基于网络药理学和分子对接探究“川芎-丹参”药对治疗肺癌的作用机制*

王璐瑶，张培彤，罗 钺，黄 蓉，林月洁，王 菁，李 蒙

1 北京中医药大学，北京 100029； 2 中国中医科学院广安门医院，北京 100053；3 北京中医药大学东直门医院，北京 100700

肺癌是最常见的恶性肿瘤，发病率和死亡率均居首位［1］。治疗肺癌的手段除了手术、化学治疗、放射治疗、靶向治疗及免疫治疗外，中医药在预防肿瘤发生、减毒增效、减少肿瘤复发和转移等方面也具有独特优势［2］。目前主流观点认为肿瘤患者普遍存在血瘀证，活血化瘀法可抑制肿瘤生长、改善血液高凝状态、抑制侵袭和转移、延长患者生存时间并提高生活质量［3］。川芎和丹参均属于临床上常用的活血药，作为丹参川芎嗪注射液、丹芎通脉颗粒等活血化瘀药的重要组成，川芎偏于活血行气，丹参长于养血活血，两者相须为用共奏活血化瘀之功。目前研究已证明川芎和丹参两味中药均具有抗肿瘤作用［4-6］，但中药成分复杂，两药配伍存在协同或拮抗作用，现代研究缺乏对“川芎-丹参”药对的作用机制及药理研究。网络药理学通过“疾病-基因-靶点-药物”相互作用网络系统分析药物与疾病的关系［7］。本研究旨在通过网络药理学方法对“川芎-丹参”药对治疗肺癌的作用机制进行探讨，为临床应用活血化瘀药物治疗肺癌提供理论基础，为后续研究提供参考。

1 资料与方法

1.1 “川芎-丹参”药对活性成分筛选及作用靶点通过TCMSP 数据库［8］（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）检索川芎、丹参的活性成分，以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%和药物相似性（drug likeness，DL）≥0.18 作为筛选条件，筛选出活性成分较高的化合物，检索文献进行补充，获得蛋白作用靶点，利用Uniprot 数据库［9］（https：//www.uniprot.org/）对药物靶点进行标准化命名。

1.2 肺癌疾病靶点获取通过GeenCards 数据库（https：//www.genecards.org/）检 索“Lung Cancer”，获取肺癌疾病靶点。

1.3 药物活性成分-共同靶点-疾病网络构建利用BioVenn 在线软件［10］将“川芎-丹参”药对药物靶点与肺癌疾病靶点取交集得到共同靶点，以Venn 图的形式展现，将共同靶点与药物活性成分进行匹配，使用Cytoscape 软件构建药物活性成分-共同靶点-疾病网络，筛选出药物活性成分中与疾病靶点相关的主要成分作为“川芎-丹参”药对治疗肺癌的主要活性成分。

1.4 关键靶点筛选及网络构建将共同靶点上传 至STRING 在 线 平 台 数 据 库［11］（https：//string-db.org/cgi/input.pl）构建蛋白相互作用网络。将蛋白互作网络数据导入Cytoscape 软件，使用CytoHubba 模块分析获取网络中degreee值排名前10 位的靶点作为“川芎-丹参”治疗肺癌的关键靶点，生成关键靶点蛋白相互作用网络。

1.5 功能富集分析与信号通路分析将关键靶点 上 传 至 Metascape 数 据 库［12］（https：//metascape.org/），以人类为研究对象，进行基因本体论功能分析（gene ontology，GO）以获得关键靶点的作用过程京都基因与基因组百科全书（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路分析以了解关键靶点在通路中的分布情况，利用微生信在线工具（http：//www.bioinformatics.com.cn/）对分析结果进行可视化。

1.6 分子对接通过PDB 数据库［13］（http：//www.rcsb.org/）查找关键靶点中degree 值排名前5的靶点对应的蛋白质3D结构，以此为受体；主要活性成分及临床报道有效药物作为配体，利用CB-Dock 网 站［14］（http：//cao.labshare.cn/cbdock/）进行分子对接验证。

