黑曲霉ZJ-17 配合有机肥和化肥施用对白芷生长、产量和品质的影响

刘思琴，江美彦，刘仁浪，张宇柔，侯 凯，冯冬菊，徐东北，郑全林，吴 卫*

（1 四川农业大学农学院，四川成都 611130；2 四川全泰堂川白芷产业有限公司, 四川成都 629000）

中药白芷为伞形科植物白芷Angelicadahurica(Fisch.ex Hoffm) Benth.et Hook.f.或杭白芷Angelica dahurica(Fisch.ex Hoffm) Benth.et Hook.f.var.formosana(Boiss) Shan et Yuan 的干燥根，始载于《神农本草经》，被列为中品，在我国有着悠久的药食两用的历史[1-2]。白芷药材中的主要药效成分是香豆素[3]，包括欧前胡素、异欧前胡素和氧化前胡素等[4]。长期以来一直作为中药用于治疗感冒、发热引起的头痛和伤口引起的疼痛[5]。在食品、保健品、香料和美容等方面也有广泛的用途[6-7]。白芷适应性很强，喜温暖湿润气候，宜种植在土层深厚、疏松肥沃的砂质壤土地[8]。现药用的白芷主要有川白芷、杭白芷、禹白芷和祁白芷等4 大药材商品[9]。川白芷主产于四川遂宁、安岳等地，其中遂宁白芷种植历史最久，其产量和品质都最佳，为道地药材[10-11]。但目前川白芷生产中存在盲目施肥，严重影响其产量和品质等问题，采用适宜有效的绿色种植技术迫在眉睫。

我国农业生产中化肥过量施用问题较为普遍，肥料利用率不高、资源浪费、环境污染等问题时有发生。“十四五”期间，我国政府提出化肥减量增效目标为到2025 年末全国农用化肥施用量实现稳中有降，三大粮食作物化肥利用率达到43%[12]。随着人口的增加和耕地的减少，作物增产与生态环境保护的矛盾将日益尖锐，实现化肥减量增效是农业绿色可持续发展的必然要求[13]。研究发现根际促生菌具有分解土壤内部营养物质[14]、分泌生长素[15]、调节植物生命周期某些或所有阶段植物体内促生菌含量[16]、抑制有害菌生长[17]等作用，从而可促进作物生长，提高作物产量[18-21]和品质[22]。但关于根际促生菌应用于白芷的研究报道很少。随着中药材市场的扩大与发展，中药材产业优质高效发展越来越关键。因此在白芷中应用根际促生菌并将其推广具有重要意义。本研究前期从白芷根际分离出一株具有固氮、溶磷和解钾活性的真菌黑曲霉ZJ-17，盆栽试验发现其对白芷具有促生作用，因此推测黑曲霉ZJ-17 在田间对白芷生长、产量和品质也具有促进效果，本试验利用此黑曲霉ZJ-17 制成微生物菌剂，与化肥和有机肥联合使用，探究其在田间的实际促生效果，以期为实现白芷高产、优质和绿色种植提供科学支撑。

1 材料和方法

1.1 试验地概况

试验点设在四川省遂宁市船山区唐家乡余建村白芷生产基地 (30°50′N，105°57′E)。试验地为平地，年平均气温为16.7℃～17.4℃，年平均降雨量是887.3～927.6 mm，前茬为白芷，土壤为灰潮土，土壤理化性质：pH7.8，有机质含量为10.41 g/kg，碱解氮含量为24.34 mg/kg，速效磷含量为12.66 mg/kg，速效钾含量为78.10 mg/kg。

1.2 田间试验

田间试验始于2021 年9 月，为一年期试验，共设置8 个处理，T0：不施肥；T1：半肥；T2：全肥；T3：半肥+种施黑曲霉ZJ-17；T4：半肥+黑曲霉ZJ-17 灌根；T5：全肥+种施黑曲霉ZJ-17；T6：全肥+黑曲霉ZJ-17 灌根；T7：全肥+种施市售黑曲霉，每个处理重复3 次，共24 个小区，小区面积20 m2(5 m×4 m)，随机区组排列。

