基于16S rRNA 基因测序的四妙散加减方治疗痛风性关节炎作用机制研究

孙 益 朱学鑫 陈增超 张 宇 滕建康

痛风性关节炎是因体内嘌呤代谢出现紊乱导致血中尿酸含量升高，尿酸盐结晶体沉着在各关节滑膜或软骨组织中，从而继发关节周围炎症反应[1]，对痛风患者的身心健康和生活质量造成影响[2]。全球痛风患病率为0.1%～10%[3]，2019 年的一项研究显示，我国痛风患病率为0.03%～10.47%[4]，且呈逐年上升趋势。痛风性关节炎的具体发病机制除了遗传、生活方式、药物、疾病等主流因素外仍不完全明确。有研究发现，嘌呤代谢的各个环节以及机体的免疫状态和痛风发病的进程与肠道内的特定菌群具有密切的相关性[5-6]。本研究将结合前期临床基础，探讨痛风性关节炎患者治疗前后肠道菌群多样性的改变，为以肠道菌群为靶向进行预防和治疗痛风性关节炎提供新的临床思路和理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2020 年5 月至2022 年5 月于浙江省余姚市中医医院就诊的痛风性关节炎患者15例。本研究经余姚市中医医院伦理委员会批准（伦理编号：MR-202015）。

1.2 诊断标准 西医诊断参考2010 年《原发性痛风治疗与诊断标准》[7]，中医证候分型参考《中医病证诊断疗效标准》[8]属于湿热蕴结证。

1.3 纳入标准 （1）符合西医诊断标准，中医诊断及辨证标准；（2）性别与年龄不限；（3）体温＜38.0 ℃；（4）自愿签署知情同意书。

1.4 排除标准 （1）入组前3 个月内使用过相关的抗生素、益生元或益生菌等微生态制剂者；（2）存在肠道感染或腹痛腹胀、消化不良等消化道症状者；（3）患有心血管疾病、高血压、高脂血症、糖尿病等慢性疾病无法配合者；（4）因收集的标本在cDNA 文库构建失败无法进行数据统计者。

1.5 治疗方法 对纳入的痛风性关节炎患者进行个体特征收集，主要以访谈加记录的方式进行调研，收集研究对象基本信息、职业、饮食习惯、既往病史等个人特征。进行严格的饮食控制，限制高嘌呤食物摄入，制动休息。采用四妙散加减方进行中医辨证治疗，拟方：黄柏、牛膝、苍术各10 g，薏苡仁30 g，桂枝6 g，土茯苓15 g，威灵仙、秦艽、忍冬藤各10 g，山慈菇6 g，延胡索15 g，治疗2 周，每日1 剂，分2 次服用。

1.6 粪便样本收集与检测 在清洁环境下采集研究对象治疗前后的新鲜粪便（不少于6 g），置于无菌的标本采样管中送至本院生物实验室，在-80 ℃环境下保存待检。将治疗前的标本归为A 组，治疗后的标本归为B 组。

1.7 DNA 提取与文库构建 采用E.Z.N.A.DNA 提取试剂盒（批号20221001，美国Omega Bio-Tek）提取粪便标本DNA，并用NanoDrop2000（美国Thermo）检测DNA 浓度及其纯度，进一步检测DNA 完整性。使用通用引物338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'）和806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）对大便样本的16S rRNA V3-V4 区域进行相应的PCR 扩增（引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成）。建立20 μL PCR 反应体系：DNA 10 ng，5×FastPfu Buffer 4 μL，dNTP（2.5 mM）2 μL，正反向引物各0.8 μL，FastPfu 高保真聚合酶0.4 μL，牛血清白蛋白0.2 μL，补入双蒸水至20 μL。设定PCR 扩增的条件：95 ℃预变性3 min，95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，一共30 个循环；72 ℃延伸10 min。PCR 的产物在-20 ℃储存。凝胶电泳检测扩增后的PCR 产物进行纯化，然后溶于洗脱缓冲液中，文库构建完成。

