化栓通脉方调节自噬抗动脉粥样硬化的实验研究

路爱梅 李洪峥 杨文文 彭煜暄 魏玥 龙霖梓 曲华 吴汉涛 付长庚

2019年全球疾病负担研究结果表明,以缺血性心脏病和卒中为主的动脉粥样硬化性心血管疾病(atherosclerotic cardiovascular disease, ASCVD)是引起全球人口死亡的首要原因,占全球总死亡人数的三分之一[1],给人类健康带来严重的危害。动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)是ASCVD的病理基础,其成因复杂,其中脂质代谢紊乱、免疫和炎症贯穿AS病变始终[2-3]。自噬是在自噬相关基因的调控下,利用溶酶体自我降解后再利用,维持细胞能量稳态的过程[4],对AS的调控更具有双向作用——在AS早期内皮通过自噬调节脂质代谢、减轻炎症反应,从而抑制斑块的形成,晚期随着斑块的进展而变得功能失调[5]。因此,维持自噬的动态平衡对抑制AS的恶性发展极为重要。

化栓通脉方是本课题组根据临床治疗AS患者总结而来的经验方,用于改善冠状动脉、颈动脉粥样硬化斑块,临床疗效确切。但其在动物体内研究中,是否具有抗AS效应及其作用机制有待进一步研究。有鉴于此,本实验从血清脂蛋白、炎症因子、斑块面积等方面,综合评价化栓通脉方调节ApoE基因敲除(ApoE knockdown, ApoE-/-)小鼠主动脉粥样硬化斑块的效应,并初步探索其是否通过调控自噬而发挥抗AS作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物及实验环境

8周龄SPF级雄性C57BL/6J小鼠10只,同品系ApoE-/-小鼠43只,体质量(22±2)g,购于斯贝福(北京)生物技术有限公司[许可证号:SCXK(京)2019-0010]。小鼠饲养于北京了未元医药科技公司动物实验中心[许可证号:SYXK(京)2022-0007],温度(22±2)℃,湿度(50±10)%,明/暗周期(12/12)小时。动物自由进食、饮水。动物伦理审查批号:SYXK2022-0007。

高脂饲料(83.5%基础饲料+15%猪油+1.5%胆固醇)和普通饲料均由北京华阜康生物科技有限公司[许可证号:SCXK(京)2019-0008]提供。

实验过程中,动物灌胃致死3只,剔除各组离群值,各组统计数量均为7只。

1.2 实验药物

辛伐他汀片(杭州默沙东制药有限公司,规格:20 mg/片,批号:U04517)。化栓通脉方药物组成及剂量:金银花15 g、山楂15 g、鸡血藤15 g、制何首乌15 g、生白芍7.5 g、生甘草4 g。中药饮片皆购于九州通医药集团股份有限公司,经北京中医药大学吴嘉瑞教授鉴定,均符合2020版《中国药典》要求。

辛伐他汀片用生理盐水配置成混悬液,浓度为0.3 mg/mL。化栓通脉方各药物按组方比例,称取715 g,用2000 mL蒸馏水煎煮2次,然后浓缩至715 mL的中药混悬液,每毫升含生药量1 g,浓度为1 g/mL,4℃保存,备用。

用药剂量参考公式:高剂量给药剂量=成人(70 kg)临床常用量×12(按人—小鼠体表面积折算等效剂量系数)。以成人(70 kg)每日金银花15 g、山楂15 g、鸡血藤15 g、制何首乌15 g、生白芍7.5 g、生甘草4 g,共71.5 g,生药计算高剂量组小鼠每日等效剂量为12 g/kg,高、低剂量组给药剂量按2∶1设置,低剂量组小鼠每日给药剂量为6 g/kg。辛伐他汀片成人给药剂量为每日20 mg,换算获得辛伐他汀组小鼠每日灌胃剂量为3 mg/kg。

1.3 主要试剂与仪器

白细胞介素(interleukin,IL)-1β、γ干扰素(interferon gamma,IFN-γ)、IL-10、IL-4 ELISA试剂盒(武汉赛维尔生物科技有限公司,批号分别为EK201BHS-96、EK280/3-96、EK210/4-96、EK204HS-96);油红O染色试剂盒(北京索莱宝科技有限公司,批号G1016);苏木素—伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色试剂盒(北京索莱宝科技有限公司,批号G1120);Russell改良Movat五色染色试剂盒(北京索莱宝科技有限公司,批号G3701);抗-SQSTM1/P62兔pAb、抗-LAMP2兔pAb、抗LC-3A/B兔pAb(武汉赛维尔生物科技有限公司,批号分别为GB11239-1、GB11330、GB11124)。

