甘木通醇提物通过miR-142-3p对ox-LDL诱导HUVECs损伤及SOD、MDA、CAT的影响

袁向科 江瑞

(1河南省中医院 河南中医药大学第二附属医院周围血管科,河南 郑州 450003;2河南中医药大学第三附属医院心血管科)

周围血管病包括动脉、静脉及淋巴三个系统的疾病,其中粥样动脉硬化斑块及血栓造成的动脉狭窄闭塞临床上比较常见,动脉粥样硬化是随着年龄增长而出现的血管疾病,是动脉的一种非炎症性病变,可使动脉管壁增厚、变硬,失去弹性、管腔狭窄,包括脂质沉积,炎症和氧化应激〔1,2〕。动脉粥样硬化的发病机制复杂,尚未得到充分阐明。内皮功能障碍是与各种危险因素相关的早期促动脉粥样硬化过程。氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)是内皮损伤的关键诱导剂,可刺激内皮细胞氧化应激和凋亡〔3〕。甘木通(Clematis filamentosa Dunn)为毛茛科丝铁线莲的叶,临床常用于治疗冠心病、高血压等疾病,既往研究表明,甘木通醇提物对家兔动脉粥样硬化的形成具有一定的防治效果〔4〕。但甘木通醇提物是否能阻止人脐静脉血管内皮细胞(HUVECs)免受ox-LDL诱导的损伤,其潜在机制尚未得到研究。微小RNA(miRNA)已被报道在包括内皮损伤在内的各种病理生理过程中发挥关键作用〔5〕。资料显示,miR-142-3p在ox-LDL诱导的HUVECs中被上调,参与内皮细胞功能障碍和动脉粥样硬化病理进展〔6,7〕。说明miRNA参与调节ox-LDL诱导的HUVECs损伤。但是,需要进一步研究阐明miRNA是否参与介导甘木通醇提物对ox-LDL损伤HUVECs的保护作用。本研究通过ox-LDL处理HUVECs建立动脉粥样硬化模型,观察甘木通醇提物在ox-LDL诱导的HUVECs中的功能,并结合miR-142-3p,最终阐明甘木通醇提物的潜在保护机制。

1 材料与方法

1.1药材、细胞与试剂 甘木通药材购自广东雷霆国药有限公司,ox-LDL购自北京索莱宝公司,人脐静脉血管内皮细胞(HUVECs)购自美国模式培养物保存中心(ATCC),RPMI1640培养基、胎牛血清(FBS)购自美国Gibco公司,anti-miR-142-3p及阴性对照anti-miR-NC购自广州锐博生物公司,Lipofectamine 2000试剂购自美国Invitrogen公司,细胞计数试剂盒(CCK-8)购自日本Dojindo公司,二喹啉甲酸酸(BCA)蛋白检测试剂盒、膜联蛋白(Annexin)Ⅴ-异硫氰酸荧光素(FITC)/碘化丙啶(PI)凋亡检测试剂盒购自江苏凯基生物公司,兔抗细胞核相关抗原(Ki-67)、兔抗天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(Caspase)3、辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔IgG二抗购自上海艾博抗公司,超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、丙二醛(MDA)检测试剂盒购自上海碧云天生物技术公司。

1.2甘木通醇提物的制备 取甘木通药材,粉碎成粉末,参照胡宗礼等〔4〕的报道,以1∶20的料液比加入70%乙醇,回流提取1 h,重复3次,收集3次提取的滤液,减压浓缩成棕褐色浸膏,即为甘木通醇提物。甘木通醇提物利用培养基稀释成10、50、100 ng/ml的浓度备用。

1.3细胞培养 HUVECs在RPMI1640培养基中,其中包含10% FBS、1%青链霉素,并于37 ℃、5% CO2、饱和湿润的培养箱中生长。每周换液2～3次。

1.4细胞分组与转染 将对数生长期的HUVECs分为对照组(未处理HUVECs),模型组(100 mg/L ox-LDL诱导HUVECs 24 h〔8〕),实验1组(10 ng/ml甘木通醇提物和100 mg/L ox-LDL处理HUVECs 24 h),实验2组(50 ng/ml甘木通醇提物和100 mg/L ox-LDL处理HUVECs 24 h),实验3组(100 ng/ml甘木通醇提物和100 mg/L ox-LDL处理HUVECs 24 h),anti-miR-NC组(转染anti-miR-NC 24 h后给予100 mg/L ox-LDL处理24 h),anti-miR-142-3p组(转染anti-miR-142-3p 24 h后给予100 mg/L ox-LDL处理24 h),实验3组+anti-miR-NC组(转染anti-miR-NC 24 h后给予100 ng/ml甘木通醇提物和100 mg/L ox-LDL处理24 h),实验3组+anti-miR-142-3p组(转染anti-miR-142-3p 24 h后给予100 ng/ml甘木通醇提物和100 mg/L ox-LDL处理24 h)。细胞转染时,在6孔板中接种HUVECs,待细胞融合至70%左右时,严格依照Lipofectamine2000试剂的说明,将anti-miR-142-3p、anti-miR-NC转染到HUVECs中,转染24 h后,利用荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)评价转染情况,并根据上述分组进行处理。

