草珊瑚多糖消炎止血和抗氧化活性研究初探

马秋婷 朱钰晨 万小光 洪滔 张鸿 刘志勇 （.江西中医药大学 南昌 330004；.江西草珊瑚科技有限公司 南昌 33009）

草珊瑚，又名肿节风、接骨木、竹节茶等，最早以“接骨草”见于《本草拾遗》［1］，是金粟兰科植物草珊瑚Sarcandra glabra（Thunb.）Nakai 的干燥全草，主要分布于长江流域以南的大部分地区，如江西、福建、贵州等地，也是闽南道地药材之一［2］。草珊瑚性味苦、辛、平，归心、肝经，具有清热凉血、解毒消斑、祛风止痛等功效［3］。现代药理学研究发现其主要有抗炎、抗氧化、抗菌、抗病毒等作用，因其毒副作用小、具有较好的消炎止痛等疗效［4］。在临床应用中具有较高的应用价值，常用来治疗感冒高热、疮疡脓肿、血热紫斑、紫癜、烧伤、 风湿痹痛、跌打损伤等疾病［5］。目前，国内以草珊瑚为主要原料生产多种中成药产品，例如草珊瑚含片、肿节风浸膏、血康口服液、肿节风片等，临床应用广泛。除药用以外，草珊瑚在我国还有悠久的食用历史，民间有用水冲泡茶饮的习俗。

草珊瑚中含有多种化学成分，主要有香豆素类、黄酮类、酚酸类、倍半萜类、大分子蛋白和多糖类等［6］。研究发现，多糖作为中药的活性物质之一，具有广泛的药理活性，因其毒副作用小、功能广泛、安全性高，被广泛关注。据相关报道，草珊瑚多糖是草珊瑚中水溶性成分，为抗免疫性血小板减少性紫癜的有效成分［7］。草珊瑚中一些酸性多糖结构也具有较好的抗炎、抗氧化活性［8］，但相关研究较少。因此，本次研究通过氧化自由基清除和大鼠足肿胀实验来验证其抗氧化抗炎能力，采用小鼠断尾止血实验验证其止血能力。

1 仪器和材料

1.1 主要材料与试剂

95%乙醇（西陇化工股份有限公司）；DPPH（源叶生物，批号：A800764）；ABTS（上海麦克林生化科技有限公司，MB3206）；抗坏血酸（Solarbio，货号：A8100）；角叉菜胶（Solarbio，货号C8830）；以上试剂纯度均为分析纯。草珊瑚饮片（江西汇中中药股份有限公司）；云南白药（云南白药集团有限公司）；阿司匹林（石药集团欧意药业有限公司）。

1.2 主要仪器与设备

水浴锅（上海跃进医疗器械有限公司，型号HH.WB22-550-11）；超声波清洗机（上海跃进医用光学器械厂，型号CQ-250A-DST）；离心机（Cence 湘仪，型号TDZ5-WS）；旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂，型号RE5205）；冷冻干燥机（美国LABCONCO 公司）；电子分析天平（北京塞多利斯天平有限公司）；纯水仪（型号Milli-Q-Zntegral 10，江西鼎技科学仪器有限公司，型号BS200S-WEI）；旋涡混合仪（海门市其林贝尔仪器制造有限公司，型号VORTEX-6）；多功能酶标仪（Thermo 公司）。

1.3 实验动物

小鼠为SPF 级昆明种雄性健康小白鼠50 只，体重18～22 g。大鼠为SPF 级雌性SD 大鼠48 只，体重200～220 g，由江西中医药大学实验动物科技中心提供，饲养在江西中医药大学实验动物科技中心SPF 级屏障系统内，环境温度为20～23 ℃、湿度45%～55%。实验动物合格证编号：SYXK（赣）2022-0002，使用许可证编号：SCXK（赣）2018-0003，受理编号：20221129004。本项目全程注意实验动物福利伦理，遵循3R 原则，项目得到江西中医药大学实验动物伦理委员会的批准。

2 方法

2.1 草珊瑚多糖的提取

参照邵佳等［9］的提取方法并稍作修改。取草珊瑚全草饮片30 g，置于圆底烧瓶中，采用水提醇沉法，按提取温度95 ℃，提取时间4 h，料液比1∶20回流提取3 次，合并滤液，抽滤，减压浓缩至体积的1/4，加入3 倍量的95%乙醇，慢加快搅，4 ℃醇沉过夜，弃去上清液，取下层沉淀，3 000 r/min 离心10 min，得多糖沉淀，冷冻干燥，即得草珊瑚粗多糖。

