基于网络药理学探究补阳五汤治疗脊髓损伤的作用成分和机制

李 杰 周邦瑜 马彦博 李绍波

在我国脊髓损伤发病率高达50.484 人次/百万人，且具有较高的致残性[1]。目前主要通过大剂量激素冲击治疗，但因为严重不良反应，已不推荐[2]。补阳还五汤记载于清代医学家王清任著作的《医林改错》中，共由7 味中药（黄芪、赤芍、归尾、川芎、地龙、桃仁和红花）组成，是益气活血的代表药方[3]。有学者将其应用到脊髓损伤治疗中取得良好效果[4]。然而，由于补阳还五汤成分多、机制复杂，其治疗脊髓损伤的具体机制尚不清楚。因此，本文利用网络药理学和分子对接等现代研究技术，揭示补阳还五汤治疗脊髓损伤的作用成分和机制。

1 材料与方法

1.1 补阳还五汤的作用成分和对应靶点的筛选及校正 通过（https://www.tcmsp-e.com/，TCMSP）结合文献查阅，收集补阳还五汤七味中药作用成分及其靶点蛋白信息。口服生物利用度（OB）≥30%且类药性（DL）≥0.18 则认为该成分具有药物活性。将药物活性成分对应的靶点蛋白信息与数据库UniProt（https://www.uniprot.org）中的蛋白信息进行匹配校正。

1.2 “中药-成分-靶点”网络的构建 在Cytoscape（https://cytoscape.org/）软件中导入中药、成分和靶点信息，构建“中药-成分-靶点”网络，然后使用软件插件工具（Network Analyser）计算各节点的重要参数，获取药物主要的作用成分。

1.3 脊髓损伤的治疗靶点筛选和韦恩图构建 以“spine core injure”为关键词，在GeneCards（https://www.genecards.org/）数据库中进行检索，通过参数“relevance score”的中位数进行脊髓损伤靶点筛选。取标准化处理后的补阳还五汤作用靶点与脊髓损伤疾病靶点的交集，使用（http://www.bioinformatics.com.cn）在线网站构建交集靶点韦恩图。

1.4 蛋白质互作网络构建和关键靶点筛选 将“1.3”获得的交集靶点按照物种“人类”，中等置信度≥0.9，导入STRING 库（https://string-db.org/）。检索后将文件导入Cytoscape 软件构建蛋白质-蛋白质可视化网络，使用网络分析工具进行拓扑。根据“degree”值（度值）大小筛选关键靶点，以图形大小表示度值的大小，进行展示。

1.5 GO 功能及KEGG 通路富集分析 在DAVID（https://david.ncifcrf.gov/）中导入交集靶点，依次选择“官方基因标志”“基因列表”“人类”，进行GO 生物过程（BP）、细胞组分（CC）、分子功能（MF）和KEGG通路注释，并绘制可视化的气泡图（http://www.bioinformatics.com.cn）。

1.6 主要作用成分与核心靶点蛋白的分子对接 从数据库（https://www.rcsb.org/）下载核心靶点蛋白，应用AutoDockTools（https://autodock.scripps.edu/）对其中的配体分子进行提取，去掉水分子，加入氢原子。使用PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）数据库获取主要作用成分的三维结构。通过半柔性对接，以核心靶点蛋白为受体，以主要作用成分为配体，利用Pymol（https://pymol.org/2/）展示对接结果。

2 结 果

2.1 补阳还五汤作用成分及相关靶点信息 经TCMSP 数据库筛选化合物：赤芍14 个，川芎6 个，当归2 个，红花16 个，黄芪17 个，桃仁19 个。地龙在TCMSP 中未录入，通过查找文献得到其有效成分1个。去掉重复和缺乏有效靶点信息的化合物后，共获得63 个药物作用成分及260 个相对应靶点蛋白。

