舒心通脉汤对病毒性心肌炎患者自噬相关通路的影响*

赵小松，吕正祥，杨德忠

1 重庆市江津区中医院，重庆 404100； 2 陆军军医大学大坪医院，重庆 400042

根据世界卫生组织（world health organization，WHO）心肌病分类，病毒性心肌炎属炎症性疾病，其是部分年轻患者心源性猝死和扩张性心肌病发生的重要原因［1］。研究表明，病毒如B型柯萨奇病毒或腺病毒感染机体后，可直接损伤心肌，造成病理性炎症反应［2］。同时病毒可利用自噬逃避降解，促进病毒的复制及获取代谢产物，同时过度激活的自噬还可促进细胞凋亡及炎症级联反应［3］，因此，自噬可能是病毒性心肌炎发生及发展的关键分子事件。针对病毒性心肌炎患者，如何有效地抑制机体细胞自噬，可能是临床研究及治疗的重要方向。中医认为，病毒性心肌炎属“胸痹”“心悸”范畴，治疗以活血化瘀、益气通脉为主。以舒心通脉组分为代表的中药方剂，可显著改善心血管疾病，如慢性心衰患者的心功能［4］，但对于病毒性心肌炎自噬相关通路的影响，目前尚无相关研究报道。本研究通过探讨舒心通脉汤对病毒性心肌炎患者外周血单核细胞自噬相关基因、凋亡及炎性因子的影响，为其临床运用提供依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料选取2018 年8 月至2020 年8 月重庆市江津区中医院收治的126 例成年病毒性心肌炎患者为研究对象。按随机数字表法分为对照组和观察组，每组63 例。观察组中男33 例，女30例；平均年龄（45.6±9.3）岁；平均病程（9.8±2.8）天；心功能分级：Ⅰ～Ⅱ级50 例，Ⅲ～Ⅳ级13 例。对照组中男35例，女28例；平均年龄（46.3±8.5）岁；平均病程（10.5±3.1）天；心功能分级：Ⅰ～Ⅱ级52 例，Ⅲ～Ⅳ级11 例。两组基线资料比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。

1.2 纳入标准纳入：1）符合病毒性心肌炎诊断与治疗指南［5］者；2）年龄＞18岁者；3）获得了医院伦理委员会的批准（AM180801），且签署知情同意书者。

1.3 排除标准排除：1）合并细菌引起的感染性心内膜炎、恶性肿瘤、严重器官功能不全者；2）对舒心通脉汤过敏者；3）治疗依从性较差者。

1.4 治疗方法1）对照组采用常规治疗方案，即入院当日给予休息、吸氧、抗病毒、营养心肌［维生素C（东北制药，批准文号：国药准字H21020713，规格：0.1 g/片）、盐酸曲美他嗪（远大医药，批准文号：国药准字H20083806，规格：20 mg/片）及辅酶Q10 胶囊（普康药业，批准文号：国药准字H19999355，规格：10 mg/粒）］、极化液稳定心电活动等对症治疗。2）观察组在对照组的基础上服用舒心通脉汤治疗，药物组成：黄芪20 g，西洋参15 g，丹参15 g，当归、川芎、麦冬、金银花、连翘各10 g。水煎早晚分服。两组连续治疗2个疗程（1 个疗程为14 天），治疗期间禁烟禁酒，禁食辛辣、油腻食物。

1.5 观察指标

1.5.1 自噬及凋亡相关基因mRNA 水平 收集患者治疗后外周血单核细胞，提取总RNA，然后进行逆转录，逆转录方法按试剂盒说明（Takara 公司），qPCR引物由上海生工公司合成。引物序列见表1。建立20 μL反应体系，包括1 μL cDNA，2 μL 10X Taq 缓冲液，1.2 μL 25 mM MgCl2、0.4 μL 10 mM dNTP，0.8μL 1U/μLTaq 聚合酶，每个引物1 μL和剩余的加入DEPC水使反应总量达到20 μL。PCR 反应条件如下：95 ℃ 3min，在95 ℃ 30 s，56 ℃ 40 s 和72 ℃ 40 s，共计30 个循环。以GAPDH为内参，使用2-ΔΔCq方法计算相对mRNA水平。