黑曲霉ZJ-17 真菌置于PDA 培养基中，28℃恒温培养箱培养7 天后，收集黑曲霉孢子，加入无菌水，调整其浓度为3.0×108CFU/mL，按照30 L/hm2施用量，每个小区0.06 L，稀释100 倍，将市面购买黑曲霉孢子粉的浓度调整一致。播前覆上油枯，施入磷酸钙和硫酸钾，开沟播种，按行距40 cm 进行条播，最后将稀释后的菌液均匀浇在种子表面 (次年3 月为灌根施用)。当白芷株高4～7 cm 时，进行1～2 次间苗，株距10 cm。全肥量为油枯750 kg/hm2、尿素139.5 kg/hm2、过磷酸钙2193.8 kg/hm2、硫酸钾240 kg/hm2，半肥量为上述肥料施用量减半。尿素分3 次施用，即苗肥 (12 月)、冬肥 (次年2 月)、春肥 (次年3 月)，施用比例为2:5:3；过磷酸钙与硫酸钾分2 次施用 (底肥、春肥)，施用比例为5:5。施用时将3 种化肥混匀撒入土壤中。有机肥作为底肥施用。其余栽培措施与当地栽培措施保持一致。白芷品种为四川农业大学吴卫教授选育的‘川芷2 号’白芷品种，原植物为杭白芷Angelicadahurica(Fisch.ex Hoffm) Benth.et Hook.f.var.formosana(Boiss) Shan et Yuan。供试菌株为课题组前期从‘川芷2 号’根际土壤分离筛选的黑曲霉 (Aspergillusniger) ZJ-17 菌株，具有较强固氮、溶磷和解钾活性；另市场购买黑曲霉孢子粉 (有效活菌数≥100 亿/g，沂源康源生物科技有限公司)。

1.3 测定项目及方法

2021 年9 月播种后连续取样至次年收获期，每两月进行1 次采样，分别为2021 年11 月及2022 年1 月、3 月、5 月和7 月收获期。每次每个小区取5 株有代表性、长势一致、健康无病虫害的白芷植物样品，测定株高、根长和根粗。于收获期测产[23]。采用高效液相色谱法[24]测定白芷欧前胡素、异欧前胡素、氧化前胡素、白当归素、佛手柑内酯、白当归脑和水合氧化前胡素含量，参照《土壤农化分析》测定氮、磷、钾含量[25]，荧光定量法测定收获期白芷土壤中黑曲霉ZJ-17 定植率。根据黑曲霉ZJ-17 基因序列，参考Rinttilä等[26]的方法进行实时荧光定量PCR 反应引物序列设计，荧光定量PCR 反应体系见表1。

表1 实时荧光定量PCR 反应体系Table 1 Real-time fluorescence quantitative PCR

1.4 数据处理

采用Excel 2016、SPSS 23.0 和GraphPad Prism 8等软件进行统计分析和作图。

2 结果与分析

2.1 黑曲霉在白芷根际的定植情况

从图1 可知，种施菌剂后黑曲霉均能有效定植于土壤，且其定植率与仅施肥料处理差异显著(P<0.05)，在全肥条件下种施ZJ-17 菌剂 (T5)的定植率最高，与半肥条件下种施黑曲霉ZJ-17 菌剂处理(T3)差异不显著。种施市售黑曲霉 (T7)也能定植于土壤，定植率显著高于不施肥(T0)处理 (P<0.05)。种施菌剂处理黑曲霉定植情况显著优于菌剂灌根处理。因此，种施黑曲霉ZJ-17 菌剂更有助于其在土壤中定植。

图1 不同处理土壤中黑曲霉基因拷贝数Fig.1 A.niger gene copies in different treatment soils

2.2 黑曲霉ZJ-17 对白芷株高的影响

从表2 可见，施肥促进了白芷的生长，尤其是收获前两个月 (5 月下旬)的效果达到显著水平 (P<0.05)。全肥条件下，收获期T5 处理株高较T2 处理显著提高11.57% (P<0.05)。与市售黑曲霉 (T7)相比，在11 月下旬T5 处理的株高显著增加，生长后期(2022–01–28 至2022–07–21)二者无显著性差异。半肥条件下，种施黑曲霉ZJ-17 菌剂 (T3)处理白芷的株高在2022 年5 月下旬、7 月下旬与T1 无显著差异，与菌剂灌根处理 (T4)比，苗期(2021–11–30)株高显著增加，其他时期无显著差异。

