Fenton法对剩余污泥中抗性基因及耐药菌的去除研究

洪 雯，何漾舟，肖芯雨，王子木，赵 鑫，罗 玲

（1.四川农业大学环境学院，四川成都 611130； 2.浙江大学环境与资源学院，浙江杭州 310030）

近年来，由于抗生素滥用而导致的环境问题引起了人们的广泛关注〔1〕。有研究表明，2030 年全球抗生素使用量将会达到1.5×105t，约为2010 年的1.67倍〔2〕。实际上，人们对抗生素污染的关注不仅源于其造成的化学污染，还因为其能够诱使环境中抗生素抗性基因（Antibiotic resistance genes，ARGs）和抗生素耐药菌（Antibiotic resistance bacteria，ARB）出现，并在水、大气、土壤等不同环境介质中富集和传播。ARGs 和ARB 的出现已经严重影响到现代医药产品的疗效，对人类健康和生态环境带来严重威胁〔3-5〕。研究显示，污水处理厂（Waste water treatment plant，WWTP）是ARGs和ARB 的重要储存库和传播源〔6〕，已有氨基糖苷类（Aminoglycoside）、β-内酰胺类（β-Lactam）和喹诺酮类（Quinolone）等多种ARGs 在WWTP中被发现〔7〕。有学者发现，ARGs 和ARB 在WWTP 中的丰度也明显高于在其他自然环境中，并随着污水和污泥的资源化利用，造成周围环境的污染〔8-9〕。目前，我国剩余污泥处置途径主要包括卫生填埋、焚烧、资源化利用等。截至2019 年底，我国剩余污泥约有29.3%（3 904 万t）被资源化利用，约分别有26.7%、20.1%被焚烧和卫生填埋〔10〕。研究表明，污泥资源化利用产品施用于农田会导致土壤中ARGs丰度和多样性大幅度增加，并可能通过食物链传播ARGs 污染〔11-12〕。此外，由于WWTP 具有较高的微生物密度和抗生素浓度，可以对微生物造成持续性的选择压力〔13〕，导致ARGs 在细菌间不断交换和重组，这为ARGs 在不同细菌之间的水平转移提供了条件，甚至一些非抗性菌也能通过水平基因转移获取ARGs形成新的ARB，进而加剧ARGs 和ARB 污染〔14-15〕。因此，对剩余污泥中ARGs和ARB的去除值得关注。

Fenton 氧化法是去除难降解、高浓度有机污染物的一种常用手段，其是一种利用·OH 的强氧化性对废水进行有效处理的高级氧化工艺〔16〕。近年来，基于Fenton 法的污泥处理方法由于成本低、效率高、对环境影响小而被广泛应用于剩余污泥资源化利用的预处理。同时，已有学者利用Fenton 法及其衍生方法去除环境中的ARGs。比如，P. KARAOLIA 等〔17〕将膜生物反应器（MBR）结合太阳光Fenton 氧化去除特定的与抗生素相关的微污染物，研究结果表明，该工艺能使大肠埃希菌（Escherichia coli）、铜绿假单胞菌（P.aeruginosa）和克雷伯菌（Klebsiellaspp.）完全灭活，去除的总ARGs超过97%，但耐药基因sul1和ermB未被完全清除；Ling LUO等〔18〕采用Fenton 法对剩余污泥中的四环素类ARGs进行处理，ARGs 去除率为48.02%~76.36%；Min WANG等〔19〕利用电Fenton技术处理活性污泥，有效削减了污泥中的大肠杆菌丰度，但处理后大肠杆菌等仍会一定程度再生。以上研究表明，Fenton处理能高效降低ARGs丰度但无法去除全部ARGs，且目前对Fenton处理后污泥中ARB 生长分布情况的研究也较少。

本研究以成都市温江区某生活污水处理厂二沉池剩余污泥为对象，采用宏基因组学方法，探究Fenton处理对ARGs和ARB的去除效果，并推测经Fenton处理后污泥可能存在的ARGs的潜在危害，以期为剩余污泥中ARGs和ARB 的有效处理处置提供参考。

1 材料与方法

1.1 样品采集

实验所用剩余污泥均采自四川省成都市温江区某生活污水处理厂二沉池（脱水前），该污水处理厂采用改良氧化沟工艺，污水处理规模约为30 000 t/d，出水水质达到《城镇污水处理厂污染物排放标准》（GB 18918—2002）一级B 标准。剩余污泥样品采集后立即带回实验室，分成两份，一份采用真空冷冻干燥机进行冻干，72 h 后取出置于-20 ℃冰箱内保存待用；另一份不做处理，置于密封容器中于4 ℃冰箱内保存，用于理化性质测定等。