台式高速冷冻离心机(大龙,型号D3024R),酶标检测仪(美国BioTeK公司,型号Epoch),全自动生化分析仪(深圳雷杜生命科技,型号分别为Chemray 240、420、800),荧光显微镜(宁波舜宇仪器有限公司,型号2204926),光学显微镜(DMi1,型号Leica),组织切片机(浙江省金华市科迪仪器公司,型号KD-ST5500)。

1.4 动物分组、给药及取材

适应性喂养1周,10只C57BL/6J小鼠作为对照组,全程采用普通维持饲料喂养。43只ApoE-/-小鼠采用高脂饲料喂养8周后,随机抽取3只取材,主动脉窦病理切片HE染色显示:主动脉管腔狭窄,内膜明显增厚,有明显斑块形成,提示早期AS体内模型建立成功。造模后的ApoE-/-小鼠随机分为4组:模型组、辛伐他汀组(3 mg/kg)、化栓通脉方低剂量组(6 g/kg)、化栓通脉方高剂量组(12 g/kg),每组10只,继续高脂饲料喂养,用药组同时予以相应药物灌胃,对照组和模型组予等体积生理盐水灌胃以保证组间一致性,每日灌胃1次,连续6周。

最后一次灌胃后,禁食、不禁水12小时。用3%戊巴比妥钠腹腔麻醉,球后静脉(眼眶静脉丛)取血,室温静置2小时,4℃ 4 000r/min离心10分钟,分离上层血清,-80℃下冻存。取血后打开小鼠胸腔及腹腔,经PBS充分灌流,整体分离自主动脉根部至髂总动脉分叉处主动脉,并剥离周围多余结缔组织和脂肪组织,投入液氮或组织固定液中保存,用于后续相关实验。

1.5 指标检测

1.5.1 酶标法测定小鼠血脂水平 每组取7只小鼠,使用全自动生化分析仪测定各组小鼠血清中总胆固醇(total cholesterol,TC)、甘油三酯(triglyceride,TG)、低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterol,LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein cholesterol,HDL-C)的水平。

1.5.2 ELISA法检测血清炎症因子水平 每组取7只小鼠,根据ELISA试剂盒说明书操作,检测小鼠血清中IL-1β、IFN-γ、IL-10、IL-4的水平。

1.5.3 大体油红O染色测定整体主动脉相对斑块面积 每组取3只小鼠,在光学显微镜下将小鼠主动脉纵剖面固定,水洗,油红O染色后将血管平铺于黑色橡胶板,迅速拍照,利用Image J软件分析以主动脉相对斑块面积来评价主动脉斑块严重程度。相对斑块面积(%)=主动脉斑块面积/血管内膜总面积×100%。

1.5.4 HE染色评价主动脉窦病理形态 每组取3只小鼠,4%多聚甲醛固定主动脉于4℃冰箱24小时,梯度脱水后石蜡包埋,并连续切片(5 μm),HE常规染色后封片拍照,于光学显微镜下检测AS小鼠主动脉窦病理形态的变化,测量并计算斑块面积占血管内膜面积百分比。相对斑块面积(%)=斑块面积/内膜总面积×100%。

1.5.5 Russell-Movat染色评价主动脉窦斑块成分 每组取3只小鼠,主动脉石蜡切片处理,切片厚度5 μm,连续切片至观察到3个主动脉瓣完全融合开始留取10张切片,切片脱蜡至水,经五色法染液进行染色,脱水封片,在光学显微镜下观察主动脉窦斑块各成分变化,染色后的细胞核和弹性纤维呈黑色,胶原纤维呈红色,泡沫细胞呈淡紫色,蛋白聚糖呈蓝色。测量并计算斑块内泡沫细胞及胶原纤维的占比。

1.5.6 免疫荧光法评价主动脉窦溶酶体关联膜蛋白2(lysosomal associated membrane protein 2,LAMP2)、轻链蛋白3A/B(light chain 3A/B,LC3A/B)、P62蛋白的表达 每组取3只小鼠,主动脉窦石蜡切片,常规脱蜡、水化、抗原修复后,血清室温封闭30分钟,滴加一抗4℃孵育过夜,PBS浸洗3次,次日滴加荧光二抗25℃避光孵育1小时,PBS浸洗3次,滴加DAPI避光孵育5分钟复染细胞核,PBS浸洗4次,最后用含抗荧光的淬灭剂封片。使用荧光显微镜观察主动脉窦的LAMP2、LC3A/B、P62蛋白荧光表达,并采集图像,利用Image J分析处理数据。