表2 不同处理各时期白芷株高 (cm)Table 2 Plant height of A.dahurica var.formosana under different treatments in each period

2.3 黑曲霉ZJ-17 对白芷根长的影响

从表3 可知，与不施肥 (T0)比，施肥后白芷的根长总体都增长。全肥条件下，种施黑曲霉ZJ-17 菌剂 (T5) 与仅全肥 (T2) 处理比较，白芷的根长在2022 年1 月下旬、3 月下旬和收获期(2022–07–21)均显著增加 (P<0.05)，收获期该处理下白芷根长达21.19 cm，较仅全肥处理显著增加10.85% (P<0.05)。与市售黑曲霉 (T7)比，T5 在在2022 年11 月下旬根长显著增加24.52% (P<0.05)，生长后期无显著性差异。半肥条件下，种施黑曲霉ZJ-17 菌剂 (T3)白芷与仅半肥 (T1)处理比较，白芷根长在2022 年3 月下旬和收获期均显著增加 (P<0.05)。种施黑曲霉ZJ-17 菌剂与灌根处理比，生长后期白芷的根长差异不显著。

表3 不同处理各时期白芷根长 (cm)Table 3 Root length of A.dahurica var.formosana under different fertilizer treatments in each period

2.4 黑曲霉ZJ-17 对白芷根粗的影响

从表4 可知，与不施肥 (T0)比，施用全肥后白芷的根粗均显著增加 (P<0.05)。全肥条件下，种施黑曲霉ZJ-17 菌剂 (T5) 处理与仅全肥 (T2) 处理比较，白芷的根粗在各时期均显著增加 (P<0.05)，收获期根粗最大，可达50.23 mm，显著提高16.70%，比市售黑曲霉处理 (T7)显著提高10.69% (P<0.05)。半肥条件下，种施黑曲霉ZJ-17 菌剂 (T3)处理与仅半肥 (T1)处理比较，白芷的根粗从苗期至2022 年3 旬下旬均显著增加 (P<0.05)。种施黑曲霉ZJ-17 菌剂处理与菌剂灌根处理比较，在收获期全肥条件下差异显著 (P<0.05)。

表4 各时期不同处理白芷的根粗 (mm)Table 4 Root thickness of A.dahurica var.formosana under different fertilizer treatments in each period

2.5 黑曲霉ZJ-17 对白芷产量和经济效益的影响

由表5 可知，与不施肥 (T0)相比，施肥后白芷的产量均提高，全肥 (T2) 处理白芷产量显著提高19.55% (P<0.05)。全肥条件下，种施黑曲霉ZJ-17 菌剂 (T5)处理的产量、总产值和经济效益 (注：当年市场价为7.5 元/kg，鲜货)与仅全肥 (T2)处理比均显著增加，产量显著增加16.33%，经济效益显著增加19.94% (P<0.05)，与不施肥 (T0)处理比产量显著增加32.69% (P<0.05)，与市售黑曲霉 (T7)处理比产量和经济效益均无显著性差异。半肥条件下，施加黑曲霉ZJ-17 菌剂处理的产量、总产值和经济效益与仅半肥处理比无显著差异。产量和总产值由大到小排序为：全肥+种施黑曲霉ZJ-17 (T5)>全肥+种施市售黑曲霉 (T7)>全肥+黑曲霉ZJ-17 灌根 (T6)>全肥(T2)>半肥+种施黑曲霉ZJ-17 (T3)>半肥+黑曲霉ZJ-17 灌根 (T4)>半肥 (T1)>不施肥 (T0)，产量分别为24819、24819、26529、26529、22064、22197、20706、17857 kg/hm2。经济效益排序为：全肥+种施黑曲霉ZJ-17 (T5)>全肥+种施市售黑曲霉 (T7)>全肥+黑曲霉ZJ-17 灌根 (T6)>半肥+种施黑曲霉ZJ-17(T3)>全肥 (T2)>半肥+黑曲霉ZJ-17 灌根 (T4)>半肥 (T1)>不施肥 (T0)。由此可知，全肥条件下，在播期施用黑曲霉ZJ-17 菌剂能显著提高白芷产量(P<0.05)，总产值达198966 元/hm2，经济效益可达160066 元/ hm2。

