下丘脑室旁核miR-132对心力衰竭大鼠外周交感神经兴奋性的影响

刘羽承 郭雨欣 张波,2 李晶,2 赵津璋,3 辛恬 于海波 贾琳琳,2

(佳木斯大学基础医学院 1生理教研室,黑龙江 佳木斯 154000;2微生态-免疫调节网络与相关疾病重点实验室;3佳木斯市中心医院;4佳木斯大学附属第一医院)

外周交感神经兴奋性增强是心力衰竭(HF)早期即可出现的病理特征及临床治疗的主要靶点。下丘脑室旁核(PVN) 是参与心血管活动调节的重要部位,包含有多种类型的神经递质。有研究证实高血压、HF发生时下丘脑PVN内谷氨酸(Glu)、去甲肾上腺素(NE)的表达上调,而γ-氨基丁酸(GABA)、一氧化氮(NO)表达下调,这种兴奋性神经递质和抑制性神经递质表达失衡可导致PVN内神经元基础活动的改变,从而影响外周交感神经的活动和基础血压〔1,2〕。前期实验中发现HF大鼠下丘脑PVN miR-132表达升高并伴有Glu含量增高,由此推测下丘脑PVN miR-132在HF状态下对调控外周交感神经活动发挥重要作用〔3〕。本项目通过建立HF大鼠模型,在下丘脑PVN灌注miR-132特异抑制剂,观察大鼠交感神经兴奋性和心功能的改变,从而明确miR-132在HF中枢机制的作用。

1 材料与方法

1.1制造HF动物模型 将购于哈尔滨医科大学实验动物中心的健康、成年、雄性SD大鼠〔SCXK (黑) 2019-001,清洁级〕随机分为正常对照(Ctrl)+人工脑脊液(ACSF)组、HF+ACSF组及HF+miR-132抑制剂组。HF动物模型制作:抽取10%水合氯醛(40 mg/kg)通过腹腔注射给药,待实验动物麻醉后,将气管插管插入口腔,固定后一端与呼吸机相连,开胸暴露心脏,在左冠状动脉前降支偏上的位置穿线打结后,肉眼观察到由于血供减少导致心室壁颜色变浅、活动减弱,心电图(ECG)检测出现ST段抬高,Ctrl+ACSF组开胸不结扎血管,4 w后检测心功能和ECG,左室舒张末压力(LVEDP)≥15 mmHg作为判定HF制作成功的标准,不符合的实验动物剔除〔4〕。

1.2侧脑室插管 根据大鼠解剖图谱进行侧脑室插管,以前囟为基点寻找进针点,插管位置为前囟后1.0 mm、旁开1.5 mm、深3.5 mm,墨水标记。用连接渗透压泵的无菌不锈钢管插至标记处,固定后埋于颈背部皮下。HF+miR-132抑制剂组大鼠通过渗透泵注入miR-132特异抑制剂0.1 nmol/d,Ctrl+ACSF组和HF+ACSF组每天微灌注等量的ACSF,各组实验动物持续灌注4 w〔5〕。

1.3主要的仪器和试剂 多通道小动物人工呼吸机(DB038-1)、精密注射泵(LSP01-2A)、高效液相色谱仪(STI501)、脑立体定位仪(DB053)、东芝四维彩超(Aplio50)、倒置光学显微镜(Olympus)、BL-420生物机能实验系统(成都泰盟公司)、miR-132特异抑制剂(Biomics Biotech)、大鼠脑钠肽(BNP)、NE酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(碧云天生物科技公司)等。

1.4心功能检测 通过超声心动图和血流动力学检测心率(HR)、LVEDP等心功能指标,超声检测和分析由临床超声医师完成,血流动力学检测步骤参考El-Husseing等〔6〕的方法。

1.5肾交感神经活动(RSNA)检测 对于心血管活动的调节,肾交感神经具有很高的紧张性,因此应用电生理实验技术检测RSNA来直接反映外周交感神经活动的瞬时变化。神经的分离及放电的检测方法同文献〔7〕。

1.6血浆BNP和NE含量检测 动物在非麻醉状态下通过内眦静脉取血,离心收集血样标本后严格执行ELISA试剂盒说明书步骤检测血浆NE和BNP水平,外周血液中的NE含量可间接反映外周交感神经的兴奋性。

1.7下丘脑PVN Glu含量检测 使用大鼠脑定位图谱来明确下丘脑PVN所处位置:视交叉后缘向后1.5～2.0 mm,垂直7.1～8.1 mm。侧脑室灌注4 w后麻醉状态下断头处死实验动物,将下丘脑PVN脑组织立即取出,超声粉碎、匀浆取上清之后,应用高效液相色谱(HPLC) 仪检测Glu含量,药学院专业技师完成仪器操作及结果分析。