1.8 测序与生物信息学分析 交由深圳微生太科技有限公司，采用Illumina 公司的Miseq PE300 平台对所有样本进行测序。所得到的测序数据经过barcode 接头序列拆分获得有效序列，再通过使用Qiime2 软件中的DADA2 插件对原始序列进行操作，其中包含序列的聚类去噪、拼接、去嵌合，最终生成扩增特征序列（operational taxonomic units，OTU）。获得的具有代表性的序列与核糖体RNA 的数据库（Greengenes Database）进行对比，按99%序列相似性来获取获得物种的注释信息。其中的α 多样性及β多样性分析主要用Qiime2 插件完成。

1.9 统计学方法 应用SPSS 26.0 软件进行统计学分析。符合正态分布的计量资料以均数±标准差（±s） 表示，两组间菌群α 多样性指数采用Kruskal-Wallis 方法，两组菌群β 多样性指数采用Permanova分析。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 一般资料 共收集痛风性关节炎患者15 例，均为男性，年龄22～80（50.13±15.80）岁，所有患者经治疗后诸痛风症状较治疗前明显缓解。

2.2 生物信息学分析

2.2.1 数据深度评估 两组15 例患者，治疗前后样本共计30 个，共获得原始序列2563932 条，最终可用于后期有效分析的效序列1991676 条，根据统计平均每个样本可以得到66389 条相对高质量的序列。最终评估显示，所有样本的序列数以及序列的质量良好，满足后期所需的分析要求。依据OTU（可操作分类单元）[9]设定的方法，确定特征序列。以99%相似度聚类，获得6465 个OUT。其中，A 组、B 组分别共获得3843 个、3618 个OUT。两组共有996 个OUT。见图1。

2.2.2 肠道菌群的α 多样性指数分析 采用α 多样性指数分析来确定物种组成的均匀度和丰富度，两组比较，Kruskal-Wallis 方法结果显示，A 组与B 组的Observed OTU（H=3.562，P=0.059）、Faith's PD（H=0.795，P=0.372）和chao1 指数（H=3.562，P=0.059）比较，差异无统计学意义，而Shannon 指数（H=4.563，P=0.033）比较，差异有统计学意义。见图2。

图2 Observed OTU、Shannon、Faith's PD 及chao1 指数的箱型图

2.2.3 肠道菌群的β 多样性指数分析 通过PCoA分析表明，第1 主成分的贡献度为12.5%，第2 主成分的贡献度为8.5%，虽然两组中有个别样本距离较近，但大部分A 组样本聚集在一起且与B 组样本之间距离较大。Permanova 分析显示T=1.764，P=0.005，说明两组具有差异性。见图3。

图3 β 多样性分析

2.3 两组样本肠道菌群差异分析 根据不同分类水平的物种注释测序得出各自有效序列，共获得了43个门，108 个纲，168 个目，213 个科，328 个属，183 个种。通过从门、纲、目、科、属这五个分类进行分析，并将前10 名的物种情况进行展示。

2.3.1 五种分类门、纲、目、科、属水平的菌群结构分析 门分类水平物种分析结果表明，两组样本肠道菌群主要由厚壁菌门（Firmicutes）、放线菌门（Actinobacteria）、变形菌门（Proteobacteria）、梭杆菌门（Fusobacteria）和拟杆菌门（Bacteroidetes）5 个门的微生物组成。与A 组相比，B 组含有厚壁菌门、变形菌门、拟杆菌门和梭杆菌门的比例减少，而放线菌门增多。