1.5CCK-8法检测HUVECs增殖 在96孔板中接种HUVECs,每孔5×104个细胞。经不同的处理后,加入CCK-8溶液10 μl,于37 ℃、5% CO2的环境中孵育,1 h后于酶标仪在450 nm下测量光密度(OD)值,分析细胞存活率(%)。

1.6流式细胞术评估HUVECs凋亡 按照细胞凋亡检测试剂盒的规程,各组HUVECs处理结束后,加入结合缓冲液重悬,收集1×105个细胞,加入5 μl Annexin Ⅴ-FITC混匀,5 μl PI工作液,混匀后遮光反应15 min,通过流式细胞仪分析细胞凋亡。

1.7Western印迹分析Ki-67、Caspase3蛋白表达 HUVECs加入放射免疫沉淀(RIPA)缓冲液抽提蛋白,经BCA蛋白检测试剂盒定量,蛋白样品加入5×上样缓冲液(4∶1)并在沸水中变性。将30 μg蛋白进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)并通过湿转法转膜。将膜用5%脱脂奶粉室温封闭,1 h后与抗Ki-67(1∶1 000稀释)、抗Caspase3(1∶1 000稀释)和参照甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH,1∶2 000稀释)抗体4 ℃孵育过夜。次日加入HRP标记的羊抗兔IgG二抗(1∶5 000稀释)室温孵育2 h,加入电化学发光(ECL)液显影,凝胶成像系统扫描分析。

1.8qRT-PCR测定miR-142-3p表达 使用TRIzol试剂从各组HUVECs中提取总RNA,采用SYBR PrimeScript试剂盒将RNA逆转录为cDNA,以cDNA为模板,通过SYBR Premix Ex Taq试剂盒在ABI 7300 real-time PCR 系统进行PCR。收集Ct值,由2-ΔΔCt方法分析miR-142-3p表达。引物序列为:miR-142-3p上游5′-GTCGTATCCAGTGCAGGG-3′和下游5′-CGACGTGTAGTGTTTCCTA-3′,U6上游5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′和下游5′-AACGCTTCA-CGAATTTGCGT-3′。

1.9比色法检测SOD、MDA、CAT水平 HUVECs处理结束后,收集细胞上清液,分别遵循SOD、MDA、CAT检测试剂盒说明书的操作步骤,采用比色法检测SOD、MDA、CAT水平。

1.10统计学分析 采用SPSS22.0软件进行t检验单因素方差分析、SNK-q检验。

2 结 果

2.1甘木通醇提物对ox-LDL诱导的HUVECs损伤的影响 与对照组相比,模型组HUVECs存活率明显降低,凋亡率显著升高,Ki67蛋白表达量明显减少,Caspase3蛋白表达量显著增加(P<0.05);与模型组相比,实验1组细胞的存活率、凋亡率、Ki67、Caspase3蛋白表达无显著变化(P>0.05),而实验2组、实验3组HUVECs的存活率明显增加,凋亡率显著减少,Ki67蛋白表达水平明显升高,Caspase3蛋白表达水平显著降低(P<0.05),且甘木通醇提物浓度越高,作用效果越显著。见图1、表1、图2。

2.2甘木通醇提物对ox-LDL诱导的HUVECs中SOD、MDA、CAT及miR-142-3p表达的影响 与对照组相比,模型组HUVECs内miR-142-3p表达量明显增加,SOD、CAT活性显著降低,MDA含量明显升高(P<0.05);与模型组相比,实验1组HUVECs的miR-142-3p、SOD、MDA、CAT水平无明显变化(P>0.05),但实验2组、实验3组HUVECs内miR-142-3p表达量显著减少,SOD、CAT活性明显升高,MDA含量显著降低(P<0.05),且甘木通醇提物浓度越高,作用效果越显著。见表1。

图1 甘木通醇提物对ox-LDL诱导的HUVECs凋亡

表1 甘木通醇提物对ox-LDL诱导的HUVECs损伤的影响及HUVECs中SOD、MDA、CAT及miR-142-3p表达

1～5:对照组、模型组、实验1组、实验2组、实验3组图2 各组Ki67、Caspase3蛋白表达

2.3干扰miR-142-3p的表达 anti-miR-142-3p组miR-142-3p的表达量显著低于anti-miR-NC组(0.27±0.01 vs 1.00±0.04;t=53.115;P=0.000)。

2.4干扰miR-142-3p对ox-LDL诱导的HUVECs损伤及SOD、MDA、CAT水平的影响 与anti-miR-NC组相比,anti-miR-142-3p组细胞的存活率明显增加,凋亡率显著减少,Ki67蛋白表达量明显升高,Caspase3蛋白表达量显著降低,并且SOD和CAT活性明显升高,MDA含量显著降低(P<0.05)。见表2、图3。

