孝顺竹中笋箨衰老相关WRKY转录因子的鉴定与分析

却 枫,刘庆楠,查若飞,魏 强

(南京林业大学,南方现代林业协同创新中心,南京林业大学竹类研究院,江苏 南京 210037)

衰老是植物发育的一个阶段,是细胞、组织、器官生长完成后的转分化阶段,这个阶段完全依赖于细胞的活力和特定基因的表达。植物的衰老是一个复杂的发育过程,涉及组织退化和养分循环[1-2]。参与植物衰老进程调控的基因也是大量的[2]。在拟南芥(Arabidopsisthaliana)、水稻(Oryzasativa)、小麦(Triticumaestivum)等植物中,大量转录组数据分析表明,在衰老过程中涉及数千个包括转录因子在内基因的有序表达[3-4]。在这些转录因子中, WRKY转录因子在调控植物叶片衰老进程中扮演重要的角色。据统计,WRKY转录因子家族是拟南芥中参与衰老进程调控的第二大转录因子家族[5]。

WRKY转录因子家族是植物中一类非常重要的调节因子[6]。WRKY转录因子蛋白序列中至少包含一个高度保守的WRKYGQK结构域和一个锌指结构(通常为CX4-5CX22-23HXH)[6-7]。根据基因结构中WRKY保守域或锌指结构数量的差异,可以将WRKY基因家族分为Ⅰ、Ⅱ a—e和Ⅲ 3大类[8]。Ⅰ类WRKY蛋白含有2个WRKY保守域和1个CX4-5CX22-23HXH(C2H2)类型的锌指结构;Ⅱ a—e类WRKY蛋白只含有1个WRKY保守域和1个C2H2型的锌指结构;Ⅲ类WRKY蛋白也只有1个WRKY保守域和1个锌指结构,但其锌指结构与Ⅰ和Ⅱ类WRKY不同,为CX7CX23HXC(C2HC)型[8]。在植物叶片衰老的转录调控网络中,WRKY转录因子扮演着重要的角色。转录因子AtWRKY6、AtWRKY75和AtWRKY45被报道是拟南芥叶片衰老的正调控因子。其中,AtWRKY6通过激活一种在叶片衰老过程中特异性表达的蛋白激酶SIRK,来调控叶片的衰老[9-10]。AtWRKY45被认为是赤霉素(GA)介导的信号通路的一个关键组分,通过与RGA类似基因相互作用调控由年龄变化引发的叶片衰老[11]。AtWRKY75也被认为通过赤霉素途径调控年龄触发的叶片衰老[12-13]。AtWRKY70和AtWRKY54被报道是拟南芥叶片衰老的负调控因子。AtWRKY70和AtWRKY54都是Ⅲ类WRKY转录因子,在调控叶片衰老过程中协同作用,并依赖水杨酸信号途径[14]。AtWRKY57则作为茉莉酸诱导叶片衰老的阻遏因子在叶片衰老中起调控作用[15]。AtWRKY53、AtWRKY22、AtWRKY30、AtWRKY40、AtWRKY18等转录因子也都被报道参与调控拟南芥叶片的衰老进程[16-21]。

笋箨是竹笋的一个重要器官,通常由箨叶与箨鞘及箨鞘附属结构如箨舌与箨耳等组成,是竹子3类含鞘器官中的1种。笋箨是竹类植物分类的依据之一,目前关于笋箨的研究主要集中在形态学观察与解剖学研究[22-23]。最新的研究发现孝顺竹(Bambusamultiplex)的笋箨是笋期节间生长的一个重要碳源,并且笋箨和节间可能是源与库的关系。衰老是植物对源器官与库器官之间通信的一种反应,是对植物衰老机制的多种解释中的1种[24]。在小麦、玉米(Zeamays)等植物中,库需求的减少会加速作为源器官的叶的衰老[25-26]。然而关于孝顺竹笋箨衰老的调控机制还不清楚。本研究鉴定并分析孝顺竹笋箨衰老过程中涉及的WRKY转录因子及其可能的作用机制,为了解笋箨的衰老机制提供参考。

