减弱，从而引起AEP组胰腺及远隔脏器组织细胞凋亡率和cleaved Caspase-3表达上调，因此XIAP在AP中可能通过抑制胰腺及远隔脏器组织细胞的凋亡，从而影响胰腺炎的病情。

综上所述，AP小鼠胰腺和远隔脏器组织中TRAF6、XIAP表达异常，且与细胞凋亡指标存在相关性；RAF6、XIAP在AEP与ANP中的表达趋势有所差异。在AP状态下，TRAF6和XIAP对细胞凋亡具有调控作用，导致不同严重程度AP胰腺及远隔脏器组织细胞凋亡的差异，同时这种细胞凋亡差异可能影响AP的严重程度。进一步研究AP发生发展过程中RAF6、XIAP对细胞凋亡的调控作用，有望为AP治疗提供新的方向。