1.8光镜下心脏组织结构观察 麻醉状态下断头处死实验动物,快速开胸将心脏取下,去除心脏周围其他组织后用生理盐水清洗,然后用滤纸吸干且称质量,计算心脏质量指数:心脏质量与体质量的比值(HW/BW)。将置于4%多聚甲醛溶液中的心肌组织仔细取出,苏木素-伊红(HE)染色,放置在光学显微镜下观察。

1.9统计学分析 采用SPSS19.0软件行t检验。

2 结 果

2.1心功能和HW/BW检测 ECG可见:HF+ACSF组出现明显的ST段抬高、T波振幅变高;相较于HF+ACSF组,HF+miR-132抑制剂组ST段抬高的幅度和速度降低、T波振幅相对变低;Ctrl+ACSF组ECG无明显异常。见图1。与Ctrl+ACSF组比较,HF+ACSF组和HF+miR-132抑制剂组HW/BW、LVEDP、HR显著升高,左室收缩压(LVSP)、射血分数(EF)显著降低(P<0.05,P<0.000 1,P<0.01);HF+miR-132抑制剂组心功能和HW/BW与HF+ACSF组相比较有明显改善(P<0.05,P<0.000 1,P<0.001)。见表1。

图1 各组ECG检测结果

表1 各组心功能及HW/BW比较

2.2血浆BNP、NE含量及下丘脑PVN中Glu含量 HF+ACSF组和HF+miR-132抑制剂组血浆BNP、NE含量及下丘脑PVN Glu含量与Ctrl+ACSF组相比显著升高(P<0.000 1,P<0.01); 与HF+ACSF组比较,HF+miR-132抑制剂组可降低HF大鼠血浆NE、BNP及下丘脑PVN Glu水平(P<0.05)。见表2。

2.3电生理检测 HF+ACSF组RSNA放电频率和幅度与Ctrl+ACSF组相比明显增快、增高 (P<0.000 1);HF+miR-132抑制剂组RSNA幅度显著小于Ctrl+ACSF组(P<0.000 1);HF+miR-132抑制剂组RSNA与HF+ACSF组相比较显著降低(P<0.000 1)。见表2。

2.4组织学观察 与Ctrl+ACSF组相比较,HF+ACSF组心肌细胞核淡染且数量明显减少,心肌纤维皱缩,肌间隙明显变宽,有断裂和空泡样变性出现;HF+miR-132抑制剂组心肌组织出现病理改变的程度与HF+ACSF组相比较明显减轻。见图2。

表2 各组血浆NE、BNP、下丘脑PVN Glu含量 及RSNA比较

图2 3组心肌组织(HE染色,×200)

3 讨 论

多种miRNA参与HF的发生和发展,但其中最引起重视的是miR-132。miR-132在HF的心肌细胞中表达增高,可通过影响多条信号通路的靶向下游分子调节心肌细胞生长、自噬、凋亡和收缩等功能参与心室重构,动物和临床试验均证实应用miR-132抑制剂可改善心功能和心肌纤维化,达到缓解症状、延缓甚至逆转HF病程的作用〔8,9〕。研究表明,外周血液中的miR-132水平与HF的严重程度密切相关,低水平的miR-132相较于传统的危险因素,可提高HF患者再入院的风险预测,miR-132有望成为辅助诊断、评估HF预后的标志物及临床治疗的靶点〔10〕。综上可知,外周组织中表达增多的miR-132在HF进程中发挥着重要的功能。

miR-132是与中枢神经系统(CNS)功能相关的miRNA,参与调节CNS的发育和活动,并与多种CNS疾病的发生、发展密切相关〔11〕。CNS内的miR-132与兴奋性神经递质Glu关系密切,可参与N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体介导的Glu信号基因调控〔12,13〕。

本研究结果显示,HF大鼠表现出不同程度心功能损害,应用miR-132抑制剂后心功能各项指标和心脏病理改变均有所改善,下丘脑PVN灌流miR-132抑制剂可明显降低RSNA和Glu水平。但有研究表明在疾病进展的不同阶段,miR-132功能失衡和作用机制可受多种转录因子的调控,在CNS的表达和新陈代谢也与神经元的实时状态及谷氨酸受体是否被抑制和激活有关〔14,15〕。为此,下丘脑PVN miR-132对HF状态下外周交感神经活动的影响机制还需深入研究。