2.2 “中药-成分-靶点”网络 网络共有330 个节点（7 个中药，63 个作用成分，260 个靶点）和1296 条边，两节点间的连线越多，表示相互关系越紧密。其中菱形代表靶点，圆形代表中药，八边形代表中药活性成分，三角形代表药物共有活性成分（见图1）。根据网络分析，度值前10 的是：槲皮素、山奈酚、β-谷甾醇、黄芪素、木犀草素、7-甲氧基异微凸剑叶莎醇、刺芒柄花素、异鼠李素、常春藤皂苷元、黄芩苷。见表1。

图1 “中药-成分-靶点”网络

2.3 补阳还五汤治疗脊髓损伤靶点 筛选得到752个脊髓损伤疾病相关靶点。共有106 个交集靶点，见图2。

图2 补阳还五汤治疗脊髓损伤韦恩图

2.4 蛋白质互相作用网络的构建和关键靶点的筛选

取“2.3”中的交集靶点构建蛋白质相互作用的网络图，共有106 个节点（靶点蛋白）和498 条边（蛋白相互作用）。选取度值排名前20 关键靶点在内圈展示，分别是TP53、AKT1、MAPK1、RELA、TNF、CTNNB1、IL6、ESR1、MAPK14、FOS、EGFR、MYC、RB1、IL10、MAPK8、CCND1、HIF1A、CDKN1A、CAV1、AR。见图3。

TCMSP MOL000098 MOL000422 MOL000359 MOL002714 MOL000006 MOL000378 MOL000296 MOL000354 MOL000392 MOL002776成分代号B2 B1 A3 A1 HH5 HQ9 B3 HQ3 HQ5 A2化合物名称quercetin kaempferol beta-sitosterol baicalein luteolin 7-O-methyli somucronulatol hederagenin isorhamnetin formononetin Baicalin中文名称槲皮素山奈酚β-谷甾醇黄芪素木犀草素7-甲氧基异微凸剑叶莎醇常春藤皂苷元异鼠李素刺芒柄花素黄芩苷OB（%）46.43 41.88 36.91 33.52 36.16 74.69 36.91 49.6 69.67 40.12来源黄芪、红花黄芪、红花赤芍、当归、红花、桃仁赤芍、红花红花黄芪黄芪、桃仁黄芪黄芪赤芍、红花DL 0.28 0.24 0.75 0.21 0.25 0.3 0.75 0.31 0.21 0.75度值307 123 118 72 58 46 46 40 40 35

图3 补阳还五汤治疗脊髓损伤的关键靶点

2.5 GO 功能和KEGG 通路分析 对排名前20 的关键靶点进行GO 功能分析，共获得GO 条目304个。其中BP242 个，CC18 个，MF44 个。BP 显示，关键靶点主要与基因表达、转录、凋亡、MAPK 信号、对活性氧反应等过程相关；CC 显示，关键靶点构成大分子复合物、转录因子复合物，广泛分布细胞核、细胞质、细胞膜及细胞外基质、线粒体等部位；MF 显示，关键靶点可影响蛋白质、脱氧核糖核酸、转录因子以及一氧化氮合酶和转录激酶活性。见图4。

通过KEGG 分析得到信号通路128 条，将与脊髓损伤明显无关的癌症和病毒感染等通路弃去，根据“count 值”排序，取前15 条通路绘制气泡图（见图4）。结果显示，多数基因富集在丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）、叉头框转录因子（FoxO）、磷酸肌醇3-激酶（PI3K）-蛋白激酶B（Akt）、Toll 样受体（TLRs）、肿瘤坏死因子（TNF）等通路，而且排名前4 的核心靶点TP53、AKT1、MAPK1、RELA 均被富集。见表2。

2.6 分子对接结果 槲皮素、山奈酚和β-谷甾醇是补阳还五汤排名前3 位的主要成分，TP53、AKT1、MAPK1、RELA 是补阳还五汤治疗脊髓损伤的核心靶点，将二者进行两两对接，共得到12 组配体-受体对接结果，结果见表3。图5 展示部分对接结果的三维图。