表5 各处理白芷产量和经济效益Table 5 Yield and economic benefit of A.dahurica var.formosana under different fertilizer treatments

2.6 黑曲霉ZJ-17 对白芷养分积累的影响

从收获期各处理白芷地上部养分积累量(图2a)可以看出，与不施肥 (T0)对照比较，施用全肥(T2) 后白芷地上部氮、磷和钾积累量均显著增加(P<0.05)。全肥条件下，种施黑曲霉ZJ-17 菌剂(T5)后白芷地上部磷积累量显著增加，与市售黑曲霉处理 (T7)比，白芷地上部磷和钾积累量显著增加(P<0.05)。种施黑曲霉菌剂 (T5)白芷地上部磷和钾积累量与该菌剂灌根处理 (T 6) 比显著提高(P<0.05)。从收获期各处理白芷地下部分养分积累量(图2b)可以看出，与不施肥 (T0)相比，施用全肥(T2)后白芷地下部分氮、磷和钾积累量分别显著增加40.38%、32.65%和34.55% (P<0.05)。全肥条件下，种施黑曲霉ZJ-17 菌剂 (T5) 后，白芷地下部氮、磷和钾的积累量与仅全肥(T2)处理比分别显著增加37.73%、21.18%和28.75%，且T5 处理白芷养分积累量显著高于菌剂灌根处理 (T6) (P<0.05)；与市售黑曲霉处理 (T7)比，白芷地下部氮和钾积累量显著增加 (P<0.05)。半肥条件下，种施黑曲霉ZJ-17 菌剂 (T3)与仅半肥(T1)处理相比白芷地下部氮和钾的积累量也显著增加 (P<0.05)。

图2 收获期不同处理白芷养分积累量Fig.2 Nutrient accumulation of A.dahurica var.formosana at harvest stage under different treatments

2.7 黑曲霉ZJ-17 对白芷香豆素类成分含量的影响

通过测定白芷根部7 种香豆素发现，白芷欧前胡素、佛手柑内酯、白当归素和水合氧化前胡素含量在生育期内总体呈先下降后上升的趋势，但不同种类香豆素变化趋势不尽一致(图3a)。欧前胡素含量在2022 年5 月下旬较高，此时无论在半肥还是全肥条件下，种施黑曲霉ZJ-17 菌剂处理与仅半肥(T1) 和仅全肥(T2) 处理比白芷欧前胡素含量均提高，最高可达4.46 mg/g。收获时，半肥条件下黑曲霉ZJ-17 种施 (T3)和灌根(T4)处理后的欧前胡素含量较仅半肥(T1)处理分别提高9.82%和13.73%，全肥条件下种施菌剂 (T5)处理与仅全肥 (T2)处理比，在5 月下旬欧前胡素含量明显升高，7 月下旬差异不明显。由图3c 和图3d 可知，氧化前胡素和白当归脑含量总体先上升再降低，收获期，在半肥条件下黑曲霉ZJ-17 菌剂种施和灌根处理与仅半肥处理比氧化前胡素和白当归脑含量均增加。由图3b 可知，随着时间的推移，异欧前胡素含量整体逐渐上升，2022 年3 月下旬至5 月下旬上升速率最快，在收获期，半肥条件下种施ZJ-17 菌剂 (T3)处理异欧前胡素含量最高，与仅半肥 (T1)处理和仅全肥 (T2)处理比分别增加22.45% 和26.53%，与市售黑曲霉(T7)处理比增加46.94%。由图3e 和图3g 可知，半肥条件下，黑曲霉ZJ-17 菌剂灌根 (T4)处理与仅半肥(T1)处理比，在生长后期佛手柑内酯和水合氧化前胡素含量迅速增加，在收获期分别比半肥 (T1)处理增加26.09%和25.00%。