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 化栓通脉方对小鼠血脂水平的影响

相比于对照组,模型组小鼠血清中TC、TG、LDL-C水平明显升高,HDL-C水平明显降低,差异具有统计学意义(P<0.05);相比于模型组,辛伐他汀组和化栓通脉方低、高剂量组血清中TC、TG、LDL-C水平均显著降低,HDL-C水平均显著升高,差异具有统计学意义(P<0.01)。见表1。

表1 各组AS模型小鼠血脂水平比较

2.2 化栓通脉方对小鼠血清炎症因子水平的影响

与对照组相比,模型组血清中IL-1β、IFN-γ含量显著上升,差异具有统计学意义(P<0.01),IL-10、IL-4含量也有所升高,但无统计学意义(P>0.05);与模型组相比,化栓通脉方高剂量组血清中IL-1β、IFN-γ含量显著降低,IL-10、IL-4含量显著升高,差异具有统计学意义(P<0.01);化栓通脉方低剂量组较模型组IFN-γ含量降低,IL-4含量升高,差异有统计学意义(P<0.01),IL-1β含量降低,IL-10含量升高,差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 各组AS模型小鼠血清炎症因子比较

2.3 化栓通脉方对小鼠整体主动脉斑块面积的影响

主动脉大体油红O染色显示,对照组小鼠主动脉血管壁大体光滑、平整,呈半透明状,见有少量点状斑块散在分布;高脂饲料喂养14周,模型组小鼠主动脉管腔病理性扩增,管壁存在大量的红染的点片状脂质斑块,且多分布在主动脉弓及血管分叉处。相比对照组,模型组主动脉窦部斑块面积明显增加(P<0.01);相比模型组,化栓通脉方低、高剂量组小鼠主动脉窦部斑块面积均明显减少(P<0.01)。见图1及表3。

注:A 对照组;B 模型组;C 辛伐他汀组;D 化栓通脉方低剂量组;E 化栓通脉方高剂量组。

表3 各组小鼠AS模型小鼠斑块面积占比(大体油红O染色)

2.4 化栓通脉方对小鼠主动脉窦病理形态的影响

主动脉窦HE染色显示,对照组小鼠主动脉内膜光滑完整,内膜下无明显泡沫细胞和脂质沉积形成,中层平滑肌细胞排列整齐;模型组小鼠主动脉内膜增厚明显,内膜下可见大量泡沫细胞和脂质沉积,中层平滑肌细胞增殖且排列紊乱;与模型组相比,化栓通脉方高剂量干预后,小鼠主动脉窦内膜厚度、泡沫细胞数量及脂质沉积明显减轻(P<0.01)。见图2,表4。

注:A 对照组;B 模型组;C 辛伐他汀组;D 化栓通脉方低剂量组;E 化栓通脉方高剂量组。

表4 各组小鼠AS模型小鼠斑块面积及成分占比

主动脉窦Russell-Movat染色结果显示,对照组内膜未见明显斑块,内皮细胞结构完整,弹力纤维弯曲连续,富有弹性,中膜血管平滑肌排列整齐,周围分布少量胶原纤维和网状纤维结构;模型组可见内膜斑块显著突向管腔,斑块内部有大量泡沫细胞和脂质堆积,斑块表面有大量炎症细胞浸润黏附,平滑肌细胞大量增生,排列紊乱,血管中膜失去连续性,弹力纤维绷直、失去弹性,胶原纤维、网状纤维排布错乱。化栓通脉方干预后主动脉窦Movat染色显示:斑块炎症细胞浸润黏附有所减轻,脂质堆积有所减少,胶原纤维结构稳定,覆盖包裹在脂质表面,血管中膜连续性较模型组有所改善(P<0.05),表明化栓通脉方促进斑块稳定,减少AS的发展。见图3,表4。

注:A 对照组;B 模型组;C 辛伐他汀组;D 化栓通脉方低剂量组;E 化栓通脉方高剂量组。

2.5 化栓通脉方对小鼠主动脉窦自噬相关蛋白表达的影响

免疫荧光结果显示,与对照组相比,模型组小鼠主动脉中LAMP2、LC3A/B、P62的表达升高,差异有统计学意义(P<0.05);与模型组相比,化栓通脉方高剂量干预后,AS模型小鼠主动脉窦中LAMP2、LC3A/B表达升高(P<0.01),P62的表达降低(P>0.05)。见图4,表5。

