砂仁对反流性食管炎大鼠食管黏膜的保护作用*

马 琼，闫龙腾，赵 茜，胡冬雄

1 云南中医药大学基础医学院，云南 昆明 650504；2 云南省高校中医证候微观辨证重点实验室，云南 昆明 650504

反流性食管炎（reflux esophagitis，RE）是临床中常见的胃肠道疾病，其发生原因为胃、十二指肠的内容物反流到食管进而引起食管黏膜损伤［1］。近年来随着人们饮食结构的改变，特别是高能量食物摄入的增加，本病的发生率逐年升高［2］，已经引起了大量学者的关注。治疗本病的药物在西药领域以奥美拉唑为代表［3］，中药在治疗本病方面具有较多的优势，具有用药灵活、毒副作用小等特点［4］。近年来研究发现，砂仁药理活性较高，对十二指肠炎、胃溃疡、浅表性胃炎等肠胃疾病均具有很好的调节作用［5-7］。本研究采用“4.2 mm 幽门夹+胃底2/3 结扎术”法构建了RE 大鼠模型，以观察砂仁对其是否有调节作用，并从氧化应激和一氧化氮合酶2（nitric oxide synthase2，NOS2）方面研究其作用机制，为临床治疗RE提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物SPF 级雄性SD 大鼠100 只，体质量160～180 g，购于昆明医科大学动物实验中心，实验动物许可证号：SCXK（滇）2015-0002。饲养条件：大鼠饲养于SPF 级标准实验动物房：温度22～27 ℃，湿度40%～60%，光照/黑暗=12 h/12 h，日常自由饮水和进食。动物实验遵守实验动物福利伦理审查指南。

1.2 药品及试剂25%砂仁水提液（昆明植分生物技术有限公司，批号：120985-201406）；奥美拉唑（浙江康恩贝制药股份有限公司，批准文号：国药准字H20059769，规格：10 mg/粒）；超氧化物歧化酶试剂盒（superoxide dismutase，SOD）（南京建成生物工程研究所，批号：S0088）；丙二醛试剂盒（malondialde-hyde，MDA）（南京建成生物工程研究所，批号：MM-21303R1）；大鼠一氧化氮（nitric oxide，NO）（ELISA）试剂盒［研域（上海）化学试剂有限公司，批号：A013-2-1］；血管活性肠肽（vasoactive intestinal peptide，VIP）抗体（德国Abcam 公司，批号：40077-57-4）；P 物质（substance P，SP）（批号：S0073）、NOS2 和甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗体（美国Santa 公司，批号：abx053065，AB-2834113）；二抗（北京中杉金桥生物科技公司，批号：A9169-2ML）；PVDF 膜（德国默克生命科学技术有限公司，批号：LM1136）；引物由上海生物生工提供。

1.3 实验仪器HZK-110 型电子分析天平（赛恩斯仪器设备有限公司）；725 型超低温冰箱（美国Thermo Forma 公司）；TGL-16.5M 型低温高速离心机（上海卢湘仪离心机仪器有限公司）；UV-8000型紫外-可见分光光度计（上海精密仪器仪表有限公司）；YT-MB96 型酶标仪（山东云唐智能科技有限公司）；Mini-PROTEAN Tetra 型蛋白电泳仪（美国伯乐生命医学产品有限公司）；CFX384Touch 型实时荧光定量PCR 仪（美国伯乐生命医学产品有限公司）。

1.4 实验方法

1.4.1 动物分组 100 只SD 大鼠，随机选取10只作为假手术组，其余90 只构建RE 动物模型，模型构建成功后，排除死亡以及造模不成功的大鼠后，随机选取50 只，将其分为模型组，奥美拉唑组，砂仁低、中、高剂量组，每组10只。

1.4.2 造模方法 采用邹文献［6］“4.2 mm 幽门夹+胃底2/3 结扎术”构建RE 大鼠模型，模型构建时，采用3 mL，1%的戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，麻醉后，将大鼠仰卧固定于手术台使其胸腹部充分暴露，并用绷带将其四肢和牙齿固定，固定后采用宽度为3.0 mm 的双扁铁心扎线在缠绕成一个直径为4.2 mm 的幽门夹，后切开腹部组织，找到幽门和十二指肠交界处，给其套上幽门夹并用血管钳夹紧，后以3/0 线系住幽门夹闭合端，另一端结扎2/3 胃底。上述完成后给予腹腔注射头孢拉定和甲硝唑以防止其感染，完成后采用缝合线缝合腹膜和皮肤，再次用酒精消毒后即完成手术，假手术组只开腹不做其他处理，15 min 后逐层缝合腹部伤口。所有大鼠术后禁食不禁水24 h，24 h 后可自由饮食。术后2周，每组各取2只麻醉处死收集食管组织，将其采用组织固定液固定24 h 后取出，行HE 染色观察病理学，当显示有明显组织病理学改变后确认造模成功。