1.2 剩余污泥理化性质测定

采用电位法测定污泥样品pH；参照国家标准《城市污水处理厂污泥检验方法》（CJ/T 221—2005）测定污泥样品含水率、有机质含量、混合液悬浮固体质量浓度（MLSS）和污泥体积指数（SVI）；采用元素分析仪（Master-sizer 2000，Malvern，UK）测定样品总碳（TC）和总氮（TN）；采用钼锑抗分光光度法测定样品总磷（TP）。以上测定结果见表1。

表1 剩余污泥的理化性质Table 1 Physicochemical properties of excess sludge

1.3 Fenton 处理条件

参考Ling LUO 等〔18〕研究结果，选用实验最佳条件对污泥样品进行Fenton 处理。取3 份250 mL 平行污泥样品分别置于500 mL 已灭菌的烧杯中，调节样品pH至2.73，放置于搅拌器下，设置搅拌器转速为250 r/min，加入5.54 mmol/L Fe2+和9.89 mmol/L H2O2，随后立即开启搅拌，搅拌2 h，搅拌停止后分别加入1 mL 叔丁醇终止反应，之后将样品收集并立即放入冷冻干燥机冻干72 h。

1.4 ARGs 及移动遗传元件（MGEs）丰度测定

将处理前污泥样品（记作WH）和Fenton 处理后污泥样品（记作FH）送往上海凌恩生物科技有限公司进行宏基因组测定。采用E. Z. N. A.®stool DNA Kit（Omega Bio-tek，Norcross，GA，USA）试剂盒提取样品DNA，采用超微量分光光度计（Nanodrop2000）检测DNA 纯度和浓度，结果见表2。

表2 各样品DNA 浓度及纯度Table 2 Concentration and purity of DNA extracted from each sample

由表2 可知，所提取DNA 纯度较高，满足测序要求。将合格DNA 样品在Illumina HiSeq X 仪上测序，每个样本的clean reads 分类由Kraken〔19〕数据库确定，得到ARGs 和MGEs 的种类及丰度数据。

1.5 ARB 培养

选取卡那霉素、诺氟沙星、罗红霉素、四环素、氨苄青霉素钠5种常见抗生素按照如下步骤进行ARB培养。

1）制作平板。称取Luria-Bertani（LB）营养琼脂40 g溶于1 000 mL 水中后置于高压灭菌锅中，在121 ℃下灭菌30 min，灭菌完成后待培养基冷却至约40 ℃时，将卡那霉素以质量浓度50 g/L 加入并混合均匀。含卡那霉素的培养基制作完成后，在超净工作台中将15~20 mL 培养基倒入培养皿中，静置待其凝固，得到含卡那霉素的培养基平板。

按照上述方法，将卡那霉素分别替换为10 g/L 诺氟沙星、10 g/L 罗红霉素、10 g/L 四环素、200 g/L 氨苄青霉素钠，制备得到含以上各抗生素的培养基平板。平板制作完成后在超净工作台中放置1~3 d 待用。

2）涂布培养。将污泥样品稀释至浓度为原来的10-2、10-3、10-4，吸取0.1 mL 稀释后的污泥菌液加入平板，用灭菌玻璃珠进行涂布。涂布后的平板放置于37 ℃恒温培养箱中培养72 h，每隔12 h观察菌落形态及数目。

3）单菌落培养。经涂布培养72 h 后，记录不同抗生素平板上生长的菌落。挑取不同形态的菌落在相对应的抗生素平板上进行划线，划线后的平板放入37 ℃恒温培养箱中培养3~7 d，分离出单菌落。之后将单菌落样品送往上海凌恩生物科技有限公司进行菌种鉴定，得到菌种序列号，将序列号在美国国家生物技术信息中心（NCBI，https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）数据库中进行序列同源性检索比对。

1.6 数据处理及分析

依照式（1）、式（2）分别计算ARGs 丰度去除量（lg removal value，LRV）和ARGs 去除率。

式中：A0——Fenton 处理前ARGs 丰度，copies/g；A——Fenton 处理后ARGs 丰度，copies/g。

采用Origin Pro 2021 作ARGs、MGE 及群落结构的丰度变化图；采用TBtools〔20〕绘制热图；将筛选出的ARB的序列号在NCBI数据库中进行同源比对后，得到相似菌种序列号，导入MEGA-X 制作系统发育树。