注:A 对照组;B 模型组;C 辛伐他汀组;D 化栓通脉方低剂量组;E 化栓通脉方高剂量组。

表5 各组AS模型小鼠主动脉窦自噬蛋白表达情况比较

3 讨论

在AS的中医药防治中,瘀与毒是导致易损斑块形成及破裂的主要病理因素。稳定斑块和血栓属于“内阻瘀血”,各种炎症因子属于“内生毒邪”,瘀为常,毒为变,由常生变,因瘀致毒,毒瘀互结,AS易损斑块在瘀血基础上“毒邪”致病,治当以解毒化瘀[6-9]。化栓通脉方以金银花为君,解毒清热,直击病本;山楂行气散瘀化浊,鸡血藤祛瘀养血通络,制何首乌、白芍养血益精,敛阴止痛,共为臣药;甘草清热解毒,调和诸药。上述药物合用,共奏解毒化瘀、养血通络之效。

现代药理学研究指出,化栓通脉方通过多成分、多靶点、多途径,发挥抗AS作用——金银花、山楂、鸡血藤、白芍都具有抗炎、抗氧化、抗血小板聚集的作用[10-12],山楂还可调节血脂代谢及改善血管内皮功能,鸡血藤可调节造血系统[13-14],制何首乌可补血、抗衰老、降血脂[15],白芍可通过调节免疫、抑制细胞凋亡、促进胆固醇流出等途径抗AS[16-17]。由此可知,化栓通脉方中药物成分可能通过抑制斑块内炎症反应、改善脂质代谢和血流动力学,从而降低斑块恶化破裂风险。故本研究旨在通过探讨化栓通脉方对ApoE-/-小鼠抗AS的作用及其机制,为其临床应用提供理论依据和数据支撑。

3.1 化栓通脉方通过降脂、抗炎实现抗AS作用

AS是一种慢性炎症性血管疾病,脂质代谢紊乱与炎症因子升高会导致血管内皮功能受损,引起血管内壁脂质堆积及斑块和血栓的形成,与AS的生成与发展密切相关[3,18],促炎和抗炎机制的平衡决定着AS的结局,是病情转化和恶化的关键[19]。有鉴于此,调节血脂代谢、抑制炎症反应在AS的治疗中占有重要地位。本研究表明,化栓通脉方可调节血清脂蛋白、炎症因子水平。研究结果指出,相比于模型组,高、低剂量化栓通脉方组血清中TC、TG、LDL-C水平均显著下降,HDL-C水平显著上升,促炎因子IL-1β、IFN-γ含量降低,抑炎因子IL-10、IL-4含量升高,斑块面积、泡沫细胞和胶原纤维相对占比明显减小,且随化栓通脉方浓度升高而存在一定差异。由此表明,化栓通脉方可能通过调节血脂代谢、降低血清炎症因子水平,减少主动脉斑块面积,实现抗AS作用。

3.2 化栓通脉方抗AS作用可能与诱导细胞自噬有关

自噬是细胞自身的分解代谢机制,对AS具有重要影响,其水平主要通过自噬标志物(自噬体和自噬溶酶体)和自噬蛋白标志物的水平进行评价[20-21]。自噬体作为自噬过程的标志性结构,是检测自噬的唯一金标准,而LC3是最可靠的自噬体标志物,其表达水平与自噬体数量呈正相关;LAMP2是溶酶体标志物,其表达水平与自噬溶酶体亦呈正相关;P62是自噬的特异性底物,其表达水平与自噬潮呈负相关。本研究免疫荧光结果显示,模型组较对照组具有高水平的LC3A/B、LAMP2共定位,表明自噬的募集是对新兴斑块的应激反应。化栓通脉方组较模型组LC3A/B、LAMP2的表达上调、P62的表达下调,且高剂量组比低剂量组自噬蛋白表达更为显著,表明化栓通脉方可增加自噬通量,升高自噬水平,起到抗AS作用,并与剂量呈相关关系。

综上所述,化栓通脉方可能通过诱导细胞自噬,调节脂质代谢、减弱炎症反应,从而抑制斑块形成与进展,达到防治AS的作用,具体机制通路有待进一步实验验证。