基于网络药理学和分子对接技术探讨香藿喷雾剂治疗新冠肺炎的作用机制

曹悦 林瑞超 董汛 张柏娥 杨宏志

2019年末中国突发新型冠状病毒肺炎(以下简称“新冠肺炎”),且病情发展迅速。本课题组基于前期对病毒性感冒、流行性感冒、咽炎、鼻炎等呼吸系统疾病的研究,结合新冠肺炎的临床特征研制出一款复方中成药制剂—香藿喷雾剂。其剂型为喷雾剂,该药制剂工艺主要以提取挥发油入药,既保留了传统组方的疗效,又具有使用便捷、药物可直达病所等优点。2020年4月至5月期间,本课题组运用香藿喷雾剂治疗新冠肺炎患者,结果显示该药能显著改善患者症状,临床总有效率达到了98.30%,同时具有良好的安全性[1]。

网络药理学是融合了生物学、药理学、生物信息学等多学科技术和内容的新兴学科,系统综合地预测与分析复方药物对疾病的影响,构建“药物—靶点—疾病”网络,探讨可能存在的作用机制[2-3]。本文基于前期临床研究结果,应用网络药理学对香藿喷雾剂的治疗作用机制进行预测和分析,并为后续研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 药物活性成分筛选、治疗靶点收集

香藿喷雾剂为云南省药物研究所研发和生产,其药物规格为每瓶 20 mL,每揿含广藿香挥发油2.86 mg(相当于生药材0.143 g)、香薷挥发油1.43 mg(相当于生药材0.15 g)、艾叶挥发油1.43 mg(相当于生药材0.37 g)、丁香挥发油0.714 mg(相当于生药材0.017 g)和薄荷挥发油0.714 mg(相当于生药材0.039 g)等。在中药系统药理学数据库和分析平台(http://tcmspw.com/tcmsp.php,TCMSP)中分别输入基本药方中的6味中药名称(广藿香、苍术、香薷、艾叶、丁香、薄荷),查找各自的有效化学成分,并依据口服生物利用度(oral bioavailability OB)和类药性(drug-likeness,DL)两个参数筛选目标成分,筛选条件为同时满足OB≥30%,DL ≥0.10两个条件,获得香藿喷雾剂的活性成分。将所得化合物成分通过 TCMSP 数据库进行成分的靶点获取,通过Perl脚本, 结合UniProt(https://www.uniprot.org/)数据库,标准化每种活性成分的药物靶点,物种限于“智人”,并将靶蛋白转化为相应的基因,同时汇总删除重复项。将药物、活性成分、靶点基因相对应,再将genesymbol与之对应。

1.2 疾病靶点筛选

在DisGeNET(https://www.disgenet.org)数据库中以“Corona virus disease 2019”( 简称COVID-19)为关键词进行检索,设置Scoregda≥0.98进行筛选导出到Excel, 在GeneCards(https://www.genecards.org)数据库中,Score值越高,表示该靶点与疾病关系越密切,若靶点过多则设定Score值大于中位数。分别将CTD(https://ctdbase.org/)以及PharmGKB(https://www.pharmgkb.org)数据库中得到的靶点基因导出, 输入到UniProt数据库中,校正基因,去除假阳性后,通过Excel对四个数据库所得基因进行查重合并。

1.3 蛋白相互作用网络构建

使用Venny[Venny2.1.0(csic.es)]绘制香藿喷雾剂活性成分与新冠肺炎相关靶点的韦恩图。在“List1”栏内输入有效活性成分的靶点,在“List2”栏内输入新冠肺炎的相关靶点,得到韦恩图及交集基因,交集基因即为香藿喷雾剂治疗新冠肺炎的潜在靶点。将交集基因输入String(https://cn.string-db.org/)数据库,设定属性为“人类”,置信度≥0.4,未连接的节点被隐藏,其余参数设置为默认值,得到蛋白相互作用网络图。其中节点代表蛋白质,边代表蛋白质之间的关系,绿色边表示基因邻域,红色边代表基因融合,深蓝色边代表基因共生,黑色边代表基因共表达。保存String的tsv文件,运用R(https://www．r-project．org/)软件分析degree,并排序,选取分值靠前的基因作为关键靶点。