1 材料与方法

1.1 孝顺竹WRKY转录因子的鉴定

孝顺竹目前没有完整的参考基因组数据,本研究以孝顺竹笋箨的3代全长转录组数据(SRR9831235;https://sra-downloadb.be-md.ncbi.nlm.nih.gov/sos5/sra-pub-zq-16/SRR009/9831/SRR9831235/SRR9831235.lite.1)为参考进行笋箨中WRKY转录因子的鉴定。通过HMMER软件[27],以WRKY的隐马可夫模型(PF03106)为输入文件在孝顺竹的3代全长转录组数据库中进行WRKY转录因子的初步筛选;初步筛选获得的候选WRKY进行Pfam保守域分析,剔除保守域缺失的候选基因;最后对获得的候选BmWRKY进行去冗余处理,相同的序列只取最长的作为候选基因。

1.2 BmWRKY转录因子分类和结构域分析

通过构建系统发育树对候选BmWRKY进行亚家族分类。拟南芥、毛竹和水稻中的WRKY转录因子和候选BmWRKY的蛋白序列共同用于构建系统发育树。构建系统发育树的软件为RaxML-ng,构建方法为最大似然法,建树使用的模型使用ProTest软件进行计算[28-29]。使用MEME在线工具进行BmWRKY序列中保守域的鉴定。蛋白质等电点和分子质量使用在线工具ExPASy(https://web.expasy.org/compute_pi/)进行计算。

1.3 衰老相关BmWRKY转录因子的鉴定和表达趋势分析

在拟南芥和水稻中WRKY转录因子作为一类重要的调控因子,其生物学功能备受关注并被广泛研究。在拟南芥中,已有多个WRKY转录因子被确认参与叶片衰老的调控。在水稻中,只有很少的WRKY被确认参与叶片衰老的调控[30-32]。为了鉴定孝顺竹中衰老相关的WRKY转录因子,本研究将拟南芥中衰老相关WRKY与候选BmWRKY的蛋白序列进行比对,并进行系统发育树的构建。

为了分析候选BmWRKY在笋箨发育过程中的表达趋势,本研究从NCBI数据库下载了笋箨发育相关的2代转录组数据(SRP216291),以孝顺竹笋箨3代全长转录组序列为参考基因组进行转录组相关分析。通过hisat2比对软件[33]及cufflinks软件[34]计算候选BmWRKYs在孝顺竹笋箨不同发育时期的FPKM(fragments per kilobase of exon model per million mapped fragments,每千个碱基的转录每百万映射读取的片段)值,并进行候选BmWRKYs在孝顺竹笋箨不同发育时期的表达模式分析。

1.4 试验材料

于2021年9月在南京林业大学校园内(118°48′E,32°01′N),对不同时期孝顺竹笋箨进行取样。第3节间长度分别为10 cm,20～25 cm和30 cm的孝顺竹为采样目标。根据Wei等[35]的研究,孝顺竹第3节间不同长度代表节间的不同发育时期,长度为10 cm左右代表第3节间处于快速生长期;长度为20～25 cm代表第3节间处于生长减缓期早期;长度为30 cm左右代表第3节间处于生长减缓的后期。笋箨衰老出现在节间生长减缓之后[24],故本实验以此为发育时期采样的依据,每个时期取5个生物学重复,分别标记后置入液氮冻存。

1.5 叶绿素含量和膜离子渗透率测定

笋箨叶绿素的提取与含量的测定采用丙酮乙醇混合浸提法[36]。膜离子渗透率使用电导仪进行测定,测定方法参考Welti等[37]的测定方法。

1.6 相对表达量分析

不同发育时期笋箨的总RNA使用RNA提取试剂盒提取(天根生物技术有限公司,北京)。使用HiScript© Ill 1st Strand cDNA Synthesis Kit(诺维赞生物科技有限公司,南京)将RNA反转录为cDNA。用于实时荧光定量PCR(qRT-PCR)试验的cDNA为稀释18倍后的cDNA。核苷酸束结合蛋白基因(NTB)被选择作为内参基因。使用ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix试剂盒,按照操作说明进行qRT-PCR实验。引物序列见附表1(http://nldxb.njfu.edu.cn)。使用2-△△CT法进行基因相对表达量的检测[38]。

