硅胶柱层析法分离纯化表没食子儿茶素没食子酸酯

于春刚，李小平，刘黎莎，卢晓东，李荣运，韩志武△

（1.青岛大学附属医院，山东 青岛 266555； 2.山东省青岛市妇女儿童医院，山东 青岛 266034）

儿茶素又称茶单宁，是从茶叶中分离获得的一类以2-苯基苯并吡喃为基本结构的类黄酮化合物［1］，可分为表儿茶素（EGC）、表没食子儿茶素、表儿茶素没食子酸酯（ECG）及表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）4种主要类型［2］，以EGCG 含量最高。流行病学调查和实验室研究均表明，EGCG 具有抗肿瘤、抗氧化及清除自由基等功效［3-5］。目前，EGCG 分离纯化方法主要包括高效液相色谱法、高速逆流色谱（HSCCC）法、超临界流体萃取法、柱层析分离法等［6-8］。但这些方法使用中存在设备一次性投入资金大、分离工艺周期长及最后制备所得成品数量少等问题，致使产品价格昂贵，从而给大规模分离制备儿茶素单体带来较大困难。传统的柱层析方法具有操作简便、价格经济的优点，是一条较合理可行的制备途径。本研究中采用硅胶柱层析法分离和纯化儿茶素的单体成分EGCG，考察吸脱附条件对分离的影响，并采用高效液相色谱（HPLC）法测定其含量。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1260 型高效液相色谱仪（美国Agilent 公司）；SENCO R-201 型旋转蒸发仪（上海爱郎仪器有限公司）；SHZ - D（Ⅲ）型循环水真空泵（天津华鑫仪器厂）；LXJ2X 型离心沉淀机（上海医用分析仪器厂）；BT125D 型电子分析天平（梅特勒- 托利多仪器＜上海＞有限公司）；DZF-6050型真空干燥箱（上海凯朗仪器设备厂）；玻璃层析柱（100～200 目，上海仪容玻璃有限公司）；柱层析硅胶（100～200 目，青岛海洋化工厂）；KQ500DE 型超声波清洗机（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 试药

儿茶素提取物（青岛大学药物化学教研室提供）；儿茶素对照品（批号为20100107s，含量＞95%）、EGCG对照品（含量＞98%，批号为060104），均购自杭州和田生物技术有限公司；环己烷、丙酮、乙酸乙酯、乙腈、甲醇均为色谱纯，无水乙醇、氯仿、冰乙酸、浓盐酸均为分析纯，水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 含量测定

2.1.1 色谱条件

色谱柱：Pronaos C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 µm）；流动相：A为乙腈-冰乙酸-水（9∶1.5∶89.5，V/V/V），B 为乙腈- 冰乙酸- 水（80∶1.5∶18.5，V/V/V），梯度洗 脱（0～10 min 时100%A，10～25 min 时100%A →70%A，25～36 min 时70%A，36～50 min 时70%A →100%A）；流速：1.0 mL/ min；检测波长：280 nm；柱温：35 ℃；进样量：10µL［9］。

2.1.2 硅胶预处理及装柱

先将硅胶于110 ℃烘箱中活化2 h。放至室温后，过200 目筛；取适量，用洗脱剂充分浸泡［10］。湿法装柱。预先在层析柱底部放置大小、厚度合适的脱脂棉，将浸泡好的硅胶边搅拌边缓慢倒入层析柱，使硅胶自然下沉，轻敲击柱壁，使硅胶沉积压实，再用其7～10 倍柱床体积的洗脱剂继续淋洗，调节至柱平衡。

2.1.3 溶液制备

对照品溶液：取EGCG 对照品50 mg，精密称定，用双蒸水溶解并定容至25 mL，摇匀，超声（功率450 W、频率45 kHz，下同）处理10 min，即得质量浓度为2 mg/mL的对照品溶液。

