路邓葡萄球菌感染的临床特征及耐药性分析

张霞 程江豪 李曦 朱明利

路邓葡萄球菌作为条件致病菌，最常定居于人体腹股沟、会阴部、下肢、腋窝、鼻腔黏膜等汗液分泌较多的部位[1-4]，随着机体免疫力降低，大量抗菌药物的滥用，器官移植患者的日益增多，路邓葡萄球菌引起相关侵袭性感染的报道逐年增加，已成为危害人类生命的重要机会性致病菌，路邓葡萄球菌可引起严重的伤口感染、菌血症、心内膜炎、联合感染、尿路感染、移植物瓣膜炎[5-7]。有报道发现该菌可导致中枢神经系统感染进而引发脑血管意外[8]，甚至可能出现路邓葡萄球菌感染被误诊而导致患者死亡的情况。

目前在全球范围内，凝固酶阴性葡萄球菌耐药情况比较严重。而路邓葡萄球菌属于凝固酶阴性的葡萄球菌，国内对其耐药仅有个案报道。崔嵬等[9]分析34 例路邓葡萄球菌感染，发现耐甲氧西林路邓葡萄球菌（methicillin- resistant Staphylococcus lugdunensis，MRSL）检出率低于50%，但例数偏少且与甲氧西林敏感路邓葡萄球菌（methicillin-sensitivity Staphylococcus lugdunensis，MSSL）差异无统计学意义，而其他学者对路邓葡萄球菌的研究更少，更鲜有不同标本来源的路邓葡萄球菌耐药性及其炎症指标差异的研究。本研究收集近年来临床分离出引起感染的路邓葡萄球菌菌株，分别对其鉴定、耐药及致病情况进行分析，以期为临床治疗提供理论依据。

1 对象和方法

1.1 对象 收集2017 年1 月1 日至2022 年12 月31 日分离出的83 株路邓葡萄球菌，根据纳入标准和排除标准剔除32 株，最终纳入51 例患者的51 株可致病的路邓葡萄球菌，其中，杭州市西溪医院22 例，浙江省人民医院29 例。纳入标准：（1）所选菌株均为致病性菌株，患者出现临床感染症状，血常规提示细菌感染；（2）所有就诊患者样本分离出的致病性菌株及完整的临床资料；（3）菌株鉴定需通过涂片革兰染色、部分生化反应及VITEK2 Compact 细菌鉴定仪（法国梅里埃生物公司）和基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（desorption ionization time-off light mass spectrometry，MALDITOF MS）仪（法国梅里埃生物公司）鉴定，且鉴定率为95%以上。排除标准：（1）排除同一例患者的重复菌株；（2）临床资料缺失；（3）临床怀疑定植菌或污染菌。样本主要来自皮肤软组织感染脓液29株（56.86%），血液10 株（19.61%），胸水7 株（13.73%），尿液2 株（3.92%），皮肤拭子2 株（3.92%），脑脊液1 株（1.96%）。根据对甲氧西林耐药情况，将51 株路邓葡萄球菌分为MRSL 22株（43.14%）和MSSL 29 株（56.86%）。本研究经杭州市西溪医院医学伦理委员会审查通过（批准文号：杭西医伦审2023 研第045 号）。

1.2 菌株鉴定及药物敏感试验

1.2.1 初步鉴定 严格按照临床作业指导书在生物安全柜内进行无菌操作，不同标本采用不同处理方式：伤口软组织脓液标本3 000 r/min 离心5 min，弃上清液，取沉渣，用一次性无菌棉签蘸取样本涂抹于血琼脂平板一区（若脓液量过少，亦可直接将所有脓液取出置于血琼脂平板上）；将收集尿液标本的容器轻轻旋转混匀，用无菌移液器吸取尿液10 μL 涂抹于血平板和麦康凯平板上，再密集划线，35～37 ℃培养18～24 h，观察菌落生长情况，将平板菌落数乘以102，即为每1 mL 尿液中所含有的细菌数（CFU/mL），如菌落生长过多无法精确计数时，则报告＞104CFU/mL；血液及胸水标本在培养箱内报告阳性后取出，用注射器抽取部分血液或胸水（20 μL 左右）接种在血平板上；用接种环在红外线灭菌器上高热灭菌后四区划线，将划好的平板放于35 ℃CO2培养箱进行培养18～24 h，第2 天取出用接种环/针挑取纯种单颗菌落进行分离鉴定，先将可疑菌落涂片并革兰染色，显微镜下观察菌落形态。同时做生化反应显示氧化酶阴性，玻片凝固酶阳性，触酶阳性，初步确定菌株类型，若可疑菌落较小或菌量不够，取单颗菌落继续接种于血平板上，培养18～24 h 后获得纯菌落。