2 结果与分析

2.1 孝顺竹WRKY转录因子的鉴定

使用Hmmer软件在孝顺竹笋箨的3代转录组数据库中进行WRKY转录因子筛选,初次筛选获得125个候选BmWRKY。对候选基因进行结构域分析及去冗余处理,最后共获得83个候选BmWRKY转录因子,并按照BmWRKY1—BmWRKY83进行命名[表1和附表2(http://nldxb.njfu.edu.cn)]。83个候选BmWRKY转录因子的蛋白序列长度为119～1 751个氨基酸,平均长度为1 388个氨基酸(表1)。等电点和蛋白质分子质量分别为5.23～10.45和13.54～185.25 ku(附表2)。在83个BmWRKY转录因子中,有74个WRKY蛋白的保守域序列为WRKYGQK。其余的BmWRKY蛋白的保守域序列为WRKYGKK、WRKYGQM或WRKYGHK。

表1(续)

表1(续)

图1 BmWRKYs系统发育分析及分类Fig. 1 Polygenetic analysis and classification of BmWRKYs

2.2 孝顺竹WRKY转录因子结构和分类

图2 BmWRKY转录因子保守结构域分析Fig. 2 Analysis of conserved motifs in BmWRKYs

在植物中,WRKY转录因子家族可分为Ⅰ、Ⅱ a—e和Ⅲ 3大亚家族。为了对候选BmWRKY转录因子进行分类,本研究将拟南芥、水稻、毛竹中的WRKY家族成员的蛋白序列与孝顺竹笋箨中候选WRKY的蛋白序列共同构建系统发育树见图1。由图1可知,83个WRKY转录因子在亚家族Ⅰ、Ⅱ a—e和Ⅲ中都有分布。被鉴定为Ⅰ类的BmWRKY转录因子最多,为39个。Ⅱ a、Ⅱ b、Ⅱ c、Ⅱ d、Ⅱ e亚家族分别有2、16、11、12和2个BmWRKY成员。仅有1个BmWRKY被鉴定为Ⅲ类WRKY转录因子。WRKY保守域的数量和锌指结构的类型是WRKY转录因子亚家族分类的重要依据。被分类为Ⅱ a、b、d和e类的WRKY转录因子都含有1个WRKYGQK保守域和1个C-X5-C-X23-H-X1-H (m=5,n=23)型的锌指结构。在Ⅱ c类BmWRKY中,除BmWRKY1、BmWRKY5和BmWRKY30的WRKY保守域序列为WRKYGKK,其余的都为WRKYGQK,锌指结构类型为C-X4-5-C-X23-H-X1-H (m=4/5,n=23)。在被分类为Ⅰ类的WRKY转录因子中,除BmWRKY43、BmWRKY62、BmWRKY67、BmWRKY71、BmWRKY72、BmWRKY73、BmWRKY77和BmWRKY81只有1个WRKY保守域和C2H2(C-X4-C-X22-23-H-X1-H;m=4,n=22/23)类型的锌指结构,其余的都含有2个WRKY保守域和C2H2类型的锌指结构。Ⅲ类WRKY转录因子也只有1个WRKY保守域和锌指结构,但锌指结构的类型有别于其他亚家族。此处,BmWRKY21是唯一被分类为Ⅲ类的WRKY转录因子,其锌指结构为C-X7-C-X20-HCEH (m=7,n=20)(表1)。对不同亚家族BmWRKY的保守结构域(motif)进行分析,发现motif 1和2存在于所有的BmWRKY序列中,是关键的保守结构域。被划分为Ⅰ类的BmWRKY具有相似的motif组成。例如,大部分Ⅰ类BmWRKY都含有motif1、2、3和4。Motif5只存在于部分Ⅰ类BmWRKY中。在Ⅱ d类中,所有的BmWRKY都只含有motif1和motif2。在Ⅱ b类中,所有的BmWRKY都含有motif1、2、3和7。唯一的Ⅲ类BmWRKY,BmWRKY21只含有motif1和 2(图2)。

2.3 孝顺竹中衰老相关WRKY转录因子的鉴定及表达趋势分析

在拟南芥中,多个衰老相关的WRKY转录因子已被鉴定出来,相关WRKY的转录调控机理研究也已取得实质性进展。本研究对已报道的衰老相关AtWKRYs基因进行了整理(表 2),并将其蛋白序列与BmWRKY蛋白序列一起构建系统发育树来搜索孝顺竹笋箨中衰老相关的WRKY转录因子(图3)。