表2 干扰miR-142-3p对ox-LDL诱导的HUVECs损伤及SOD、MDA、CAT水平的影响

图3 干扰miR-142-3p对ox-LDL诱导的HUVECs凋亡及 Ki67、Caspase3蛋白表达的影响

2.5干扰miR-142-3p可增强甘木通醇提物对ox-LDL诱导的HUVECs损伤的影响 与实验3组+anti-miR-NC组相比,实验3组+anti-miR-142-3p组明显增加ox-LDL损伤的HUVECs的存活率,显著减少细胞的凋亡率,明显提高Ki67蛋白表达水平,显著降低Caspase3蛋白表达水平(P<0.05)。见图4、表3。

2.6干扰miR-142-3p可增强甘木通醇提物对ox-LDL诱导的HUVECs中SOD、MDA、CAT的水平 与实验3组+anti-miR-NC组相比,实验3组+anti-miR-142-3p组明显提高ox-LDL损伤的HUVECs中SOD和CAT活性,而显著降低MDA含量(P<0.05)。见表3。

表3 干扰miR-142-3p可增强甘木通醇提物对ox-LDL诱导的HUVECs损伤的作用及HUVECs中SOD、MDA、CAT的水平

3 讨 论

对于动脉粥样硬化引起的周围血管动脉闭塞及由于内壁损伤导致的动脉瘤临床上常采用手术的治疗方法,但动脉粥样硬化是一种全身性炎症性疾病〔9〕。通常认为,内皮细胞损伤和凋亡是动脉粥样硬化发病机理的基础和初始步骤〔10〕。ox-LDL通过诱导血管内皮损伤和凋亡而促进动脉粥样硬化斑块的形成和发展,ox-LDL被认为是动脉粥样硬化的重要诊断生物标志物〔11〕。因此,抑制ox-LDL诱导的内皮损伤可能是抗动脉粥样硬化的一种新型有效治疗方法,从而在治疗动脉硬化性周围血管疾病方面可以起到从源头治疗的目的。

ox-LDL已被广泛用于建立动脉粥样硬化的体外模型,可通过多种机制参与动脉粥样硬化的过程。如ox-LDL预处理可能诱导人脐带血内皮细胞(HUCBECs)细胞活力下降,细胞凋亡增加〔12,13〕。Caspase3蛋白是细胞凋亡的一种效应蛋白,在两个主要的程序性细胞死亡相关途径(即死亡受体和细胞应激途径)汇合的步骤中发挥作用,ox-LDL诱导的Caspase3表达上调提示凋亡的发生〔14〕。氧化应激是导致内皮功能障碍的重要因果机制。研究表明,氧化应激是动脉粥样硬化的关键特征,这是由于抗氧化能力与包括活性氧在内的物质之间的不平衡而产生的〔15〕。与前述报道相符,这项研究同样发现,100 mg/L ox-LDL处理可以降低细胞增殖、抗氧化酶SOD、CAT活性和Ki67蛋白的表达,还可显著增加凋亡细胞的数量、Caspase3蛋白表达和脂质过氧化产物MDA含量。

甘木通作为我国传统中药,具有降血压、增加冠脉流量、耐缺氧等药理活性。有学者〔16〕指出,甘木通总黄酮能够减轻缺血再灌注导致的氧化应激,通过增强SOD活性和抑制MDA的生成,产生抗脂质过氧化活性〔17〕。甘木通总黄酮还可促进表柔比星所致的细胞增殖,抑制细胞凋亡和脂质过氧化反应〔18〕。本研究证明,50、100 ng/ml浓度的甘木通醇提物可以保护ox-LDL诱导的HUVECs损伤,一方面促进ox-LDL诱导的HUVECs增殖、Ki67蛋白表达,抑制细胞凋亡和Caspase3蛋白表达,另一方面可以减少ox-LDL诱导的氧化应激,提通过减少MDA含量,并上调SOD和CAT活性来改善细胞的抗氧化防御系统,这与前人报道〔4〕的甘木通醇提物抗动脉粥样硬化的效果相符。

miRNA是内源性非编码RNA,调节基因的表达,并在各种病理和生理过程扮演重要角色,包括增殖,分化,侵袭和凋亡〔19〕。证据表明,某些miRNA可以通过靶向基因或关键途径而成为动脉粥样硬化的必要调节因子〔20〕。根据报道,miR-142-3p在肿瘤发生中起着至关重要的作用,它可以在不同类型的癌症中充当癌基因或抑癌基因〔21,22〕。miR-142-3p对脂多糖诱导的软骨细胞凋亡具有抑制作用〔23〕,在高血压状态下,miR-142-3p可以促进内皮细胞的增殖并抑制其凋亡〔24〕。本研究结果说明,甘木通醇提物通过下调miR-142-3p的表达在ox-LDL诱导的HUVECs损伤中起保护作用。

综上所述,甘木通醇提物可以保护ox-LDL诱导的HUVECs损伤,促进细胞增殖,抑制细胞凋亡并改善氧化应激,这种保护作用与调控miR-142-3p表达有关,为甘木通醇提物预防动脉粥样硬化及治疗动脉硬化性周围血管疾病提供了新方向。