基于HMGB1/TLR4信号通路使用迷走神经刺激治疗难治性癫痫的效果

张冬 梁振 李永格

(1南阳医学高等专科学校基础医学部,河南 南阳 473061;2河南省肿瘤医院神经外科)

难治性癫痫的主要特点是存在脑部反复发作癫痫的可能性〔1〕,相关研究显示,迷走神经刺激(VNS)是当下治疗难治性癫痫的有效治疗手段之一。VNS又被称为自主神经刺激,可显著减少癫痫的发作次数〔2,3〕。因此,大部分研究学者认为VNS会有效提升难治性癫痫患者的生活质量。高迁移率族蛋白(HMG)B1广泛分布在真核细胞中,在癫痫发作中,它会从受损胶质细胞和神经元中活化内皮细胞,引发炎症反应,让血液及胶质细胞中的各种免疫细胞功能受限〔4〕。在癫痫发作后,星形胶质细胞、神经元中Toll样受体(TLR)4会得到活化,进而会引发神经性炎症,进而它会与HMGB1组成信号通路来参与癫痫的发生、发展〔5,6〕。本文主要通过VNS来分析其对HMGB1/TLR4信号通路是否有调控作用,同时在证实VNS治疗难治性癫痫的疗效是否显著。

1 材料与方法

1.1研究动物 选择40只清洁级健康成年SD大鼠,雌雄各半,体质量230～255 g,均由中国医学科学院实验动物中心提供,合格证号为:SCXK(京)2021-0008。实验前,适应性喂养1 w,采用开放喂养系统,遵循自然规律进行光照照射,室温保持24～26 ℃,喂养标准实验室大鼠食物饲料及自来水,让大鼠适应实验环境中对动物的取材、饲养、手术等。主要试剂及仪器:氯化锂、匹鲁卡品、东莨菪碱(美国sigma公司),苯巴比妥钠(PB,上海新亚药业),戊巴比妥钠溶液(武汉纯度生物科技有限公司),多聚甲醛磷酸盐缓冲液(PBS,广州美基生物科技有限公司),电生理信号采集器(Digidata1440A,美国Axon Instruments公司),可粘贴性皮肤刺激电极片(直径5 mm,自制),数字脉冲刺激器(Master-8/Iso-flex,美国AMPI公司),80-2型低速离心机(上海手术器械厂),红外视频监测系统(上海景阳监控,型号SR-TX420-SL),苏木素-伊红(HE)染色试剂盒(武汉谷歌生物科技公司),HMGB1、TLR多克隆抗体购自亚科因(武汉)生物技术有限公司,免疫组化检测试剂盒购自福州迈新公司。石蜡切片机(RM2245,德国Leica公司),光学显微镜(Leica公司)。

1.2分组、建模 将40只大鼠随机分为空白对照组(A组)、难治性癫痫模型组(B组)、假刺激组(C组)、VNS组(D组),每组各10只。

难治性癫痫大鼠模型的建立:向B、C、D组腹腔内注射浓度为1 mol/L的氯化锂3 mmol/kg,19.5 h后再向这些大鼠皮下浓度为0.5 g/L的1 mg/kg注射东莨菪碱,半小时后向腹腔注射浓度为10 g/L的匹鲁卡品30 mg/kg,空白对照组腹腔注射0.9%生理盐水30 mg/kg。使用匹鲁卡品的大鼠大约会在注射半小时后出现持续癫痫,等癫痫持续1 h后注射地西泮(安定)10 mg/kg让大鼠终止发作。利用监控系统检测建模成功后大鼠癫痫的发展情况,等14 d后大鼠均进入癫痫自主发作阶段。

迷走神经分离术:向C、D组大鼠腹腔内注射浓度为25%的乌拉坦4 ml/kg,让大鼠仰卧手术台,在其颈部备皮,正中切口长度保持5 cm,切口涉及大鼠浅筋及皮肤,沿其左侧胸骨骨肌进入左侧颈动脉鞘,利用玻璃针分开颈动脉鞘,游离左侧迷走神经。将自制C型双极银质电极刺激端置于大鼠迷走神经干上,两电极距离为1～2 mm,将无菌恒温石蜡油棉条固定在大鼠游走神经干,置于C型电极凹槽内,缝合伤口,通电刺激时,电刺激器与C型电极远端连接。