表2 拟南芥中衰老相关的WRKY转录因子

通过系统发育树分析,共获得31个衰老相关的候选BmWRKY。为了进一步验证候选BmWRKY与孝顺竹笋箨衰老的关系,对候选的31个BmWRKY在笋箨发育的6个时期中的表达趋势进行了分析。孝顺竹竹笋达到一定高度时,从竹笋底部到顶部笋箨会依次发生衰老。此处6个时期的笋箨是指高2.3 m孝顺竹第2(ST2)至第7(ST7)节间的笋箨(从下往上)[24],分别代表笋箨的不同发育状态,ST2时期为衰老程度最高的时期。

根据表达趋势特征,31个BmWRKY可以被分为a、b、c、d 4种类型(图4)。

ST2—ST7指高2.3 m孝顺竹第2～7节间所附着的笋箨(从下往上), ST2指第2节间附着的笋箨, ST3指第3节间附着的笋箨。ST2-ST7 represent the sheaths in the bottom internodes of a bamboo shoot with a height of 2.3 m from bottom to top. ST2, the second sheath; ST3, the third sheath and so on.图4 衰老相关BmWRKYs在笋箨不同发育 时期的表达模式分析Fig. 4 Expression patterns of senescence related BmWRKYs in B. multiplex sheath at different developmental stages

a类主要包括BmWRKY59、BmWRKY6和BmWRKY10等,都在笋箨衰老程度最高的ST2期高表达。b类主要包括BmWRKY2、BmWRKY30和BmWRKY72等,在笋箨发育的中后期,即ST3、ST4和ST5时期高表达。c类主要包括BmWRKY15、BmWRKY12和BmWRKY7等,在笋箨发育的早期阶段ST6期显著高表达。d类主要包括了BmWRKY3、BmWRKY21和BmWRKY5等,主要在笋箨发育的早期阶段ST7时期显著高表达。

2.4 候选BmWRKYs在孝顺竹笋箨不同发育时期的表达趋势分析

为进一步验证候选BmWRKYs在孝顺竹笋箨衰老中的潜在作用,本研究以孝顺竹节间的发育时期为依据对相应的笋箨进行取样[35]。对不同发育时期笋箨中叶绿素含量进行检测,发现随着第3节间生长减缓程度的增加,笋箨中叶绿素含量出现了明显的下降。长度为30 cm左右第3节间笋箨的膜离子渗透率也明显高于另两个时期。这些结果表明随着第3节间生长减缓程度的增加,笋箨出现了不同程度的衰老(图5)。

不同字母表示在0.05水平上的差异显著性。下同。Different lowercase leters indicate significant difference at 0.05 level.The same below.图5 笋箨随第3节间生长减缓出现衰老Fig. 5 The occurrence of sheath senescence with the growth decreasing of the third internode

为了进一步分析候选BmWRKYs基因在孝顺竹笋箨不同发育时期的表达模式,本研究在不同表达模式的基因集中,各选取2～4个基因进行了qRT-PCR实验(图6)。4个a类BmWRKYs(BmWRKY4、6、48和53)中,BmWRKY4、BmWRKY48和BmWRKY53都在节间长度为30 cm的笋箨中显著高表达,BmWRKY6则在节间长度为20～25 cm的笋箨中显著高表达。两个b类BmWRKYs中,BmWRKY2在30 cm时期高表达,而BmWRKY30在10 cm时期笋箨中高表达。两个c类BmWRKYs则都在20～25 cm时期笋箨中高表达。3个d类BmWRKYs的表达趋势差异较大,BmWRKY1和BmWRKY5都在30 cm时期笋箨高表达,而BmWRKY21在10 cm时期高表达。

图6 BmWRKYs在不同发育状态笋箨中的表达水平Fig. 6 Expression profiles of BmWRKYs in sheath at different developmental states