纲分类水平物种分析结果表明，两组样本肠道菌群主要由梭菌纲（Clostridia）、放线菌纲（Actinobacteria）、γ-变形菌纲（Gammaproteobacteria）、芽孢杆菌纲（Bacilli）、丹毒丝菌纲（Erysipelotrichi）、拟杆菌纲（Bacteroidia）、梭杆菌纲（Fusobacteriia）和红蝽菌纲（Coriobacteriia）8 个纲的微生物组成。与A 组比较，B组含有梭菌纲、γ-变形菌纲、芽孢杆菌纲、拟杆菌纲、梭杆菌纲的比例减少，而放线菌纲、丹毒丝菌纲、红蝽菌纲增多。

目分类水平物种分析结果表明，两组样本肠道菌群主要由梭菌目（Clostridiales）、双歧杆菌目（Bifidobacteriales）、肠杆菌目（Enterobacteriales）、乳杆菌目（Lactobacillales）、拟杆菌目（Bacteroidales）、丹毒丝菌目（Erysipelotrichales）、红蝽杆菌目（Coriobacteriales）、梭杆菌目（Fusobacteriales）8 个目的微生物组成。与A 组比较，B 组含有梭菌目、肠杆菌目、拟杆菌目、乳杆菌目、梭杆菌目的比例减少，而双歧杆菌目、丹毒丝菌目、红蝽杆菌目增多。

科分类水平物种分析结果表明，两组样本肠道菌群主要由毛螺菌科（Lachnospiraceae）、肠杆菌科（Enterobacteriaceae）、瘤胃球菌科（Ruminococcaceae）、双歧杆菌科（Bifidobacteriaceae）、拟杆菌科（Bacteroidaceae）、丹毒丝菌科（Erysipelotrichaceae）和梭菌科（Clostridiaceae）7 个科的微生物组成。与A 组比较，B 组含有毛螺菌科、瘤胃球菌科、肠杆菌科、拟杆菌科、梭菌科的比例减少，而双歧杆菌科、丹毒丝菌科增多。

属分类水平物种分析结果表明，两组样本肠道菌群主要由布劳特氏菌属（Blautia）、瘤胃球菌（Ruminococcus）、双歧杆菌属（Bifidobacterium）、拟杆菌属（Bacteroides）、栖粪杆菌属（Faecalibacterium）5 个属的微生物组成。与A 组比较，B 组含有瘤胃球菌科、拟杆菌属的比例减少，而双歧杆菌属、布劳特氏菌属增多。见图4。

图4 各个分组在门、纲、目、科、属水平上的相对分布情况柱形图（相对丰度前20 的物种）

2.3.2 LEfSe 差异贡献分析 根据样本分析后可得出，在A 组中，含量较高的微生物依次是拟杆菌门拟杆菌纲拟杆菌目拟杆菌科、厚壁菌门梭菌纲梭菌目梭菌科、厚壁菌门芽孢杆菌纲乳杆菌目乳杆菌科乳杆菌属（Lactobacillus）。在B 组中放线菌门（Actinobacteria）、变形菌门γ-变形菌纲假单胞菌目莫拉氏菌科不动杆菌属约氏不动杆菌（johnsonii）、厚壁菌门梭菌纲梭菌目毛螺菌科梭菌属（Clostridium）、变形菌门α-变形菌纲红杆菌目红杆菌科速生杆菌属（Celeribacter）、厚壁菌门梭菌纲梭菌目毛螺菌科梭菌属（hathewayi）、变形菌门α-变形菌纲红杆菌目红杆菌科（Rhodobacteraceae）。其中的拟杆菌门拟杆菌纲拟杆菌目拟杆菌科和放线菌门的差异最显著，可能是四妙散加减方治疗痛风性关节炎的关键菌群。见图5。

图5 LEfSe 分析LDA 柱形图和cladogram 图

2.4 肠道菌群的变化情况对机体的代谢影响 使用KEGG 数据库进行预测，其中包含6 个大类的代谢通路：代谢、细胞进程、遗传信息处理、人类疾病、生物体系统和环境信息处理，每一类的代谢通路又可以分成多个等级。运用KEGG 数据库菌群对代谢的功能预测结果表明，与碳水化合物的代谢最相关，其次是氨基酸代谢；进一步对氨基酸代谢的功能预测结果表明，与缬氨酸、异亮氨酸和亮氨酸生物合成）最相关，其次是D-丙氨酸代谢，再次是D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢。见图6。