图3 不同处理白芷各时期香豆素类成分含量Fig.3 Coumarin contents of A.dahurica var.formosana under different treatments in each period

2.8 黑曲霉ZJ-17 对白芷香豆素类成分积累量的影响

由图4a、c、和e、f、g 发现，与不施肥 (T0)相比，施肥后白芷欧前胡素、氧化前胡素、佛手柑内酯、白当归素和水合氧化前胡素积累量均显著增加(P<0.05)。全肥条件下，种施黑曲霉ZJ-17 菌剂(T5)与仅全肥 (T2)处理比较，除佛手柑内酯积累量无显著性差异外，其他香豆素类成分积累量均显著增加，其中欧前胡素和异欧前胡素分别增加34.83%和22.67% (P<0.05)。种施菌剂 (T5)处理与菌剂灌根(T6) 处理相比，各香豆素类成分积累量均显著增高，与市售黑曲霉 (T7)处理比各香豆素类成分积累量也均显著增高 (P<0.05)。由图4a、b、c、d 可知，半肥条件下，种施黑曲霉ZJ-17 菌剂 (T3)处理白芷与仅半肥 (T1)处理比白芷欧前胡素、异欧前胡素、氧化前胡素和白当归脑积累量分别显著增加26.92%、34.65%、30.45%和34.83%，种施菌剂 (T3)白芷欧前胡素、异欧前胡素、氧化前胡素和白当归脑积累量均显著高于黑曲霉ZJ-17 菌剂灌根 (T4) 处理(P<0.05)，佛手柑内酯和白当归素含量二者无显著差异。由此，种施黑曲霉ZJ-17 菌剂能显著提高白芷欧前胡素、异欧前胡素、氧化前胡素和白当归脑积累量，且效果显著优于黑曲霉ZJ-17 菌剂灌根处理和市面售卖黑曲霉处理 (P<0.05)。

图4 不同处理收获期白芷香豆素类成分积累量Fig.4 Accumulation of coumarins in A.dahurica var.formosana at harvest stage

3 讨论

3.1 白芷的生长指标和产量

研究表明植物根际促生真菌具有促进植物生长、提高植物抗逆性，增加作物产量和提高质量的作用[27]。在目前化肥农药大量施用破坏生态环境的背景下，促生菌作为生物制剂，在农业、林业和环境修复等方面具有良好应用前景[28]。

课题组前期通过筛选白芷根际促生菌发现，所筛促生综合潜力最强的真菌为黑曲霉ZJ-17，其具有较强的固氮、溶磷、溶钾活性，与不施菌对照处理相比，接种菌株ZJ-17 后，遂宁土壤白芷的株高、根粗、地上鲜重和根鲜重均显著增长，崇州土壤白芷的株高和根鲜重均显著增加[29]。本试验结果进一步证实，在大田生产条件下，黑曲霉ZJ-17 与有机肥和化肥联合使用确实可明显促进白芷生长，其植株株高、根长和根粗均明显高于不施肥处理以及全肥处理，白芷单位面积产量也明显增加。在全肥条件下，播种期施用菌剂处理的产量明显高于未施用菌剂处理，增产率16.33%，产量最大值为26529 kg/hm2，与市面售卖黑曲霉处理间差异不显著；半肥条件下施用黑曲霉ZJ-17 菌剂能保证其不减产，且与仅全肥处理差异不明显，说明黑曲霉ZJ-17 菌剂确实能替代部分化肥用量。究其原因，可能是施入土壤中的根际促生菌株能改善植物根际营养环境，增加了对作物营养的供应，对植物生长和发育起到促进作用[30]。王丹等[31]发现巨大芽孢杆菌在正常氮磷供应条件下改善了油菜生长，促进了油菜对P、K、Zn 和B 等营养元素的吸收。申佳丽等[32]将胶质芽孢杆菌菌液对小黄瓜进行灌根，结果发现小黄瓜根中钾、磷，茎中钾、氮，小黄瓜叶中磷、钾受到显著影响。本试验的进一步测定分析也发现，全肥条件下，播期施加黑曲霉ZJ-17 菌剂后白芷地下部分全氮、全磷和全钾的积累量均显著增加。半肥条件下，播期施加黑曲霉ZJ-17 菌剂白芷地下部分全氮和全钾的积累量也显著增加。据此认为，施加黑曲霉ZJ-17 能增强白芷获得养分的能力，进而促进其生长和产量提升。