2 结果

2.1 “川芎-丹参”药对活性成分及作用靶点利用TCMSP 数据库分别检索川芎、丹参，共获得391个化学成分，其中川芎189 个、丹参202 个，以OB≥30%和DL≥0.18为筛选条件，再结合文献研究补充川芎嗪、川芎内酯、阿魏酸以及齐墩果酸、丹参素、丹参酮I、原儿茶醛，最终筛选出川芎有效成分10个，丹参有效成分69 个。分别获取有效成分对应的靶点，利用Uniprot 数据库进行标准化命名，筛选得到149个预测靶点。见表1。

表1 “川芎-丹参”药对活性成分

2.2 肺癌疾病靶点获取通过GeenCards 数据库获得肺癌疾病靶点23107 个，通过筛选设置relevance score≥25.18，最终获得725个相关靶点。

2.3 药物活性成分-交集靶点-疾病网络构建利用BioVenn 在线软件将“川芎-丹参”药对活性成分对应的149 个潜在靶点与肺癌对应的725 个疾病靶点取交集，以Venn 图的形式得到74个共同靶点，见图1。将74 个共同靶点与药物活性成分相匹配，得到“川芎-丹参”药对发挥抗肺癌作用的药物活性成分，导入Cytoscape 软件，得到药物活性成分-共同靶点-疾病关系网络，见图2，计算degree 值，筛选出排在前五名的成分作为主要活性成分，依次是木犀草素、丹参酮ⅡA、杨梅酮、二氢丹参内酯和丹参新醌丁。

图1 “川芎-丹参”药对活性成分靶点与肺癌疾病靶点Venn图

图2 “药物活性成分-共同靶点-疾病”网络

2.4 关键靶点筛选及网络构建将74 个共同靶点上传至STRING 在线数据库平台，以TSV 格式保存蛋白质相互关系，将其导入Cytoscape 软件，利用CytoHubba 模块进行网络分析，筛选出Degree值排名前10 位的基因靶点，依次是TP53、AKT1、MAPK1、VEGFA、EGFR、MYC、JUN、CASP3、STAT3、ESR1，以此作为“川芎-丹参”药对治疗肺癌的关键靶点，构建关键靶点蛋白相互作用网络，见图3，网络节点的颜色按Degree值从高到低，由红色向黄色渐变。

图3 关键靶点蛋白互作网络

2.5 GO 功能和KEGG 通路富集分析通过Metascape 数据库对10 个关键靶点进行富集分析，以P＜0.01为筛选标准，获得GO生物过程条目385 条，GO 细 胞 组 分11 个，GO 分 子 功 能17 个，KEGG相关信号通路139条。分别筛选3种GO功能分析结果中排名前10 的条目，进行可视化，见图4。KEGG通路富集去除广泛通路后取前20条信号通路进行可视化，见图5，主要涉及到MAPK信号通路、PI3K-Akt 信号通路、Thyroid hormone 信号通路等。

图4 GO功能富集分析

图5 KEGG通路富集分析

2.6 分子对接CB-Dock 网站可预测给定蛋白质的结合位点，使用基于曲率的新型腔检测方法计算中心和大小，执行AutoDock Vina 分子对接［15］。Vina 得分值越低代表受体和配体亲和力越高，空腔尺寸接近或大于配体表明对接准确性更高。吉非替尼作为表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂，改善EGFR 突变阳性肺癌患者的无进展生存期优于一线和二线化疗药物［16］，故将吉非替尼与“川芎-丹参”药对主要活性成分进行比较。对接结果提示，亲和力最高的前5 位分别是吉非替尼和雌激素受体1、吉非替尼和丝裂原活化蛋白激酶1、丹参酮ⅡA 和骨髓细胞增多症病毒癌基因（myelocytomatosis viral oncogene，MYC）蛋白、丹参新醌丁和MYC蛋白以及杨梅酮和雌激素受体1。见表2、图6。