表1 引物序列表

1.5.2 自噬相关蛋白表达水平 提取患者治疗前后单核细胞，经裂解液裂解后，测定蛋白浓度。然后进行电泳分离，电泳完成后转移置硝基纤维素膜。采用5%脱脂牛奶封闭1.5 h，然后与稀释的一抗4 ℃孵育过夜，抗Beclin-1 抗体（1∶400）、抗LC3 抗体（1∶300）及抗GAPDH 抗体（1∶500）。次日经磷酸盐吐温缓冲液洗涤3次后，将膜与孵育辣根过氧化物酶标记的二抗（1∶10 000）室温孵育2 h。以GAPDH 为内参，计算目的条带与GAPDH 灰度比值。

1.5.3 外周血炎性指标 采用ELISA 法测定不同组间外周血白细胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）、白细胞介素22（interleukin-22，IL-22）及肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）水平，检测步骤按试剂盒说明书进行（南京建成生物公司）。

1.5.4 临床疗效 临床痊愈：患者临床症状、体征均消失，心肌损伤标志物和心电图等检查指标均恢复正常；显效：患者临床症状和体征完全消失或基本消失，心肌损伤标志物指标好转，肌钙蛋白为阴性；有效：患者临床症状和体征有所好转，同时心电图、心肌损伤标志物有改善，但未恢复正常；无效：患者临床症状和体征、心肌损伤标志物和心电图等检查指标未见明显好转甚至出现加重。

总有效率（%）=（痊愈+显效+有效）例数/总例数

1.5.5 不良反应 观察两组患者治疗过程中恶心、呕吐、头晕、乏力、腹泻等不良反应的发生情况。

1.6 统计学方法采用SPSS 19.0 进行数据分析。计量资料以±s表示，采用t检验；计数资料以n，%表示，采用χ2检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 外周血自噬相关基因mRNA 和蛋白表达水平与治疗前比较，两组治疗后外周血单核细胞自噬相关基因Beclin-1、LC3-II mRNA 和蛋白表达水平均明显降低（P＜0.05），其中观察组上述指标较对照组治疗后降低更明显（P＜0.05）。见表2。

表2 两组治疗前后自噬相关基因mRNA及蛋白表达水平比较（±s）

表2 两组治疗前后自噬相关基因mRNA及蛋白表达水平比较（±s）

注：*表示与同组治疗前比较，P＜0.05；#表示与对照组治疗后比较，P＜0.05

组别观察组LC3-Ⅱ1.02±0.05 0.66±0.12*#0.98±0.04 0.77±0.10*例数63对照组63时间治疗前治疗后治疗前治疗后Beclin-1 mRNA 0.98±0.05 0.60±0.16*#0.99±0.06 0.78±0.10*Beclin-1 1.03±0.04 0.70±0.08*#1.01±0.02 0.80±0.09*LC3-Ⅱ mRNA 1.00±0.03 0.69±0.15*#1.02±0.04 0.82±0.11*

2.2 外周血炎性指标水平与治疗前比较，两组治疗后外周血炎性指标IL-1β、IL-22 及TNF-α 水平均明显降低（P＜0.05），其中观察组上述指标较对照组治疗后降低更明显（P＜0.05）。见表3。

表3 两组治疗前后外周血炎性指标水平比较（±s） pg/mL

表3 两组治疗前后外周血炎性指标水平比较（±s） pg/mL

注：*表示与同组治疗前比较，P＜0.05；#表示与对照组治疗后比较，P＜0.05

组别观察组例数63对照组63时间治疗前治疗后治疗前治疗后IL-1β 26.28±6.15 12.65±3.87*#25.57±5.43 IL-22 33.98±4.97 14.72±4.02*#34.21±5.86 17.74±4.16*20.84±5.04*TNF-α 38.50±5.53 19.30±4.14*#39.01±6.02 24.22±4.95*

2.3 外周血单核细胞凋亡相关基因mRNA水平与治疗前比较，两组治疗后外周血Caspase-3 mRNA水平明显降低，Bcl-2 mRNA水平明显升高（P＜0.05），其中观察组Caspase-3 mRNA 及Bcl-2 mRNA 水平较对照组改善更明显（P＜0.05）。见表4。

表4 两组外周血单核细胞凋亡相关基因mRNA水平比较（±s）

注：*表示与同组治疗前比较，P＜0.05；#表示与对照组治疗后比较，P＜0.05

Bcl-2 mRNA 1.00±0.03 1.35±0.11*#1.01±0.04 1.20±0.07*组别观察组例数63 Caspase-3 mRNA 0.99±0.06对照组63时间治疗前治疗后治疗前治疗后0.75±0.10*#1.01±0.05 0.83±0.09*