1.2.2 最终鉴定 （1）VITEK2 Compact 鉴定：再挑取分离纯化后的3～4 颗菌落充分混悬于专用0.45%氯化钠溶液中，配制麦氏浊度为0.5～0.63 McF（麦氏单位）的菌悬液，从第1 管中取出280 μL 菌悬液加入第2 管中稀释混匀，将卡片（鉴定卡GP 和药敏卡AST-GP67）[杭州市怡丹（蓝）生物技术有限公司购买]按顺序分别放入载卡架上，输样管插入到菌液管中，采用法国梅里埃公司生产的VITEK2 Compact 细菌鉴定仪进行鉴定及药敏。待药敏结果出来后，严格按照最新美国临床实验室标准化协会CLSI 规则及标准进行[10]，测定最低抑菌浓度（minimal inhibitory concentration，MIC），判定其药敏情况，质控菌株采用金黄色葡萄球菌ATCC25923。（2）MALDI-TOF MS 技术进行鉴定：先将质控品大肠埃希菌ATCC8739 均匀涂抹于质控圈内，用牙签蘸取单颗部分菌落，均匀涂抹于鉴定圈内，待菌落干燥后，在涂有细菌的圈内加入1 滴基质液，等基质液干燥，打开仪器。将鉴定板塞入仪器内，开始鉴定。待鉴定结果出来，利用VITEK2 Compact 仪器进行药敏试验。

1.3 血常规及CRP 检测 抽取患者手指末梢血（不低于30 μL）或EDTA/肝素抗凝全血（不低于30 μL），部分按1∶4 比例用样本稀释液稀释，轻摇10 s 充分混匀后利用Nephstar plus 仪器进行常规检测CRP，部分全血直接放在希森美康XN 流水线上进行血常规检测WBC、中性粒细胞（neutrophil，NEUT）及中性粒细胞/WBC 比值（NEUT/WBC），最后将结果直接上传至lis 系统，结合鉴定结果进行统计学处理。

1.4 统计学处理 采用SPSS 22.0、WHONET 5.6 和Excel 2010 统计软件。正态分布的计量资料以表示，组间比较采用两独立样本t检验；非正态分布的计量资料以M（P25，P75）表示，组间比较采用Mann-WhitneyU检验。计数资料以例（%）表示，组间比较采用χ2检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 路邓葡萄球菌感染患者的临床情况分析 分离出致病性路邓葡萄球菌的感染患者中，男性居多，不同感染部位患者中，MRSL 与MSSL 感染患者的占比比较差异均无统计学意义（均P＞0.05），见表1。

表1 路邓葡萄球菌感染患者的临床情况分析

2.2 路邓葡萄球菌药敏结果 51 株路邓葡萄球菌药敏结果中，青霉素耐药率最高，其次是红霉素、克林霉素、四环素、环丙沙星、莫西沙星、左氧氟沙星和复方新诺明；22 株MRSL 药敏结果中，青霉素耐药率最高，其次是红霉素、克林霉素、环丙沙星、四环素、莫西沙星、左氧氟沙星；29 株MSSL 药敏结果中，青霉素耐药率最高，其次是红霉素、克林霉素、复方新诺明、四环素；MRSL 与MSSL 对青霉素和环丙沙星的耐药率比较差异均有统计学意义（均P＜0.05），其余抗菌药物的耐药率比较差异均无统计学意义（P＞0.05），见表2。

2.3 MRSL 与MSSL 感染患者相关部分炎症指标的比较 结果显示，MRSL 感染患者与MSSL 感染患者的CRP 水平比较差异有统计学意义（P＜0.05）。提示机体在感染MRSL 后，CRP 水平可出现明显升高，可以辅助临床诊断细菌感染。而NEUT、WBC 及NEUT/WBC比较差异均无统计学意义（P＞0.05），提示在明确路邓葡萄球菌感染时，常规感染指标需结合临床其他炎症指标进行诊断，见表3。

表3 MRSL 与MSSL 感染患者相关部分炎症指标的比较

3 讨论

目前，葡萄球菌机会性感染已成为院内感染的主要原因之一，导致院内发病率和死亡率明显升高。国内外对于路邓葡萄球菌感染的病例报道逐年增多，如婴幼儿及新生儿通过尿道或血液感染路邓葡萄球菌[11-12]，部分患者感染后引起关节感染、足部脓肿及心内膜炎等[13-15]。有研究表明，早期鉴定出路邓葡萄球菌并及时使用抗生素治疗可降低瓣膜型心内膜炎感染的死亡率[16]。因此，及早鉴定路邓葡萄球菌是否为致病菌观察该菌对抗生素的耐药情况，避免误诊漏诊，指导临床用药显得尤为重要。但目前国内外的相关报道多数为个例[17-18]，通常，凝固酶阳性的金黄色葡萄球菌被认为是毒性最强、侵袭力最大的菌种。而凝固酶阴性的葡萄球菌则被认为致病性较低，常被作为污染菌或正常菌群。但自1988 年凝固酶阴性葡萄球菌之一路邓葡萄球菌被发现以来[19]，其毒性似乎与金黄色葡萄球菌有相似之处，如可产生黏附因子、蛋白水解酶、生物膜等。当患者免疫力低下时，路邓葡萄球菌可引起严重的侵袭性机会性感染，如皮肤软组织感染、心肌炎、骨髓炎、伤口感染、尿路感染甚至神经系统感染导致脑血管意外等，尤其是路邓葡萄球菌引起的瓣膜性感染性心内膜炎时若不能及时治疗，可引起患者出现感染性休克乃至死亡。本研究发现，脓液中分离出的路邓葡萄球菌占比最高（56.86%），其次为血液（19.61%）、胸水（13.73%）、尿液（3.92%）、皮肤拭子（3.92%）及脑脊液（1.96%）等，提示路邓葡萄球菌引起的软组织感染比例较高，不可轻易将其定义为污染菌而不加处理。