3 讨 论

WRKY转录因子是植物中一类重要的转录因子,在植物生长发育和响应逆境胁迫等方面扮演重要的调控角色。目前,关于WRKY转录因子功能的研究主要集中于模式植物,如拟南芥和水稻,在其他植物中相对较少,在孝顺竹中鲜见相关报道[6, 11]。本研究对孝顺竹笋箨中的WRKY转录因子进行了鉴定,共得到83个BmWRKY。相比于禾本科植物水稻(103)和毛竹(Phyllostachysedulis,121)基因组中WRKY的数量[39-40],孝顺竹笋箨中鉴定得到的WRKY数量明显偏少。孝顺竹中83个BmWRKY根据系统发育分析和结构域分析的结果被划分为Ⅰ、Ⅱ a—e和Ⅲ3大亚家族,但Ⅱ a、Ⅱ e和Ⅲ亚家族成员数量明显少于其他植物中对应亚家族成员的数量。本研究使用的数据库为孝顺竹不同发育时期笋箨的3代全长转录组数据,鉴定出的WRKY可能只是参与调控笋箨相关生物进程的WRKY,而不是整个孝顺竹基因组中的全部WRKY,这可能是导致被鉴定出的WRKY数量明显少的原因。

笋箨是附着在竹秆箨环上的一种器官,是竹类植物分类的依据之一,通常认为其对竹节间具有机械支持作用。在孝顺竹中,笋箨被发现与叶片具有相似的作用,是节间生长的一个重要碳源[24]。目前,关于叶片衰老机制的假说,最受认可的是源-库假说,认为植物叶片的衰老是对源器官和库器官之间信息交流的一种反应。在一些植物中,如小麦、玉米,库器官对营养物质需求的减少会加速源器官的衰老[26]。在孝顺竹中,笋箨的衰老进程被发现开始于节间生长减缓之后。孝顺竹节间与笋箨之间很可能也是一种源与库的关系,孝顺竹笋箨的衰老可能是对节间生长减缓的一种反应[24]。在本研究中,孝顺竹第3节间生长减缓后,笋箨也出现不同程度的衰老。对笋箨衰老机制的研究将有助于孝顺竹快速生长特性的研究。

WRKY家族是参与植物叶片衰老过程的第2大转录因子家族。在本研究中,共鉴定得到31个衰老相关的候选BmWRKY。基于孝顺竹不同发育时期笋箨的转录组数据,对候选BmWRKYs在笋箨发育过程中的表达趋势进行了分析,发现31个BmWRKYs的表达模式大致可以分为4类。植物衰老过程中,WRKY转录因子的作用机制是复杂的。在拟南芥WRKY基因家族中,部分WRKY对植物的衰老进程起抑制作用,如AtWRKY54、AtWRKY70和AtWRKY57[14-15];部分对植物的衰老进程起促进作用,如AtWRKY6、AtWRKY75和AtWRKY45[10-11, 13]。此外,WRKY转录因子对植物衰老进程的调控还涉及多条激素信号途径,包括脱落酸、水杨酸、赤霉素和茉莉酸。为了进一步探究具有不同表达模式的4类BmWRKYs在孝顺竹笋箨衰老过程中的潜在作用机制,在4类BmWRKY中分别挑选了2～4个WRKY进行qRT-PCR实验。BmWRKY4、BmWRKY48和BmWRKY53的相对表达量都随着笋箨衰老程度的增加而上调,与其在孝顺竹不同发育阶段转录组数据中的表达趋势一致。此外,BmWRKY4与AtWRKY75和AtWRKY45是同源基因,BmWRKY48和BmWRKY53与AtWRKY6是同源基因,而AtWRKY75、AtWRKY45和AtWRKY6都是对拟南芥叶片衰老起促进作用的WRKY基因。这些结果表明,a类BmWRKY中的BmWRKY4、48和53可能是笋箨衰老的正调控因子。d类BmWRKY的表达特征是在笋箨发育早期阶段显著高表达。然而3个d类BmWRKYs中,只有BmWRKY21在第3节间笋箨发育过程中的表达趋势与之一致,在笋箨发育早期阶段显著高表达。BmWRKY21是WRKY Ⅲ亚家族中的一员,与多个衰老相关的AtWRKYs(包括AtWRKY30、AtWRKY53、AtWRKY63、AtWRKY70、AtWRKY54和AtWRKY46)聚类在一起。其中,AtWRKY53、AtWRKY70和AtWRKY54都被鉴定为拟南芥叶片衰老的负调控因子。这些结果表明,BmWRKY21可能是孝顺竹笋箨衰老的负调控因子,并且在笋箨发育早期起作用。