1.4.3 给药方法 假手术组和模型组给予2 mL生理盐水灌胃，奥美拉唑组给予奥美拉唑2 mL/（kg·d）灌胃，砂仁低、中、高剂量组分别给予砂仁水提取液5、10、20 mL/（kg·d）灌胃。治疗时间为4周。

1.5 标本采集治疗4 周后，戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后，剖开大鼠腹腔，将食道取出，平均分为3 个部分，其中一部分置入组织固定液中保存用于HE 染色，另一部分取出后直接放入超低温冰箱备用于相关蛋白和生化指标的检测，最后一部分浸入RNA保护液中用于相应mRNA的检测。

1.6 观察指标

1.6.1 HE 染色组织病理学观察 从组织固定液中取出食道组织，由武汉塞维尔生物按照常规操作完成制作，采用荧光倒置显微镜采集大鼠食管组织病理图片。根据《反流性食管炎诊断及治疗指南（2003 年）》的ER 基本病理改变，观察食管鳞状上皮增生，黏膜增厚，黏膜固有层乳头向表面凸起情况，以及上皮层内黏膜炎细胞浸润情况。

1.6.2 MDA、SOD 及NO 含量检测 从超低温冰箱中取出食道组织，称取50 mg，加入0.5 mL 预先冷却过的生理盐水充分碾磨使其匀浆，完成后将其进行离心（离心半径：10 cm，2500 r/min，4 ℃）15 min。完成后提取上清，根据试剂盒提供的说明书检测MDA、SOD以及NO含量即可。

1.6.3 VIP、SP和NOS2蛋白表达检测 称取100 mg食道组织，采用总蛋白提取试剂盒提取总蛋白后，BCA法对其进行定量并调平，再每组各取50 ug行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酞胺凝胶电泳，电泳完成后将其用半干转移法转移到PVDF 膜，完成后采用牛血清蛋白封闭2 h，后加入一抗过夜，次日加入二抗1 h，PBS 洗涤后暗室曝光洗片即完成，结果比较采用Image J计算各条带的灰度值即可。

1.6.4 VIP、SP和NOS2 mRNA的检测 称取20 mg食道组织，提取总RNA后将其逆转录为cDNA，完成后每组各取2 μg 行PCR 扩增反应，扩增条件为95 ℃ 2 min、94 ℃10 s、60 ℃ 10 s、72 ℃ 40 s，循环次数34 次。分析比较结果采用2-ΔΔCt法。引物序列见表1。

表1 引物序列

1.7 统计学方法统计分析采用SPSS 23.0 统计学软件，计量资料采用±s表示，两组间比较采用One-Way ANOVA 单因素方差分析，多组间比较采用LSD法，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 病理学变化大鼠食管组织HE 染色可见，假手术组食管黏膜较为光滑、结构清晰完整，细胞排列整齐，没有炎症现象，而模型组则出现明显的黏膜增厚，同时角质化增厚，局部黏膜有乳头样凸起，各治疗组相较于模型组病理学变化有明显改善，且随着剂量的升高，食管病理改善效果越明显；与奥美拉唑组相比，砂仁低、中剂量组改善食管病理学情况没有奥美拉唑组显著，而高剂量组与奥美拉唑组疗效相似。见图1。

2.2 大鼠食管组织氧化和抗氧化指标与假手术组相比，模型组大鼠食管黏膜组织中SOD明显降低（P＞0.05），而NDA和NO则明显升高（P＞0.05）；与模型组相比，各治疗组SOD 明显升高，而MDA 和NO明显降低（P＞0.05）。随着砂仁剂量的升高，SOD明显升高、MDA 和NO 降低的效果越来越好。与低剂量相比，砂仁高剂量组SOD 明显升高、MDA 和NO显著降低（P＞0.05），而与砂仁中剂量相比差异没有统计学意义（P＞0.05）。通过与奥美拉唑组相比，砂仁低、中剂量组SOD水平降低、MDA和NO水平升高（P＞0.05）；而SOD、MDA 和NO水平高剂量组与奥美拉唑组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2 各组大鼠食管组织中氧化和抗氧化指标比较（±s）

表2 各组大鼠食管组织中氧化和抗氧化指标比较（±s）

注：与假手术组相比，*表示P＞0.05；与模型组相比，#表示P＞0.05；与奥美拉唑组相比，^表示P＞0.05；与低剂量组相比，**表示P＞0.05；与中剂量组相比，***表示P＞0.05