1.4 化合物—靶点网络图绘制

运用Cytoscape_v3.7.2绘制香藿喷雾剂治疗新冠肺炎的“活性成分-靶点”网络图,将相应数据导入软件中,以“节点”(node)代表活性分子和靶点基因,“边”(edge)代表活性分子和靶点基因的相互关系。收集活性成分、靶点的连接度,得出关键活性成分和靶基因。

1.5 功能富集分析

将genesymbol转换为entrezID,在R软件中插入“colorspace”“DOSE”“pathview”“clusterProfiler”“stringi”包,运用R软件按照富集的数量和显著程度(pvalueCutoff=0.05,qvalueCutoff=0.05),对交集基因进行分析,取前20项画出柱状图和点状图。

1.6 通路富集分析

引用1.5安装的插件,运用R软件按照富集的数目和显著程度(pvalueCutoff=0.05,qvalueCutoff=0.05)进行分析,得到相应的通路图,取前20项画出柱状图和点状图。

1.7 分子对接

1.7.1 配体筛选 将获得的活性成分以连接度来评价其活性强度,选取连接度靠前的化合物木犀草素(luteolin)、汉黄芩素(wogonin)、柚皮素(naringenin)、山柰酚(kaempferol)作为分子对接的供体。先在PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库中查询2D结构,用ChemBiodraw画出其分子结构,将2D结构导入ChemBio3D软件,转化为3D结构,导入Autodocktools-1.5.6转换为pdbqt格式进行保存。

1.7.2 蛋白受体准备 结合各分子的节点度选取雌激素受体1(estrogen receptor 1, ESR1)、白介素6 (interleukin 6, IL-6)、霉菌原癌基因蛋白(myc proto-oncogene protein,MYC)、热休克蛋白90α家族A类成员1(heat shock protein 90 alpha family class A member 1, HSP90AA1)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、半胱氨酸蛋白8(Caspase 8, CASP8)、表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)、丝氨酸/苏氨酸激酶1 (serine/threonine kinase 1, Akt1)、半胱氨酸蛋白3(caspase 3, CASP3)、丝裂原激活的蛋白激酶1(mitogen-activated protein kinase 1,MAPK1)作为分子对接的靶点蛋白受体。将基因名输入Uniprot数据库,以ReviewedSwiss-prot和Human为条件进行过滤,获得EntryID,将ID号输入RCSBPDB(https://www.rcsb.org/)数据库,下载蛋白受体的结构,将其导入PyMOL和Autodocktools-1.5.6进行去水,加氢,合并非急性氢等处理,转换为pdbqt格式进行保存。

1.7.3 分子对接 运用Autodocktools-1.5.6的Grid功能确定活性口袋的位置,保存配置文件,运用Autodockvina1.1.2进行分子对接,得到各受体与供体的结合能。

2 结果

2.1 活性成分与靶点

在TCMSP数据库中,以OB≥30%,DL≥0.1为条件进行筛选,得到“藿香”的活性成分28个,靶点基因172个;“香薷”活性成分18个,共有330个靶点;“苍术”活性成分12个,有97个靶点;“艾叶”活性成分12个,共有83个靶点;“薄荷”活性成分13个,对应229个靶点;“丁香”活性成分11个,对应158个靶点。将靶点输入UniProt数据库进行校正,依据口服利用度选取前20项活性成分,见表1。

表1 香藿喷雾剂前20种活性成分

2.2 疾病靶点

在DisGeNET数据库中以“COVID-19”为关键词进行检索,设置Scoregda≥0.98,筛选得到405个与新冠肺炎相关的基因。在Gencards数据库中得到4585个相关基因。在CTD数据库中得到9875个基因,在PharmGKB数据库中得到9个基因,将4个数据库所得基因输入UniProt数据库校正查重合并得到11673个基因。