供试品溶液：取儿茶素提取物适量，加水溶解后倒入分液漏斗，再加入等量氯仿，振摇、静置，分层后取上层（水层），重复萃取2 次；合并水层后加入等量乙酸乙酯，振摇、静置，分层后取上层（脂层），重复萃取2次，合并脂层，置旋转蒸发仪上旋转浓缩，取浓缩物放入40 ℃真空干燥箱中减压干燥，得儿茶素富集物；取适量，精密称定，溶于少量洗脱剂中，超声除气泡，缓慢将样品溶液用滴管均匀地滴加于柱床表面，待样品溶液完全渗入硅胶后泵入洗脱剂进行层析，分段收集洗脱液。将上述EGCG 含量高的馏分合并浓缩后，经0.45µm 微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.1.4 方法学考察

取2.1.3项下对照品溶液及供试品溶液，按相应要求进行方法学考察。结果精密度、稳定性、重复性试验结果的RSD均小于2.0%，表明方法精密度、重复性良好，供试品溶液在室温放置24 h内基本稳定。

2.2 工艺参数优化

洗脱剂：其他条件保持不变，对不同洗脱剂进行考察。结果50%乙醇为洗脱剂时洗脱效果最好。详见表1［其中EGCG 得率（%）=儿茶素富集物层析后的EGCG的质量/儿茶素富集物中EGCG 的质量×100%；EGCG纯度（%）=EGCG峰面积/总峰面积×100%］。

乙醇体积分数：其他条件保持不变，考察乙醇不同体积分数时对EGCG 分离纯化效果的影响。结果以无水乙醇效果最好但80%乙醇效果与之基本相当，出于经济因素考虑选择80%乙醇为洗脱剂。详见表2。

表2 乙醇体积分数对分离纯化效果的影响（%，n=3）Tab.2 Effect of ethanol volume fraction on the separation and purification（%，n=3）

洗脱剂pH：其他条件保持不变，考察层析时不同pH 对EGCG 分离纯化效果的影响。结果最佳pH 为4.0。详见表3。

表3 洗脱剂pH对分离纯化效果的影响（%，n=3）Tab.3 Effect of eluent pH on the separation and purification（%，n=3）

洗脱剂流速：其他条件保持不变，考察层析时不同的流速对EGCG 分离纯化效果的影响。结果当流速为3.0 mL/min 时，EGCG 的纯度和得率均较高，且分离时间较短。详见表4。

表4 洗脱剂流速对分离纯化效果的影响（%，n=3）Tab.4 Effect of eluent flow rate on the separation and purification（%，n=3）

上样量：其他条件保持不变，考察不同上样量对EGCG 分离纯化效果的影响。结果上样量为0.4 g 时EGCG的纯度及得率均较好。详见表5。

表5 上样量对分离纯化效果的影响（%，n=3）Tab.5 Effect of sample amount on the separation and purification（%，n=3）

2.3 优化条件下EGCG 分离纯化效果

取儿茶素富集物0.4 g，精密称定，用适量乙醇溶解，经硅胶柱层析分离纯化，以80%乙醇（盐酸调pH 至4.0）洗脱液，流速为3 mL/min，收集洗脱液，将洗脱液旋转浓缩后，用水定容，按2.1.1 项下色谱条件进样测定，记录色谱图（见图1）。结果，供试品溶液色谱中，在与对照品溶液色谱相同保留时间处有相应色谱峰。采用标准曲线法进行定量计算，所得EGCG 纯度为91.14%，得率为81.79%。

1.表没食子儿茶素没食子酸酯A.对照品溶液 B.供试品溶液图1 高效液相色谱图1.Epigallocatechin gallateA.Reference solution B.Test solutionFig.1 HPLC chromatograms

3 讨论

3.1 分离方法选择

目前，分离制备儿茶素单体的方法主要有柱色谱法［11］、HPLC 法［12］、HSCCC 法［13］、吸附分离法［14］等。由于酯型儿茶素类单体的化学结构和性质很相近，要得到高纯度的儿茶素单体EGCG，采用一般的化学分离富集方法很难实现其单体的分离。现在所采用的分离方法基本是在较高纯度茶多酚的基础上，对其进行进一步的分离纯化。