3.2 白芷的品质

本研究中供试黑曲霉ZJ-17 对白芷品质也有明显促进作用。至于全肥条件下施加黑曲霉ZJ-17 菌剂处理白芷的生长性状及产量高于半肥条件下施加菌剂者，但半肥条件下施加菌剂处理白芷的香豆素含量明显升高的原因，推测与全肥条件下施加黑曲霉ZJ-17 菌剂处理的白芷根生长较快，根比较粗大，韧皮部在根中所占比例较小，其分泌组织分布较少，香豆素含量相对较低有关。曾有学者研究发现白芷香豆素相对含量与直径间呈非正相关关系[33]。马逾英等[34]测定了两个产地不同商品等级 (注：主要根据根大小划分等级)川白芷样品，也发现三等品总香豆素含量均高于一、二等品。雷雨恬等[35]研究也表明白芷6 种香豆素成分含量的总和以三等品最高，一等品最低。本试验还发现，全肥条件下施用黑曲霉ZJ-17，尽管白芷香豆素含量未提升，但其香豆素成分积累量均明显增加，这与江美彦等[29]的研究结果一致，进一步表明黑曲霉ZJ-17 对白芷品质确实具有明显影响，但如何将黑曲霉ZJ-17 与化肥和有机肥合理配施，在提高产量的同时也增加主要有效成分含量值得进一步探讨。本试验中，施用黑曲霉ZJ-17 条件下白芷香豆素累积量显著高于市售黑曲霉处理，充分说明从白芷根际分离的促生菌黑曲霉ZJ-17 更适合用于白芷专用微生物肥料的开发利用。

3.3 黑曲霉ZJ-17 施用时间分析

本试验还探讨了黑曲霉ZJ-17 菌剂的最佳施用时间。研究表明，微生物肥料不是速效肥，所以，要在作物的营养临界期和大量吸收期前7～10 天施用效果最佳。同时对不同作物或同一作物的不同时期，要选用不同的施用方法。最适施用时间是清晨和傍晚或无雨阴天，避免阳光中紫外线将肥料中的微生物杀死[36]。种肥15 kg 配施不同量微生物菌剂，玉米根茎性状及产量均明显优于微生物肥料和高于常规施肥[37]。本研究中，半肥条件下，播期施用该菌剂使苗期白芷株高和根粗明显增加；全肥条件下播期施用该菌剂使大部分生长阶段白芷的株高、根长和根粗均明显增加。至于次年3 月施用黑曲霉ZJ-17菌剂对白芷生长无明显促进作用，可能与菌剂施入时间短，菌的定植率相对低有关。综合考虑，建议实际生产中于播期施入该菌剂。

4 结论

常规有机肥和化肥用量下，播期种子表面浇施黑曲霉ZJ-17 菌剂能显著促进白芷生长、养分吸收和香豆素类成分积累量，促进白芷生长，提高白芷产量和品质，提高了经济效益。本实验室鉴定的黑曲霉ZJ-17 菌株制备的菌剂效果显著好于市售菌剂，但采用生育中期 (3 月)灌根的方法施用该菌剂的效果不明显。在半肥条件下，种施黑曲霉ZJ-17 菌剂可显著提高白芷根中的欧前胡素和异欧前胡素含量，但产量和经济效益不及全肥条件下种施黑曲霉ZJ-17 菌剂处理。需进一步研究实际生产中，保障产量且增加主要有效成分含量的肥料用量。