2 结果与讨论

2.1 抗性基因丰度分析

在Fenton 处理前后的两种污泥样品中共检测到了24 类1 265 种ARGs，根据产生耐药性的抗生素类别可将其分为磺胺类（Sulfonamide）、四环素类（Tetracycline）、大环内酯类/林肯酰胺类/链阳性菌素类（MLS）、β-内酰胺大类（β-lactam）和氨基糖苷大类（Aminoglycoside）等。

Fenton 处理前后污泥样品ARGs 的绝对丰度与相对丰度见图1。

图1 Fenton 处理前后样品ARGs 的绝对丰度与相对丰度Fig. 1 Absolute and relative abundances of ARGs before and after Fenton treatment

如图1 可知，Fenton 处理前污泥样品中ARGs 绝对丰度达到了1.10×108copies/g，经过Fenton 法处理后绝对丰度降低了0.48log，去除率达到了67.36%，表明Fenton 处理可有效去除污泥中ARGs。这可能是由于Fenton 处理后污泥内生物量减少，难以为ARGs 提供更多潜在宿主所致。

相较于处理前，经Fenton 处理后各种类ARGs绝对丰度增量（-LRV）见图2。

图2 Fenton 处理后样品中各种类ARGs 增量Fig. 2 ARGs increments after Fenton treatment

由图2 可知，经Fenton 处理后特曲霉素类（Tetracenomycin）、春日霉素类（Kasugamycin）、喹诺酮类（Quinolone）和磷霉素类（Fosfomycin）ARGs 的丰度变化最大，相较于处理前分别降低了1.12log、1.04log、0.78log、0.69log，去除率分别为92.38%、90.84%、83.22%、79.41%；嘌呤霉素类（Puromycin）、特曲霉素类（Tetracenomycin）、春日霉素类（Kasugamycin）的ARGs去除率最高，分别为100%、92.38%、90.84%；而β-内酰胺类、氯霉素（Chloramphenicol）和MLS类ARGs的去除率最低，分别为30.31%、56.35%和56.14%，这说明Fenton 法难以对这几类ARGs 产生较好的削减效果。值得注意的是，博莱霉素类（Bleomycin）和碳霉素类（Carbomycin）ARGs 在Fenton 处理后丰度分别升高了0.35log和0.06log，推测其在Fenton处理后恢复较快，去除难度较大，在污泥中的残留可能具有潜在风险。

取丰度最高的30 种ARGs，考察 ARGs 子类经Fenton 处理前后相对丰度的差异，结果见图3。

图3 Fenton 处理前后样品ARGs 子类相对丰度变化Fig. 3 Relative abundance changes of subtypes of ARGs in the samples before and after Fenton treatment

由图3可知，WH 组ARGs丰度高于FH 组，但有少数类别如qacEdelta1（Multidrug）、aac（6′）-I（Aminoglycoside）、ereA（MLS）、ermF（MLS）、OXA-10（β-lactam）、catB（Chloramphenical）等在经过Fenton 处理后丰度反而有所上升，证明氨基糖胺类、氯霉素类、林可霉素类等多种类型的ARGs 在Fenton 处理后丰度恢复相较其他种类更快，更易增殖。徐维海等〔21〕在对8 种常用抗生素在城市污水处理厂中含量及其去除情况的研究中发现，大环内酯类药物和磺胺类药物结构稳定，不易从污水中去除，经处理后磺胺类药物甚至有负去除现象。R. H. LINDBERG 等〔22〕认为磺胺甲基异唑不能被有效去除，其在环境中的持续性残留可能是导致细菌耐药性增强、ARGs 难去除的原因之一。由此推测，此3 类ARGs 难以去除的潜在原因可能是氨基糖胺类、氯霉素类、林可霉素类抗生素在环境中去除难度大，残留时间较长造成的耐药性增强。

2.2 移动遗传元件丰度分析

ARGs 能通过MGEs 在相同甚至不同种属微生物间发生水平转移和扩散，因此即使细菌被杀死，其脱氧核糖核酸也可在脱氧核糖核酸酶的保护下长时间存在于环境中，使耐药性在不同物种之间广泛传播〔23-24〕。在处理前后的污泥样品中共检测到了5类共72种MGEs，这5类分别是质粒（Plasmid）、转座子（Transposase）、4"-异戊酰基转移酶（Ist）、插入序列（IS）、整合子（Integrase）。Fenton处理前后样品的MGEs丰度变化见图4。