图6 预测得到的KEGG.L1-L3 的百分比组成柱形图

3 讨 论

中医药在治疗痛风性关节炎中具有一定优势，特别是以四妙散为代表的中药方剂被广泛应用于临床[10]。虽然当前对该药方的治疗机制研究比较丰富，但是仅局限在降尿酸、控制炎症反应等途径，所以前期的研究均不能完美阐释其机制，而肠道菌群的微生态平衡与人体宿主之间存在着某种复杂的动态平衡，已被证实为人体的第二隐藏器官，另有研究证实痛风性关节患者与正常人群相比，痛风患者的肠道菌群显著失调，主要表现为保护性微生物群落缺乏，专性厌氧菌、革兰氏阳性球菌和不同种类的念珠菌水平升高[11]。

本研究采用16S rRNA 基因测序技术的分析方法，将痛风患者治疗前后的肠道菌群特点进行比较分析，通过α 多样性和β 多样性评估痛风患者治疗前后菌群变化的特点，治疗前与治疗后的α 多样性中的Observed OTU、Faith's PD 和chao1 指数无统计学差异，而Shannon 指数有统计学差异，β 多样性评估中的PCoA 分析表明两组具有差异性，说明痛风患者治疗前后的肠道微生物结构存在一定的差异性，这种差异性可提示四妙散加减方的作用机制可能与肠道菌群的改变有关，同时综合该方剂前期相关的研究结论可认为，四妙散加减方治疗痛风性关节炎可能通过一种综合化的干预机制来实现。

进一步从LDA 差异贡献分析中可以发现，四妙散加减方对于痛风治疗前后拟杆菌科和放线菌门的差异最显著，相关研究表明，拟杆菌科影响人体营养吸收及代谢，参与蛋白质分解过程中有毒产物的释放，其也是促进炎症发生的机会病原体，某些菌种更是人和动物的重要致病菌[12]，如celatum、fragilis、Enterobacteriaceae 等，该类菌群在治疗前的比例相对较高，这可能与痛风的发生具有一定相关性。而治疗后放线菌门比例最高，该门类细菌中含有益生菌最多，是人体的优势肠道菌群，各种代谢性疾病的发生与该类细菌量减少具有一定的相关性。有研究证实该类菌有助于改善消化功能、控制血糖、降低血脂、提高免疫力等，并且被认为具有巨大的药理学潜力，对于抗氧化、调节代谢等方面具有重要作用[13]。本研究中采用四妙散加减方后该菌群的比例提升，进一步提示四妙散加减方能提高体内益生菌（distasonis、aldenense）的比例；其他的相关报道也证实这一假设，如四妙散组成中的牛膝可改变断奶仔猪肠段中的大肠杆菌、乳酸菌、肠球菌等数量[14]；薏苡仁对于肠道内双歧杆菌及乳杆菌的数量具有上调作用，同时可明显改善肠胃微生态[15]；黄柏能增加肠球菌及双歧杆菌的含量，降低肠道内白细胞介素-6、白细胞介素-8、肿瘤坏死因子-α 等炎症因子的表达[16]；苍术对小鼠肠道内的放线菌门、拟杆菌门、厚壁菌门都具有调节作用[17]。由此可见四妙散加减方对于肠道菌群的调节具有一定的靶向作用。

本研究也存在一定局限性，样本量相对较少，采用的16S rRNA 基因测序高通量分析技术在分析肠道菌群方面也存在一定的不足，不能在细菌种水平分析治疗前后肠道菌群差异。后续需更大样本量、多中心、更先进的手段如全基因组测序研究来进一步明确痛风患者治疗前后人肠道菌群的差异，从而揭示中医药基于肠道菌群治疗痛风的作用机制。