2.3 蛋白相互作用网络

运用Venny软件对药物化合物对应靶点1069个以及疾病靶点11673个取交集,得出交集基因150个,得到Venny图,见图1。将交集基因输入string数据库中得到蛋白相互作用网络,见图2。节点数为154,边数为890,平均节点度11.6,平均局部聚类系数为0.446,PPI富集P值:<1.0e-16。运用R软件分析得到节点度最高的基因为 Akt1,取前30位绘制柱状图,见图3。

注:紫色代表药物,黄色代表疾病,数字代表靶点个数。

图3 节点度前30位基因柱状图

2.4 化合物—靶点网络

将分析得到的药物和疾病的共同基因导入Cytoscape_v3.7.2,构建香藿喷雾剂与新冠肺炎的“活性成分-靶点”网络图,见图4。椭圆形代表活性成分,菱形代表基因靶点,活性成分中艾叶为天蓝色,薄荷为深蓝色,苍术为淡青色,丁香为紫红色,藿香为黄褐色,香薷为淡黄色,重复的活性成分为红色,基因靶点为深红色。运用Cytoscape_v3.7.2分析得到连接度较高的活性成分包括木犀草素(luteolin)、汉黄芩素(wogonin)、柚皮素(naringenin)、山柰酚(kaempferol)、金合欢素(acacetin)、葛花苷(irisolidone)芦荟大黄素(aloe-emodin)、金圣草黄素(chryseriol)。

图4 活性成分—靶点网络图

2.5 功能富集分析

引用相应插件,运用R软件按照富集的数量和显著程度(pvalueCutoff=0.05,qvalueCutoff=0.05),对交集基因进行分析,共获得166条功能,取前20项画出柱状图和点状图,见图5及图6。柱状图中横坐标表示富集的基因数量,纵坐标表示基因名,p.adjust(校正后P值)数值越小表示显著性越高,其颜色越红。点状图中横坐标代表基因所占比例,纵坐标代表基因名,圆圈的大小代表富集的基因数目,p.adjust同柱状图。基因富集数目较多的功能为:DNA结合转录因子结合、RNA聚合酶II特异性DNA结合转录因子结合、酰胺结合、丝氨酸苏氨酸激酶活性的蛋白、泛素样蛋白连接酶结合、磷酸酶结合、肽结合、蛋白丝氨酸激酶活性、细胞因子受体结合、泛素蛋白连接酶结合。

图5 基因功能柱状图

图6 基因功能点状图

2.6 通路富集分析

引用相应插件,运用R软件按照富集的数量和显著程度(pvalueCutoff=0.05,qvalueCutoff=0.05)进行过滤,获得171条通路,取前20项通路绘制柱状图见图7,点状图见图8。柱状图中横坐标表示富集的基因数目,纵坐标表示基因名,p.adjust(校正后P值)数值越小表示显著性越高,其颜色越红。点状图中横坐标代表基因所占比例,纵坐标代表基因名,圆圈的大小代表富集的基因数目,p.adjust同柱状图。富集基因数目较多的通路:血脂与动脉粥样硬化、化学致癌—受体激活、糖尿病并发症中的晚期糖基化终产物受体(advanced glycosylation end products-receptor of advanced gly-cosylation end products, AGEs-RAGE)信号通路、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(phosphoinositide 3-kinase/protein kinase B, PI3K-Akt)信号通路、神经退行性变的途径——多种疾病、人巨细胞病毒感染、乙型肝炎、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染、流体剪切力与动脉粥样硬化、化学致癌作用—活性氧物种。