2.4 临床疗效观察组痊愈32例，显效16例，有效11 例，无效4 例，总有效率93.7%（59/63）；对照组痊愈25例，显效16例，有效10例，无效12例，总有效率81.0%（51/63）。观察组总有效率高于对照组（P＜0.05）。

2.5 不良反应发生率治疗期间观察组发生不良反应发4 例（6.35%），其中头晕1 例、恶心2 例、呕吐1例，对照组发生不良反应发2例（3.17%），其中头晕1例、乏力1例。观察组不良反应发生率稍高于对照组，但差异无统计学意义（P＞0.05）。两组患者不良反应均较轻微，未经特殊处理症状均自行消失。

3 讨论

病毒性心肌炎是临床常见和多发的心血管疾病之一，临床表现及病情呈现多样化，大部分患者临床症状不明显，预后较好，但少部分患者可出现多种心律失常甚至心源性猝死等。随着相关基础及临床研究的深入，临床上对于病毒性心肌炎的防治均取得了显著进展，若出现机体炎症，给予大剂量激素冲击疗法；若患者免疫力低下，给予输注免疫球蛋白；部分重症患者甚至可给予体外肺氧合来维持患者呼吸与循环稳定。传统中医认为病毒性心肌炎属“胸痹”“怔忡”范畴，发病源于气阴两虚、热毒伤心，治疗时以益气养阴、活血化瘀为主［6］。相关研究显示，舒心通脉方可改善心功能，提高心血管疾病患者临床疗效［7］，已运用于临床，但具体机制还有待阐明。

近年来，对自噬在疾病发生、发展中的作用，医学界已进行了广泛而深入的研究。自噬通过吞噬并降解细胞质蛋白或受损的细胞器，对于促进细胞代谢，维持细胞器更新及机体稳态，起着重要的作用［8］。但自噬在不同疾病中扮演的作用有所不同，如在慢性阻塞性肺疾病［9］、动脉粥样硬化［10］中，机体细胞自噬往往降低，而恶性肿瘤［11］患者，机体细胞自噬水平显著增加，有助于肿瘤细胞免疫逃逸。对于病毒性心肌炎患者，目前自噬相关研究较少，但动物模型结果显示，在病毒感染过程中，病毒可利用自噬逃避降解，促进病毒复制和释放［12］。同时自噬还可促进细胞凋亡，产生炎症级联反应，导致重要脏器功能不全［13］。如何有效抑制病毒性心肌炎患者过度的细胞自噬反应，有可能成为该病有效治疗的靶点。

舒心通络汤由黄芪、西洋参、麦冬等组成，可针对患者正气虚弱、血瘀气滞，进行辨证施治。有研究显示，黄芪除了具有调节机体免疫力作用外，还发挥抗氧化，保护器官缺血再灌注损伤的作用［14］。西洋参具有降低心肌耗氧量，提高缺氧耐受力，稳定心电活动的作用［15］。因此，舒心通脉汤诸多成分通过益气养阴、抗炎、调节免疫等作用，提高机体抵抗不良因素刺激造成损伤的能力。

本研究观察舒心通脉汤对病毒性心肌炎患者自噬、凋亡相关基因及外周血炎性指标的影响，其结果显示，舒心通脉汤可显著降低病毒性心肌炎细胞自噬及凋亡水平。有研究证实，过度的自噬可诱发细胞凋亡，线粒体依赖性途径是细胞凋亡的重要机制，自噬通过对线粒体的大量降解，抑制了机体能量代谢，促进了细胞凋亡及相关促炎细胞因子的合成与分泌［16］。舒心通脉汤通过抑制病毒性心肌炎患者机体自噬和凋亡水平，有助于降低炎症反应，提高临床疗效。同时作为纯中药方剂，舒心通脉汤对病毒性心肌炎患者尚未产生明显的不良反应，安全性较好。

综上所述，舒心通脉汤对病毒性心肌炎患者具有显著的临床疗效，其机制可能与降低细胞自噬及凋亡，减轻炎症反应有关。但舒心通脉汤对自噬的具体调控机制还有待于进一步研究。