2.2 草珊瑚粗多糖得率的计算

2.3 草珊瑚多糖的抗氧化能力测定

2.3.1 草珊瑚多糖DPPH 自由基清除活性 用无水乙醇配置0.05 mg/mL 的DPPH 溶液。多糖样品用超纯水溶解，制成质量浓度为1 mg/mL 的多糖溶液，然后配成质量浓度为0.08、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mg/mL 的待测多糖样品溶液。取100 µL 多糖样品与100 µL DPPH 混合液，于517 nm 测定吸光度，作为样品组；测定100 µL 多糖样品与100 µL 蒸馏水混合液的吸光度，作为空白组；测定100 µL 蒸馏水和100 µL DPPH 混合液的吸光度，作为对照组。室温下避光放置20 min，于517 nm 处测定吸光度。以抗坏血酸（Vc）作为阳性对照，平行测定3 次。按照下列公式计算DPPH 自由基清除能力。

公式中A样品组：100 µL 样品液+100 µL DPPH混合液；A空白组：100 µL 样品液+100 µL 蒸馏水；A对照组：100 µL 蒸馏水+100 µL DPPH 混合液。

2.3.2 草珊瑚多糖ABTS 自由基清除活性 根据Liu等［10］的方法进行测定并稍作修改。配制7 mmol/L ABTS 和4.96 mmol/L 过硫酸钾等体积混合，在室温下避光静置12～16 h，得到ABTS 自由基储备液。然后用无水乙醇将混合液稀释至40 倍。多糖样品用超纯水溶解，制成质量浓度为1 mg/mL 的多糖溶液，然后配成质量浓度为0.08、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mg/mL 的待测多糖样品溶液。于96 孔板中，分别加入不同浓度的多糖样品溶液50 µL 与150 µL ABTS 混合液，作为样品组；以150 µL 蒸馏水替代ABTS 混合液，作为空白组；50 µL 蒸馏水与150 µL ABTS 混合液，作为对照组。避光静置20 min。在酶标仪下测定734 nm 处的吸光度，平行测定3 次，按照下列公式计算每个浓度的ABTS 清除率（%）。

公式中A样品组：50 µL 样品液+150 µL ABTS 混合液；A空白组：50 µL 样品液+150 µL 蒸馏水；A对照组：50 µL 蒸馏水+150 µLABTS 混合液。

2.4 草珊瑚体内止血实验

2.4.1 分组及给药 将小鼠随机分为5 组，分别为空白对照组，阳性组（云南白药组50 mg/kg），草珊瑚低、中、高剂量组（35、70、140 mg/kg），每组10 只。空白对照组灌胃同等体积的生理盐水，给药组分别灌胃不同浓度的草珊瑚多糖溶液，每日1次，连续6 d。

2.4.2 小鼠出血时间的测定 在第6 次给药0.5 h后，剪断小鼠尾尖（约0.3 cm），待血液自行溢出开始计时，每隔15 s 用滤纸吸去血滴，直至滤纸吸时无血停止计时，即为出血时间。

2.5 大鼠足肿胀实验

2.5.1 分组及给药 将大鼠分为6 组，每组8 只，分别分为正常对照组、模型组、阳性组（阿司匹林组）、给药组（草珊瑚多糖低、中、高剂量组）。正常对照组和模型组均灌胃同体积的生理盐水；阳性组给药剂量为50 mg/kg；给药组的低、中、高剂量分别为50、100、200 mg/kg。每日1 次，连续6 d。

2.5.2 大鼠足肿胀的测定 实验开始前，分别在每只大鼠左后足部做标记，测定大鼠未造模前的初始容积。按实验分组进行灌胃，记录灌胃时间；灌胃1 h 后，将0.1 mL 的1%角叉菜胶分别皮下注入模型组、阳性药、给药组大鼠左后足掌中间区域。分别在注入角叉菜胶0、1、2、4 h 后测定足趾容积，足肿胀度即为注射角叉菜胶后的足趾容积减去未造模前的初始容积。

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2.6 数据处理

实验数据采用SPSS 26 统计软件进行分析，各项指标采用均数±标准差（）表示，以P＜0.05 表示差异有统计学意义。本实验所用图谱均采用Graphprism 9.3.1 软件作图。

3 结果

3.1 草珊瑚多糖得率结果

根据以上提取条件，平行测定3 次，通过计算得出草珊瑚多糖的平均得率为6.31%。

3.2 草珊瑚多糖抗氧化能力

3.2.1 草珊瑚多糖DPPH 自由基清除活性 结果显示，草珊瑚多糖对DPPH 清除能力随着多糖浓度的增加而增强，当浓度在0.6～0.8 mg/mL 范围内清除能力趋于稳定，0.8 mg/mL 时，为73.97%，虽然没有达到维生素C 的清除能力，但草珊瑚多糖对DPPH 的清除能力仍较强，具有较强的抗氧化能力。见图1。