SOD（U/gprot）162.68±16.72 89.67±32.27*136.76±16.58#105.18±17.25#^124.62±16.21#^**134.57±15.36#**组别假手术组模型组奥美拉唑组砂仁低剂量组砂仁中剂量组砂仁高剂量组鼠数10 10 10 10 10 10 MDA（nmol/mgprot）4.68±1.08 10.35±2.14*6.53±1.06#8.04±1.45#^7.56±1.21#^6.68±1.04#**NO（μmol/gprot）2.01±0.52 4.58±0.65*3.06±0.41#4.20±0.43#^3.76±0.51#^3.15±0.48#**

2.3 VlP、SP和NOS2蛋白表达与假手术组相比，模型组大鼠VIP 蛋白表达明显降低（P＞0.05），SP 和NOS2 蛋白表达明显升高（P＞0.05），而各治疗组相较于模型组，VIP 则明显升高（P＞0.05），SP 和NOS2 明显降低（P＞0.05），且随着砂仁剂量的升高，VIP 升高、SP 和NOS2 降低水平越明显。与低剂量相比，砂仁中、高剂量组VIP 明显升高（P＞0.05），SP 和NOS2 明显降低（P＞0.05），而高剂量与中剂量相比，差异无统计学意义（P＞0.05）。与奥美拉唑组相比，砂仁低、剂量组VIP 蛋白表达降低（P＞0.05），SP 和NOS2 蛋白表达升高（P＞0.05）；砂仁中、高剂量组改善SP 和VIP 蛋白表达情况优于奥美拉唑组（P＞0.05），而改善NOS2蛋白表达水平，差异无统计学意义（P＞0.05）。见图2，表3。

图2 各组大鼠食管组织VIP、SP和NOS2蛋白表达电泳图

表3 各组大鼠食管组织VlP、SP和NOS2蛋白相对表达量比较（±s）

表3 各组大鼠食管组织VlP、SP和NOS2蛋白相对表达量比较（±s）

注：与假手术组相比，*表示P＞0.05；与模型组相比，#表示P＞0.05；与奥美拉唑组相比，^表示P＞0.05；与砂仁低剂量组相比，**表示P＞0.05；与砂仁中剂量组相比，***表示P＞0.05

VIP 0.82±0.06 0.48±0.12*0.56±0.09#0.53±0.12#0.68±0.07#^**0.79±0.07#^**组别假手术组模型组奥美拉唑组砂仁低剂量组砂仁中剂量组砂仁高剂量组鼠数10 10 10 10 10 10 NOS2 0.65±0.12 1.15±0.14*0.68±0.08#0.87±0.12#^0.76±0.11#**0.73±0.14#**SP 0.27±0.08 0.98±0.15*0.46±0.10#0.57±0.16#^0.44±0.13#^**0.35±0.11#^**

2.4 VlP、SP及NOS2 mRNA表达与假手术组相比，模型组大鼠VIP 蛋白表达明显降低（P＞0.05），SP和NOS2 蛋白表达明显升高（P＞0.05），而各治疗组相较于模型组，VIP 则明显升高（P＞0.05），SP和NOS2 明显降低（P＞0.05），且随着剂量的升高，改善效果越显著。与砂仁低剂量相比，砂仁中、高剂量组VIP 则明显升高（P＞0.05），SP 和NOS2 明显降低（P＞0.05）；砂仁中、高剂量组之间差异无统计学意义（P＞0.05）。与奥美拉唑组相比，各治疗组VIP 升高，SP 和NOS2 降低，但差异无统计学意义（P＞0.05）。砂仁高剂量组表现出最优剂量。见表4。

表4 各组大鼠食管组织VlP、SP和NOS2 mRNA表达量（±s）

表4 各组大鼠食管组织VlP、SP和NOS2 mRNA表达量（±s）

注：与假手术组相比，*表示P＞0.05；与模型组相比，#表示P＞0.05；与奥美拉唑组相比，^表示P＞0.05；与砂仁低剂量组相比，**表示P＞0.05；与砂仁中剂量组相比，***表示P＞0.05

VIP 1.02±0.01 0.57±0.09*0.80±0.07#0.74±0.06#0.79±0.06#0.84±0.05#**组别假手术组模型组奥美拉唑组砂仁低剂量组砂仁中剂量组砂仁高剂量组鼠数10 10 10 10 10 10 NOS2 1.02±0.00 1.79±0.16*1.28±0.12#1.36±0.10#1.27±0.08#**1.23±0.09#**SP 1.01±0.01 1.96±0.23*1.47±0.10#1.56±0.11#1.54±0.10#**1.45±0.12#**