赵敏等［15］以毛尖茶叶为原料，用加速溶剂萃取法提取茶多酚粗品，取得较高的粗提率。包箐箐等［16］采用HPLC 法测定4 种温州早茶样品中EGCG、EGC 的含量，结果显示被测组分的含量与其峰面积线性关系良好。刘少静等［17］采用反相高效液相色谱（RP-HPLC）法定量分析了安吉白茶中主要儿茶素类有效成分，结果EGC，EGCG，ECG 的 平 均 回 收 率 分 别 为98.80%，97.83%，99.38%。王尉等［13］采用HSCCC 法对绿茶化学成分进行分离，通过对绿茶有效部位的分段萃取和多种溶剂系统的筛选，建立了分离绿茶化学成分的HSCCC 法，分离得到的EGC，EGCG，ECG 单体化合物纯度分别为97.2%，98.8%，99.2%。从国内外已有的文献报道及专利来看，茶多酚分离纯化技术仍存在缺点。溶剂萃取法由于很多物质的极性都相似或相近，导致提取液中不仅有茶多酚，还会有其他物质，杂质较多，故要得到较纯的茶多酚就需用大量的有机溶剂进行反复精制，易造成环境污染，不符合绿色化学理念。HPLC 法制备儿茶素分离效率高，条件易控制，单体纯度高，在保持EGCG 原药效性能的前提下，产品稳定性大幅增强。但该方法设备投资大、制备量较小，生产成本较高，难以工业化推广。HSCCC 法可实现儿茶素单体的分离，但同样存在生产成本高，一次性设备投入高，制备量小的缺点，难以实现工业化、规模化生产。而传统的柱层析方法具有操作简便、价格经济的优点，为较合理可行的制备途径。

3.2 试验条件优化

EGCG 属黄烷醇类物质，极性较强，洗脱剂的极性越大，对EGCG 的分离纯化效果影响越明显，但若极性过大，所有组分可能均被带至溶剂前沿，无法分离［18］。本试验中考察了不同洗脱剂，确定乙醇的洗脱效果最优。但不同体积分数的乙醇对洗脱效果仍存在显著影响［18］，综合考虑选用80%乙醇。由于儿茶素与硅醇基氢键作用的强弱与环境的酸碱度密切相关［19-20］，故也考察了洗脱剂的pH。当pH 为2.0 或3.0 时，EGCG 的纯度和得率均较pH 为4.0 时降低，这可能是由于酸度过高导致其分子基团破坏，致使洗脱下来的馏分中EGCG 含量下降，表明EGCG 分离纯化效果受酸碱度影响较大；当pH ＞4.0时EGCG 的纯度和得率呈逐渐降低趋势，这可能是因为儿茶素在中性或碱性条件下不稳定，易被氧化降解，致使EGCG 含量降低［21］。当洗脱剂流速＞3.0 mL/min 时，EGCG 纯度及得率均较低，且洗脱剂的耗量大，色带也拖长；当洗脱剂流速＜3.0 mL/min 时，EGCG 不仅纯度和得率均较低，且分离时间长。这是由于流速过大时，两相间浓度很难均衡分配，使分离效果变差；而流速过低时，轴向扩散的影响变大，使层析效果变差［22-23］。本试验结果显示，当洗脱剂流速为3.0 mL/ min 时，EGCG 纯度及得率均为最高。平均流速为4 mL/min时，纯度及得率与平均流速为3 mL/min时基本相当，但洗脱剂的耗量增大，色带也拖长，综合考虑选择流速为3.0 mL/min为优化流速条件。随着上样量逐渐增加，由于各组分的峰形在色谱图上呈部分重叠现象，致使EGCG纯度及得率下降；上样量过大时，硅胶柱吸附饱和，EGCG纯度及得率均显著降低，达不到要求，故以一次上样量为0.4 g为佳。

经氯仿和乙酸乙酯萃取后的儿茶素富集物，再经硅胶柱层析进一步分离纯化可得到高纯度的EGCG 单体。试验通过优化EGCG 硅胶柱层析分离纯化过程中的参数进行，得到最佳工艺参数为：儿茶素富集物上样量为0.4 g，洗脱剂乙醇溶液体积分数为80%，pH 为4.0，流速为3 mL/ min。在上述条件下分离得到的EGCG 经HPLC检测，其纯度超过90%，得率超过80%。

3.3 方法评价

硅胶柱层析法具有方便、快速、生产周期短、纯化分离效果好等优点，可经济、有效地分离出高纯度EGCG单体成分。