图1 DPPH自由基清除能力

3.2.2 ABTS 抗氧化能力 结果显示，草珊瑚多糖对ABTS 清除能力随着多糖质量浓度增大而增强，在一定浓度范围内，呈现剂量依赖型，当草珊瑚多糖浓度为0.8 mg/mL 时其抗氧化能力最高，对ABTS 的清除率高达88.76%，接近于维生素C 的自由基清除能力，说明草珊瑚多糖具有较强的抗氧化能力。见图2。

图2 ABTS自由基清除能力

3.3 对小鼠断尾出血时间的影响

小鼠予草珊瑚多糖灌胃后，与正常对照组相比，阳性组出血时间显著降低（P＜0.01）；草珊瑚多糖对小鼠的出血时间随着给药浓度的增加而降低，其中，与正常对照组相比，草珊瑚多糖中剂量组有显著性差异（P＜0.05），高剂量出血时间显著降低（P＜0.01），而草珊瑚低剂量组则无统计学意义。与阳性组相比，草珊瑚高剂量组虽无统计学意义，但对小鼠的出血时间低于阳性组。表明草珊瑚多糖剂量为70 mg/kg 时，具有较好的止血效果；当剂量为140 mg/kg 时，小鼠的止血效果优于阳性组。见表1。

表1 草珊瑚多糖的出血时间（，n=10）

表1 草珊瑚多糖的出血时间（，n=10）

注：与正常对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

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3.4 对角叉菜胶致大鼠足肿胀的影响

大鼠注射角叉菜胶后，分别在0、1、2、4 h测量足趾容积。其中在0、1、2 h 时，阳性组和给药组的大鼠足趾容积均有不同程度增高，但在4 h 时，足肿胀度明显降低，与模型组相比，草珊瑚高剂量组有显著性差异（P＜0.05）。草珊瑚低剂量组和中剂量组虽与模型组无统计学意义，但在注射角叉菜胶4 h 后，足肿胀度均有不同程度降低。见表2。

表2 各组大鼠致炎后不同时间足肿胀度的测量结果（，n=10） mL

表2 各组大鼠致炎后不同时间足肿胀度的测量结果（，n=10） mL

注：与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

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4 讨论

正常情况下，人体自由基产生与清除是一个动态平衡状态。一旦这种平衡被打破，会导致疾病的发生，如癌症、糖尿病、心血管疾病等［11-13］，这些疾病的发生被认为与自由基息息相关。抗氧化剂能够有效地清除自由基，使机体免受自由基的损伤，受到广泛应用。目前大多数抗氧化剂多为人工合成的，长期使用会产生副作用。因此，开发安全无副作用的天然抗氧化剂具有重要意义。本次试验以DPPH和ABTS 清除能力为指标，验证草珊瑚多糖的抗氧化作用。结果显示：不同浓度的草珊瑚多糖均可以有效清除DPPH 自由基和ABTS 自由基，其自由基清除率虽低于维生素C，但呈现剂量依赖性。当草珊瑚多糖浓度为0.8 mg/mL 时，对DPPH 的清除能力达到73.97%，对ABTS 的清除能力高达88.76%。

机体正常止血和凝血机制与血管壁、血小板、凝血因子、抗凝因子、纤溶系统及其相互之间的生理性调节和平衡息息相关［14］。在止血试验中，通过断尾法测定小鼠出血时间来评价草珊瑚多糖的止血活性。结果表明，草珊瑚多糖可显著缩短小鼠出血时间，高剂量组优于阳性对照组（云南白药），且作用效果与剂量成正相关。

草珊瑚多糖是草珊瑚主要的抗炎成分之一［15］，有研究表明通过建立LPS 诱导的RAW264.7 细胞炎症模型，验证了草珊瑚多糖的体外抗炎作用［16］。因此，本实验通过角叉菜胶致大鼠足肿胀试验建立动物急性非特异性炎症模型，以足趾容积为观察点，考察草珊瑚多糖的体内抗炎效果。结果表明，高剂量的草珊瑚多糖在注射角叉菜胶4 h 后抑制作用明显，与模型组相比有显著性差异（P＜0.05）。前人研究结果和本次研究结果均表明草珊瑚多糖具有一定的抗炎作用，可为临床应用草珊瑚多糖治疗急性非特异性炎症等疾病提供试验资料，但其抗炎作用机制有待进一步研究。

综上所述，草珊瑚多糖具有一定的抗氧化和消炎止血作用，可为草珊瑚多糖药物与功能性食品的开发提供了理论依据，或可开发成具有消炎止血活性的口腔护理用品。然而，其相关作用机制尚不明确，还需作进一步的研究和探讨。