2.7 分子对接结果分析

运用Autodockvina1.1.2进行分子对接,得到4种配体与10种蛋白受体的结合能。供体与受体蛋白分子对接的结合能越低,两分子间结合的构象越稳固,发生的相互作用可能性越大。结合能小于或等于0时为受体和配体可自由结合。笔者查阅相关文献分析后,以结合能≤-5.0 kcal/mol和结合能≤-7.5 kcal/mol为筛选条件,结合能≤-5.0 kcal/mol时结合的较好[4],结合能≤-7.5 kcal/mol结合的非常好[5]。分子对接结果,表明核心靶点与重要化合物可以很好地结合,见表2。

表2 活性成分与靶点对接分子结合能

3 讨论

香藿喷雾剂借鉴了古代香薰疗法,是将传统名方与现代科技结合研制出的喷雾剂,具有芳香化浊、辟秽祛湿等功用。复方中药多成分、多靶点、多通路的特点体现了中医的整体观念,网络药理学构建的“化合物—靶点”网络正符合这种特点,适用于对中药复方的预测研究,其不同于以往的单药、单靶点研究,为中药今后的研究提供了新思路,为中医现代化拓宽了道路,符合中西医结合的发展趋势。

本研究预测了香藿喷雾剂的主要活性成分及作用靶点,并查阅相关文献,进一步验证了本研究的可靠性。通过靶点网络分析其主要化合物包括木犀草素、柚皮素、汉黄芩素、山柰酚、金合欢素等,蛋白互作网络分析其主要靶点有Akt1、 ESR1、 IL-6、MAPK3、 MAPK1等。功能分析显示其化合物主要作用为DNA结合转录因子结合、RNA聚合酶II特异性DNA结合转录因子结合、酰胺结合、丝氨酸苏氨酸激酶活性的蛋白、泛素样蛋白连接酶结合。其主要通路包括血脂与动脉粥样硬化、PI3K-Akt信号通路、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)信号通路、MAPK信号通路、IL-17信号通路等。91条通路含有Akt1,96个靶点与其紧密相连;46条通路含有IL-6,68个靶基因与其相关联;108条通路含有MAPK3,78个靶点与其相关;119条通路含有MAPK1,70个靶点与其相关。依据基因富集数目进行排序,前20位通路中有9条涉及病毒感染,2条涉及动脉粥样硬化,1条涉及炎症反应。前40位通路中,10条涉及病毒感染,4条涉及炎症反应,2条涉及动脉粥样硬化。据此可知信号通路主要富集于血脂与动脉粥样硬化,病毒感染和炎症反应等通路。分子对接结果表明核心靶点与重要化合物可以很好地结合。所以香藿喷雾剂可能通过木犀草素、柚皮素、汉黄芩素等化合物,作用于Akt1、ESR1、IL-6等靶点,调节抗病毒、抗炎症、脂质等方面的信号通路发挥治疗新冠肺炎的作用。

3.1 香藿喷雾剂重要化合物

据本研究所含化合物预测香藿喷雾剂各组分具有抗炎、抗病毒、调节免疫等药理作用[6-12],部分化合物还有调节血脂代谢的作用[13]。木犀草素能够抑制PI3K-Akt、丝裂原激活的蛋白激酶/激活蛋白1(mi- togen-activated protein kinase /activator protein 1, MAPK/AP-1)等通路[14]的传导。其还能通过抑制肺部炎症中的MAPK信号路径来减少脂多糖引起的急性肺损伤[15]。并且其具有广泛的抗病毒活性,木犀草素与严重急性呼吸综合征冠状病毒2型(Severe acute respiratory syndrome coronavirus type 2, SARS-Cov-2)表面刺突蛋白特异性结合,从而抑制病毒进入宿主细胞,并且抑制病毒感染所需的严重急性呼吸系统综合征冠状病毒3-糜蛋白酶样蛋白酶(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 3-chymotrypsin-like, SARS-Cov3cl)[16]。