图4 Fenton 处理前后样品的MGEs 丰度变化Fig. 4 MGEs abundance changes of the samples before and after Fenton treatment

由图4 可知，Fenton 处理前样品中转座子占比最高，达到了76.09%，同时在Fenton 处理后其去除率也最高，达到了72.32%。转座子可以通过水解β-内酰胺类抗生素介导β-内酰胺酶基因，从而导致部分ARGs 的水平传播〔25〕，因此对转座子的高去除率可以有效减少ARGs 传播与残留的风险。

MGE 子类在Fenton 处理前后的丰度变化见图5。

由图5 可知，经Fenton 处理后qacEdelta（Integrase）、istA（Ist）、istB（Ist）、IS26（IS）、P1（Plasmid）等残余量仍较高。插入序列作为转座子的一部分，可通过将ARGs 转移到质粒上完成耐药基因的水平传播〔26〕，质粒通过偶联作用在同种甚至不同种细菌间转移〔27-28〕，这种水平基因转移的机制，使质粒被公认为水平基因转移最重要的因素，因此推测以上MGEs 的残留会为ARGs在微生物间的传递提供途径。

2.3 微生物群落结构分析

Fenton 处理前后样品中微生物群落结构的变化见图6。

图6 Fenton 处理前后样品的微生物群落结构在属水平（a）和门水平（b）的变化Fig.6 Microbial community structure changes at the phylum level（a） and genus level（b） in the samples before and after Fenton treatment

由图6 可知，在属水平上，处理前假单胞菌（Pseudomonas）为最主要优势菌，占比为9.27%，而处理后硝化螺旋菌（Nitrospria）占比超过Pseudomonas，达到了10.69%。陶厄氏菌（Thauera）、链霉菌属（Streptomyces）在处理后丰度降低较多，而嗜酸硫杆菌（Acidithiobacillus）占比从0.07%上升到了2.77%，嗜酸菌（Acidovorax）占比也有小幅度上升，从1.96%上升至2.27%，这可能是因为Fenton 处理需将pH 调至2.73，利于嗜酸菌繁殖〔29〕。微生物群落结构整体未发生较大变化，推测Fenton 处理后的样品中众多微生物无法被彻底去除且增殖能力较强，在反应结束后继续繁殖，导致处理前后微生物多样性差异不大。

2.4 耐药菌分析

由图1 可知，经过Fenton 处理后ARGs 去除率虽较高，但仍有部分难削减、易增殖的ARGs 残留，而残留的ARGs 可能存在于对抗生素具有抗性的ARB中，因此，本研究从经过Fenton 处理后的污泥中筛选出ARB，以探求Fenton 法对于ARB 的去除效果。

经Fenton 处理后的样品共筛选出9 株ARB，ARB 形态照片见图7。

图7 ARB 形态图Fig. 7 Morphological diagram of ARB

由图7 可知，经筛选后得到氨苄青霉素钠ARB 2 株（编号为AD、AE）、卡那霉素ARB 5 株（编号为KB、KC、KG、KF、KH）、罗红霉素ARB 2 株（编号为LC、LD），在本实验中尚未筛出四环素（四环素类抗生素）与诺氟沙星（喹诺酮类抗生素）的ARB。图1显示四环素类ARGs 去除率虽仅有64.05%，但可能残余的此类ARGs 为游离状态，而喹诺酮类ARGs 去除后丰度极低，去除率达到了83.22%，推测Fenton处理已将具有四环素与诺氟沙星耐药性的活性菌去除。在已筛选出的对应耐药菌的抗生素种类中，卡那霉素属于氨基糖苷类抗生素，氨苄青霉素钠是一种β-内酰胺类抗生素，罗红霉素属于大环内酯类抗生素，这与先前实验检测出的去除率较低的ARGs种类吻合，氨基糖苷类、β-内酰胺类、大环内酯类ARGs 去除率均未超过65%，说明Fenton 处理并未将这几类ARB 完全去除，尚有活性菌存在，且残余的ARGs 仍在发挥着抗性作用。