1.3方法 A组、B组不作任何刺激处理,C、D组大鼠左耳部剃毛,左颈部植入VNS电极,C组不刺激通电。D组进行通电刺激,VNS刺激参数设置为:电流控制在0.25～1.0 mA之间,波宽为500 μs,频率为25 Hz,刺激时间为30 s,刺激时间为12 h(08∶00～20∶00),间歇为5 min,连续刺激28 d,在大鼠进行刺激之前使其适应刺激环境,电流由0.25 mA逐渐增加,1 w后提高到最大值1.0 mA,利用电脑视频系统监测大鼠癫痫发作状况。

1.4指标观察 42 d后,按照40 mg/kg的比例将1%戊巴比妥钠溶液注射大鼠腹腔进行麻醉,静待大鼠麻醉成功后,主动脉取血5 ml,将血样以14 000 r/min的速度离心5 min,沉淀蛋白质,吸取上清液经0.45 μm微孔滤膜过滤备用。①处死大鼠,用4%多聚甲醛PBS灌注断头取脑,取大鼠海马组织进行HE染色。在光学显微镜高倍视野(×400)下随机选取CA3区4个不重复视野,观察各组大鼠细胞数量、核仁状态、存活锥体细胞数、阳性细胞数等,应用计算机病理图像分析系统 Image Pro Plus6.0 分析。②利用24 h电脑监控系统记录刺激前1 w及刺激后1 w B、C、D组癫痫发作频率(癫痫持续时间超过30 s)。③采用免疫组化检测单核趋化蛋白(MCP)-1、层黏连蛋白(LAP)、P糖蛋白(gp)。在海马部位灰度比值,将切片常规脱蜡水化,于60 ℃恒温箱中烘烤1.5 h,加入二甲苯浸提10 s,自来水冲洗3 min后用PBS冲洗3次,加入0.01 mmol/L柠檬酸盐缓冲液,冷却后用PBS冲洗,加入3%H2O2覆盖切片组织表面,37 ℃避光恒温箱孵育10 min,弃一抗,取出,置于4 ℃冰箱中过夜,然后二抗孵育后置入37 ℃恒温箱孵育30 min,PBS冲洗3次,1次/3 min,擦干,甩掉二抗,PBS冲洗3次,每次3 min,加入二氨基联苯胺(DAB)显色液,光镜下观察显色程度,读取表达后计算比值。④Western印迹检测海马组织HMGB1、TLR4蛋白的表达。取50 mg海马组织,用Western印迹提取组织总蛋白,调整蛋白质浓度,经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、膜转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜,加入对应一抗,于4 ℃条件下孵育过夜,TBST漂洗40 min,分为3次漂洗,再加入经(HRP)标记的二抗继续孵育1 h,根据电化学发光(ECL)试剂盒说明书对蛋白条带进行显影、定影,观察、分析各组蛋白条带成像情况。

1.5统计学处理 采用SPSS25.0软件进行方差分析、t检验。

2 结 果

2.1大鼠海马CA3区观察 大鼠海马CA3区HE染色结果如图1所示,形态正常,排列整齐,核仁清晰;与A组相比,B组海马CA3区细胞数量最少,且出现形态的严重损伤,核仁溶解、缩小、模糊不清,核断裂现象严重;与B组相比,C组症状无明显区别,神经元细胞数量及核仁状态都受损严重;D组则有明显变化,细胞数量大幅度增加、形态趋于正常,核仁状态恢复良好。

2.2大鼠每周癫痫发作次数比较 刺激前1 w,B、C、D组癫痫发作频率无统计学差异(P>0.05);刺激结束后1 w,与B、C组相比,D组刺激结束后癫痫发作频率显著减少(P<0.05)。见表1。

2.3大鼠海马组织存活锥体细胞数、阳性细胞数 与A组相比,B组、C组、D组海马组织存活锥体细胞数明显减少、海马组织阳性细胞数明显增加(P<0.05);与B、C组相比,D组海马组织存活锥体细胞数明显增加,海马组织阳性细胞数明显减少(P<0.05)。见表1。

2.4大鼠海马区MCP-1、LAP、P-gp灰度比值比较 与A组相比,B组、C组、D组海马区MCP-1、LAP、P-gp灰度比值明显增加(P<0.05);与B、C组相比,D组海马区MCP-1、LAP、P-gp灰度比值明显降低(P<0.05)。见表1。