3 讨论

近年来RE 受到了众多学者的关注，目前西医治疗本病的药物有抑酸药（奥美拉唑、兰索拉唑等）、促进胃肠动力药（潘利酮等）和胃黏膜保护剂（铋剂、前列腺素及其衍生物等）等［8］，上述药物在使用后见效快，但是不良反应相对较多，且具有较高的复发率。RE 在中医学中属于“反胃”“嘈杂”“吞酸”“呕吐”“梅核气”等范畴，中医常以辛开苦降、滋胃降逆法为主治疗。中医药可明显改善本病症状，同时减轻患者炎症损伤，促进食管修复［9］。

砂仁属于药食同源类药物，其味辛、性温，归脾和胃经，主要功效为化湿行气、宽中止呕、暖脾止泻、安胎、祛痰等［10］。研究发现，砂仁具有较高的药理活性，特别是在改善胃肠运动、保护胃黏膜、排除消化管积气和消炎止痛等方面具有明显的优势。曹羽等［11］发现，砂仁能够加速患者胃部手术后的胃肠功能恢复，在临床水平上验证了砂仁能够促进胃肠运动的机制，这可能与其促进体内胃动素（motilin，MLT）、P 物质（substance P，SP）的分泌释放有关。ZHANG 等［12］研究发现，砂仁挥发油可增加5-氟尿嘧啶（5-Fluorouracil，5-FU）诱导大鼠的体质量，减轻其腹泻症状，砂仁挥发油能通过抑制细胞凋亡、减轻肠胃炎和增强肠黏膜屏障等作用逆转肠道和炎症的组织病理学变化，并减少病原细菌的数量，增加益生菌的含量，有效阻止化疗后肠黏膜炎的发生和发展。虽然砂仁已经广泛运用于胃肠道黏膜损伤疾病的治疗中并且取得较为满意的成效，但是砂仁在RE 中的应用鲜有报道。本次研究结果表明，在给予RE 大鼠砂仁水提液低、中、高剂量及阳性药物后，食管的病理损伤减轻，且砂仁水提液的高剂量可与阳性药物组效果媲美。表明砂仁水提液可保护RE 大鼠食管黏膜。

关于RE 的发生机制，目前认为，其是因各种生理因素造成的上消化道动力障碍导致酸性反流性的炎症疾病［13］。上消化道动力障碍可引起下食管括约肌松弛，延迟胃排空时间，引起胃内容物反流进入食道，食管黏膜防御能力减弱，最终引发食管发生病变［14］。在上述过程中，食管下括约肌（low esophageal sphincter，LES）占有关键地位［15］，LES 功能状态可受到多种激素或神经功能的调节［16］，其中对神经功能的调节主要是指其功能状态受到胃肠激素和胃肠神经的双重调节。研究发现，调节胃肠神经的两个关键蛋白为血管活性肠肽（vasoactive intestinal peptide，VIP）和SP，其中SP可引起LES收缩，而VIP的作用正好相反，主要作用为抑制神经递质传递，减弱LES 的收缩能力［17-18］。除上述VIP 和SP 外，NO 也是调节收缩功能的重要因子［19-20］，NO主要受旁分泌调控，主要由一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）合成，NOS 又分为3 个亚型，而与RE相关性较大的主要为NOS2。NOS2 在正常状态下表达并不明显，其在经过细胞因子刺激后可过量表达，进而释放大量的NO，最终使得LES发生松弛，给机体带来损失。

本研究结果显示，经砂仁水提液及阳性药物治疗后，RE 大鼠SOD 含量明显升高，血清MDA、NO明显降低，表明砂仁水提液可通过调节NO、SOD 及MDA 的分泌进而提高大鼠食管的抗氧化能力，为食管黏膜组织的修复提供有利条件。与假手术组相比，模型组大鼠VIP蛋白及mRNA表达明显降低，SP 和NOS2 蛋白及mRNA 表达明显升高，而采用砂仁水提液治疗后，VIP明显升高，SP和NOS2明显降低，这提示砂仁可以明显改善上述3 个蛋白的表达，进而抑制食管括约肌松弛，调节胃肠运动，最终保护食管。

基于上述讨论提示，砂仁对RE 具有较好的疗效，其可以明显地改善食管黏膜，提高抗氧化能力，分析其作用机制，可能与砂仁可改善VIP、SP和NOS2 蛋白和mRNA 表达，进而提高胃排空、保护食管黏膜有关。