实验构建了ARB 系统发育树，结果见图8。

图8 ARB 系统发育树Fig. 8 Phylogenetic tree of ARB

基于局部序列比对算法的搜索工具（BLAST）比对表明，除KH、KG 外的7 株ARB 均存在致病的可能性。AD 与多种蜡状芽孢杆菌（Bacilus cereus）相似度在99.7%以上，AE 与蜡状芽孢杆菌、炭疽杆菌（Bacillus anthracis）相似度在97%以上，根据同源检索比对结果，推测AD、AE 具有与Bacilus cereus和Bacillus anthracis相似的性质。Bacilus cereus部分菌种会产生肠毒素，从而污染食物导致人类食物中毒〔30〕，Bacillus anthracis是炭疽病的病原体，炭疽是一种急性、病程进展迅速的人畜共患病〔31-32〕，但经图8 系统发育树显示，AD、AE 与同根菌种的支持度均低于50，尚无法确定其亲缘关系。AD、AE 与致病菌高度相似，可能会对人类健康造成威胁，由此推测AD、AE 为两种未知致病菌。LC、KB、KF、KC 在系统发育树上处于同根，与寡养单胞菌（Stenotrophomonasp.）枝干距离较近，支持度高，亲缘关系接近。Stenotrophomonasp. 是一类革兰氏阴性好氧菌，包括16 个有效描述种，其中嗜麦芽寡养单胞菌（S. maltophilia）已多次从患有囊性纤维化病人呼吸道中分离出来〔33〕，S.maltophilia因其引起的医疗方面等的感染，已成为日前被广泛关注的致病菌之一。此外，S.maltophilia通过高频率的基因重排和突变以适应不同的生态位，因而具有较高的种内异质性和基因组可塑性，使其能够定居在新宿主上，而且可能演变发展出新的基因型和物种〔34〕，若筛选出的5 种耐药菌具有与其相类似的性质，可能会演变出更多的致病菌种类，致使5 种耐药菌在环境中的残留成为一大威胁。同时，S.maltophilia由于膜通透性低，能减缓疏水性抗生素的被动扩散，导致嗜麦芽寡养单胞菌对多类常见抗生素（如β-内酰胺酶类药物和大多数氨基糖苷类抗生素）的敏感性低、耐药性高〔35〕，而KB、KF、KC正属于氨基糖苷类耐药菌，其存在不利于抗生素发挥效用。LD 经比对后可确定为微杆菌（Microbacteriumsp.），赵晶等〔36〕研究表明，微杆菌在防治农业病虫害等方面有一定作用，暂无资料证明其具有致病性。KH与KG 在系统发育树与红球菌属同根，其序列号通过BLAST 比对后，均与多种红平红球菌（Rhodococcus erythropolis）相似度在99.6%以上，推测其与红平红球菌性质类似，红平红球菌中的部分菌种具有降解石油的能力〔37〕，目前尚未发现其致病性。

3 结论

经过Fenton法处理后，剩余污泥中ARGs丰度大幅度下降，但仍有部分种类难以完全去除，此外，博莱霉素和碳霉素ARGs处理后出现丰度升高的现象，这部分ARGs可能会在城市污水处理系统中长时间存在，并且可能与环境中ARB存活相关。MGE在Fenton处理后丰度同样有所下降，但尚未被彻底去除，这也成为ARGs难以去除的原因之一。微生物群落结构在Fenton处理后未发生明显改变，推测为污泥中微生物增殖能力较强导致。Fenton处理后的污泥样品经培养筛选出9株ARB，其中β-内酰胺类抗生素氨苄青霉素钠ARB 2 株、氨基糖苷类抗生素卡那霉素ARB 5 株、大环内酯类抗生素罗红霉素ARB 2 株，均与已检出的ARGs 种类吻合，故较难去除的ARGs可能是导致Fenton处理后污泥中仍有ARB存活的原因。通过分析，在已筛选出的9株ARB中，AD、AE 与多种蜡状芽孢杆菌和炭疽杆菌相似度较高，有致病的可能性；LC、KB、KF、KC 属于寡养单胞菌，其模式种嗜麦芽寡养单胞菌已被证实为致病菌，多分离于下呼吸道感染病人体内，其在医疗卫生领域引起的感染现象已引发广泛关注；KH、KG 与红球菌属相似度高，目前未证明该菌属具有致病性。以上说明Fenton处理难以去除的部分菌种除具有耐药性外，也存在较高的致病性，会对人类社会产生潜在的健康风险，在未来的研究中，应当重点去除这类ARGs和ARB。