图1 各组海马CA3区(HE染色,×400)

表1 各组每周癫痫发作次数、海马组织存活锥体细胞数、阳性细胞数、海马区MCP-1、LAP、P-gp灰度比值比较

2.5HMGB1、TLR4蛋白表达比较 与A组相比,B组、C组、D组海马区HMGB1、TLR4表达增加,差异有统计学意义(P<0.05);与B、C组相比,D组海马区HMGB1、TLR4表达降低,差异有统计学意义(P<0.05)。见表2、图2。

表2 HMGB1、TLR4蛋白表达比较

图2 Western印迹检测各组HMGB1、TLR4蛋白表达

3 讨 论

癫痫以短暂性、阵发性、突发性、反复发作的大脑功能性障碍为主要表现特征〔7,8〕。虽然当前临床上,有各种各样的抗癫痫药物不断取得显著的临床治疗效果,但在癫痫发病人群中仍有30%～40%的患者不能获得满意治疗疗效,这种则属于难治性癫痫,难治性癫痫有其自身的复杂性,且对多种药物有耐药性。在手术治疗上,很多难治性癫痫患者往往因为神经功能损害而不适合致癫痫病灶的切除。

VNS是临床中第一个被批准使用的刺激性治疗方法,这种治疗手段主要是针对不能进行外科手术治疗的难治性癫痫患者而推出的辅助治疗方案。VNS治疗的原理是通过外科手术将螺旋电极缠绕于颈部迷走神经上,将可植入装置置于胸前,然后调整相关参数模式,通电刺激迷走神经,最终达到治疗目的〔9,10〕。有研究显示,VNS可以对病灶进行精准定位在经电刺激后会降低癫痫发病次数,甚至可以完全控制病情〔11〕。分析VNS的具体作用机制,需要从迷走神经入手,迷走神经的传出、传入神经纤维主要广泛分布于内脏与躯体中,这些神经纤维会投射到脑部各个部位,与内脏功能产生相关反射,而迷走神经这种网状传出、传入神经系统最适合VNS的作用原理,VNS可在刺激中利用上行、下行网状神经系统控制脊髓,进而调节大脑皮质的相关功能〔12〕。

相关研究显示,有超过70%的药物难治性癫痫患者在手术治疗时被发现其海马出现萎缩、硬化现象,难治性癫痫的反复发作则是造成海马硬化萎缩的主要原因,而反过来海马萎缩又会让癫痫发作次数增多,形成一种恶性循环〔13,14〕。本研究结果说明,VNS可以让难治性癫痫大鼠海马组织CA3区受损状态得到改善,内皮细胞、核仁、微血管等都处于恢复状态,提示VNS会减轻难治性癫痫造成的海马组织损伤。

本研究说明,VNS治疗会有效控制难治性癫痫的发作,减少海马神经元的凋亡、坏死,进而保护海马神经元,这一点或许就是VNS抗癫痫的作用机制,VNS与海马神经元之间的调节机制还需进一步研究。既往研究表明,MCP-1、LAP、P-gp等相关蛋白都与难治性癫痫的耐药性有紧密联系〔15,16〕。本研究结果提示,海马区MCP-1、LAP、P-gp蛋白与耐药基因有密切关系,可作为非药物作用的治疗靶点,是VNS治疗的新作用途径。

HMGB1会作为损伤相关分子模式参与多种疾病的发病中,经常参与机体耐药及炎症的修复过程中。HMGB1在多项动物癫痫模型实验中都有较高的蛋白表达,研究人员证实了HMGB1是通过介导炎症来激活癫痫病灶组织,进而促进癫痫的发生、发展〔17～19〕。TLR4会参与机体免疫应答反应,相关研究已经证实,TLR4在脑中的表达范围仅存在于突胶质细胞、星形胶质细胞及小胶质细胞中,在中枢神经系统结构中也有一定表达,其在这些组织中的高表达会加速神经元死亡〔20,21〕。本研究结果显示,提示HMGB1/TLR4通路的活化是癫痫发生、发展的重要原因,且与癫痫的耐药性有关,据此可以推测,VNS可能通过HMGB1/TLR4信号通路,逆转了相关耐药基因,比如MCP-1、LAP、P-gp过度表达而发挥调节作用,让神经功能趋于平衡状态,抑制癫痫发作。