图6 Vina得分最低的前5种对接模式

表2 主要活性成分-关键靶点分子对接结果

3 讨论

本研究通过网络药理学方法初步筛选出“川芎-丹参”药对与肺癌相关的主要活性成分是木犀草素、丹参酮IIA、杨梅酮、二氢丹参内酯和丹参新醌丁。研究证明，木犀草素通过上调Caspase-3的表达同时抑制磷酸化蛋白激酶（Phospho-Akt，p-Akt）、基质金属蛋白酶2 的表达，抑制Src/FAK 及其下游Rac1、Cdc42 和RhoA 信号传导途径来抑制肺癌细胞增殖、侵袭及迁移［17-18］。丹参酮ⅡA通过上调P27的表达，诱导非小细胞肺癌细胞周期S期发生阻滞，联合顺铂则通过下调PI3K/Akt 信号通路在体内外协同抑制非小细胞肺癌，诱导细胞凋亡，发挥抗肺癌作用［19-20］。杨梅酮亦具有促进细胞凋亡的能力，能显著增加肺腺癌细胞早期凋亡率，使细胞周期阻滞在G0/G1期［21-22］。但目前对二氢丹参内酯和丹参新醌丁的抗肺癌作用研究报道相对较少，值得进一步探究。根据药物主要活性成分，杨梅酮来源于川芎，其余均来源于丹参，初步推断药对中丹参发挥的抗肺癌作用更大，而两药相须为用能增加其抗肺癌作用。

根据关键靶点蛋白互作网络可知，“川芎-丹参”药对主要是作用于TP53 基因（tumor protein P53，TP53）、丝氨酸/苏氨酸特异性蛋白激酶1（serine/threonine kinase 1，AKT1）、丝裂原活化蛋白激酶1（mitogen-activated protein kinase 1，MAPK1）等关键靶点，从而发挥抗肺癌作用。通过分子对接验证了关键靶点与主要活性成分均有较好的对接活性，表明“川芎-丹参”药对主要活性成分能对关键靶点发挥调控作用。抑癌基因TP53 是人类肿瘤中最常见的突变基因，其功能的丧失可加速肺癌中驱动癌基因的转化潜能，并阻碍肿瘤对细胞毒性化学疗法、放疗及表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）抑制剂的反应［23-25］。AKT1 在包括肺癌在内的许多癌症中变得高度活化，在调节异常细胞增殖、抑制程序性细胞死亡、端粒酶活化及促进血管生成和肿瘤细胞侵袭等方面发挥重要作用［26-27］。在肺癌、乳腺癌、结直肠癌等多种肿瘤组织中均可检测出MAPK1 的活化或高表达，研究证明miR-105-5p 通过下调MAPK1 抑制肺癌细胞［28］。

通过KEGG 通路富集分析，发现“川芎-丹参”药对与肺癌相关度排名前三名的信号通路分别是MAPK、PI3K-Akt 和Thyroid hormone。经 典 的MAPK 通路是由ERK1/2 信号传导蛋白介导的，ERK被激活将通过转位进入细胞核，激活转录因子和激酶等，参与调控细胞周期、增殖、分化、凋亡等多种生理过程［29］。研究证明，川芎嗪能下调MAPK 通路中ERK 的表达并升高JNK 和P-38 的表达，促进肺癌顺铂耐药细胞株凋亡［30］。PI3K-Akt 通路与肿瘤细胞治疗抗拒、增殖凋亡、周期调控、侵袭转移及血管形成等过程密切相关，Akt 是PI3K 下游关键蛋白，Akt 被激活可使下游靶点mTOR 发生磷酸化，被活化的mTOR 可调控其上游癌基因及抑癌基因的表达水平，干预肿瘤生长［31-32］。甲状腺激素通过与αvβ3 整联蛋白上的TR 相互作用来调节肿瘤增殖，刺激MAPK/ERK1/2 信号的激活，加速肺癌转移和进展［33］。

本研究主要运用网络药理学方法，对“川芎-丹参”药对治疗肺癌的作用机制进行探究，证明“川芎-丹参”药对通过木犀草素、丹参酮IIA、杨梅酮等多种活性成分，主要作用于TP53、AKT1、MAPK1 等 关 键 靶 点，调 节MAPK、PI3K-Akt、Thyroid hormone 等多条信号通路，主要通过调控细胞增殖凋亡、抑制侵袭转移等方面发挥抗肺癌作用。“川芎-丹参”药对治疗肺癌的作用机制具有多成分、多靶点、多通路的特点，为临床运用活血化瘀法治疗肺癌提供理论依据。网络药理学方法存在局限性，它主要用于预测分析，而临床药效与药物剂量、剂型及煎药时间等多种因素有关，得到的研究结论需通过实验进一步验证。