3.2 核心靶点及功能分析

通过功能分析及通路分析,香藿喷雾剂治疗疾病的可能靶点为Akt1。Akt是一种丝氨酸/苏氨酸激酶,包括Akt1、Akt2、Akt3。Akt1也称为蛋白激酶B,其主要功能为调节细胞存活,参与胰岛素信号传导,在血管生成和肿瘤形成方面发挥关键作用。活性Akt1具有促进病毒蛋白合成的作用[17],Akt1的显性阴性突变体可以显著抑制RNA病毒表达,并进一步降低病毒衣壳蛋白表达和病毒释放[18]。运用Akt抑制剂,与SARS-CoV-2感染相关的CXCL9、CXCL10和CXCL11基因表达显著减少[19]。

3.3 信号通路分析

Akt是PI3K途径的下游介质,Akt的激活依赖于PI3K途径,Akt/PI3K是许多信号通路的关键组成部分。PI3K/Akt信号传导路径可能涉及到病毒进入细胞。新冠病毒进入细胞有两种主要受体:血管紧张素转换酶2(angiotensin-converting enzyme 2,ACE2)和CD147,CD147可以诱导PI3K-Akt路径的激活。研究表明,PI3K-Akt信号通路调节相关网格蛋白从而介导SARS-CoV-2内吞作用的发生[20]。SARS-CoV-2通过上调细胞内活性氧水平来抑制磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/ 雷帕霉素靶蛋白(phosphoinositide 3-kinase/protein kinase B/mammalian target of rapamycin, PI3K/AKT/mTOR) 途径,从而促进自噬反应。SARS-CoV-2诱导的自噬会触发感染细胞的炎症反应和凋亡[21]。抑制PI3K/Akt信号转导通路可以抑制核因子-κB(nuclearfactorkappa-B, NF-κB)和AP-1,最终抑制IL-6等炎症细胞因子和TNF-α的表达[22]。脂蛋白(a)在动脉粥样硬化、动静脉血栓形成中具有关键作用,有报道称在新冠肺炎炎症风暴后,IL-6可能诱导脂蛋白(a)水平的增加,说明脂蛋白(a)与炎症通路之间存在一定联系[23]。有研究发现新冠肺炎患者血浆中高密度脂蛋白胆固醇(high-density lipoprotein cholesterol,HDL-C)水平降低,其降低与炎症标志物C反应蛋白水平升高以及细胞因子风暴的产生可能具有关联。低浓度的HDL会促进SARS-CoV-2介导的感染,但较高的HDL颗粒浓度则会抑制SARS-CoV-2感染[24]。SARS-CoV-2为RNA病毒所以不可忽略脂质在新冠肺炎中的作用。

据本研究预测香藿喷雾剂可能通过调节脂质减少新冠病毒的复制,可能通过木犀草素等化合物抑制PI3K-Akt通路表达,活性Akt1相应减少,病毒蛋白合成减少,病毒进入细胞相应减少,并减轻细胞中IL-6等细胞因子引起的炎症反应。木犀草素、柚皮素对新冠肺炎的治疗作用已有相关基础研究证实,本课题组拟通过液相色谱-质谱分析出主要化合物,构建小鼠疾病模型,通过随机对照实验验证其余化合物对新冠肺炎的治疗作用。拟通过实时荧光定量PCR、蛋白免疫印迹法等方法检测组织中Akt1含量以及 PI3K-Akt通路的变化表达情况,为本研究作进一步的支持。

综上所述,本研究采用网络药理学的技术手段和分子对接技术对香藿喷雾剂的活性成分和靶点进行了系统性研究,阐释了其对新冠肺炎的分子作用机制,突出了中药制剂多成分、多靶标对机体整体调控的特点,为其治疗新冠肺炎提供了理论支持。本研究尚存在一定局限性,目前还迫切需要进一步广泛的研究和临床试验,包括有更多患者的临床试验及药理学试验,以进一步确认这些药物的疗效及机制,以便为新冠肺炎患者提供更好的治疗方案。