3 讨 论

本研究表明，槲皮素、山奈酚、β-谷甾醇是补阳还五汤的主要作用成分。槲皮素可以激活PI3K/Akt通路调控自噬，改善脊髓损伤后大鼠运动功能[5]。除此之外，槲皮素也可抑制Toll 样受体4（TLR4）-核因子-κB（NF-κB）信号通路减轻脊髓损伤大鼠的炎症反应和细胞凋亡，促进运动功能恢复和减轻脊髓空洞形成[6]。山奈酚可以抑制MAPK 和c-Jun 氨基末端激酶（JNK）磷酸化，减少小胶质细胞活化和氧化应激[7]。β-谷甾醇可抑制p38 蛋白激酶（p38 MAPK）、细胞外调节蛋白激酶（ERK）、NF-κB 通路，减少炎性介质白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNFα）、环氧化酶-2、诱导型一氧化氮合酶的表达[8]。

TP53、AKT1、MAPK1、RELA 在补阳还五汤治疗脊髓损伤中起到核心作用。脊髓损伤后，小胶质细胞外泌体可通过调控p53 蛋白参与神经元凋亡和轴突再生[9]。和TP53 一样，AKT1 也可调控细胞存活和凋亡，抑制AKT-哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）通路，减轻脊髓损伤大鼠炎症反应和神经元调亡，减少胶质瘢痕[10]。另外，通过对脊髓损伤模型兔行减压手术后发现，由脊髓损伤引起的p-AKT 蛋白的上调被逆转，兔的运动功能有了恢复趋势[11]。脊髓损伤后MAPK1 表达显著上调，抑制MAPK1 可以促进大鼠运动恢复[12]。RELA 是NF-κB 家族的重要成员，又名p65，在调节炎症、免疫应答等活动中起重要作用。抑制NF-κB p65 通路可减少炎性因子TNF-α、IL-1β 和IL-6 释放，促进脊髓损伤大鼠运动恢复和轴突再生[13]。

Gene MAPK8，MYC，MAPK1，AKT1，FOS，MAPK14，TNF，TP53，RELA，EGFR IL6，CDKN1A，CCND1，MYC，MAPK1，AKT1，TP53，RELA，EGFR IL10，IL6，CDKN1A，MAPK8，CCND1，MAPK1，AKT1，MAPK14 EGFR IL6，MAPK8，MAPK1，AKT1，FOS，MAPK14，TNF，RELA IL6，MAPK8，MAPK1，AKT1，FOS，MAPK14，TNF，RELA KEGG 通路MAPK PI3K-Akt FoxO Toll 样受体TNF Count 10 9988

KEGG 分析显示，主要核心靶点富集在MAPK、PI3K-Akt、FoxO、TLRs、TNF 等通路。MAPK 是调控炎症、氧化应激和凋亡的信号通路。甘草苷治疗脊髓损伤大鼠，可显著降低损伤组织中的磷酸化p38 MAPK 表达，减少中性粒细胞浸润和神经元的调亡[14]。PI3K/Akt 具有调控细胞凋亡、增殖、血管生成以及向体内稳态迁移等功能。抑制PI3K/Akt 通路可促进骨髓间质干细胞迁移，有利于脊髓损伤后神经功能恢复[15]。FOX 家族成员的表达与脊髓损伤后的肌肉萎缩密切相关[16]，另外调节叉头转录因子3a（FoxO3a）可减轻脊髓损伤后的调亡水平[17]。TLRs 与TNF 通路均与炎症表达相关。临床分析表明，脊髓损伤患者血清中TLR4、NF-κB、TNF-α、白细胞介素-12（IL-12）水平均高于健康体检者[18]。

综上所述，本研究通过网络药理学和分子对接方法，证明补阳还五汤中主要作用成分槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇通过干预TP53、AKT1、MAPK1、RELA等靶点，通过MAPK、PI3K-Akt、FoxO、TLRs、TNF 等信号通路来实现对脊髓损伤的治疗作用，为下一阶段的深入研究提供参考依据。