路邓葡萄球菌与金黄色葡萄球菌虽有不同，但其致病性却诸多相似，如路邓葡萄球菌可产生与金黄色葡萄球菌相似的毒力因子，比凝固酶阴性葡萄球菌更具有侵袭性。本研究收集的51 株路邓葡萄球菌中，多数分离自免疫力较低或合并基础性疾病的患者，这与国外研究报道多数感染该菌的患者有潜在的免疫抑制病史，包括糖尿病、慢性类固醇类药物治疗、移植物瓣膜等[6]一致，但本研究发现感染者多为男性，占比超过90%，这可能与收治患者类型的局限性有关，杭州市西溪医院是以治疗肝病、艾滋病等专科疾病为特色的综合性医院，入院患者以男性居多。本研究中多数样本分离自脓液（56.86%），与此前报道的路邓葡萄球菌感染最常引起脓肿一致[3]，有研究认为，采集患者机体深部的样本分离到路邓葡萄球菌，被认为是致病菌，而对于皮肤拭子或在定植部位（如腹股沟、鼻腔、腋窝等）分离出的该菌则需要根据患者的临床感染情况慎重考虑是否为定植甚至是污染菌。国外有报道1例路邓葡萄球菌感染引起新生儿尿路感染，而本研究从尿液分离出2 株路邓葡萄球菌作为致病菌，均为成人样本，经鉴定为MRSL 对多种抗菌药物产生耐药，其余从尿液中分离的路邓葡萄球菌作为污染菌处理。

本研究发现，分离出的51 株路邓葡萄球菌均作为致病菌，引起不同程度的临床症状，严重者可出现各类脓肿、移植物瓣膜炎、菌血症、脓毒血症、败血症，进而危及生命。而另有32 株分离出的路邓葡萄球菌被认为是污染菌未做处理，该部分患者预后状况不佳，甚至死亡1 例，这是否与未将路邓葡萄球菌作为致病菌进行用药有关仍待研究。根据2014 年桑福德指南提示，青霉素是治疗路邓葡萄球菌的首选药物，有国外研究发现67%的菌株对青霉素敏感[20]，青霉素曾是治疗路邓葡萄球菌侵袭性感染的首选药物。本研究的药敏结果显示，MSSL 对青霉素的敏感率仅为48.28%，而MRSL 则对青霉素全部耐药。MRSL 与MSSL 针对青霉素耐药率的比较发现有统计学意义（P＜0.05），针对MSSL，青霉素治疗效果可能优于MRSL。而这与多年来抗菌药物滥用可能有关，并不是所有路邓葡萄球菌对青霉素均有效，临床需根据药敏情况择优选择合适的抗菌药物。针对喹诺酮类药物如环丙沙星，MRSL与MSSL 耐药率比较差异有统计学意义，而左旋氧氟沙星却无明显变化，这可能与样本例数较少有关，仍需增加样本量继续探索。无论是MRSL 亦或MSSL，对氨基糖苷类、利福平、四环素类、利奈唑胺、糖肽类及甲氧苄啶/磺胺甲恶唑类抗菌药物具有较好的敏感性，这与Taha 等[21]报道的药敏结果不尽相同。

CRP 属于急性期反应蛋白，是针对感染或创伤的一种炎症指标，CRP 水平升高与可能细菌感染有关，也可因自身免疫性疾病、心脏疾病等引起。因此本研究针对CRP 及WBC、NEUT 及NEUT/WBC 进行比较发现，MRSL 与MSSL 感染者的CRP 水平比较差异有统计学意义，而其他炎症指标则差异均无统计学意义。提示感染MRSL 后，其血液中炎性因子CRP 水平明显升高，提示在患者机体处于低免疫力状态时，定植菌可发展成机会性致病菌并引起严重的并发症或脓毒血症，需引起临床注意。国外研究发现，路邓葡萄球菌引起侵袭性感染主要依赖于其基因序列中含有可编码铁依赖性的表面位点系统[22]，有助于路邓葡萄球菌从Hb 中获得血红素，进而造成血液中较为严重的侵袭性感染，这与金黄色葡萄球菌的侵袭方式相似，且对苯唑西林敏感性的解释亦与金黄色葡萄球菌相同。但国外报道过1 例携带SCCmecV 型基因的路邓葡萄球菌被误诊为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的病例，该患者是1 例73 岁老年女性，患有系统性动脉高压和慢性阻塞性肺疾病等基础性疾病，入院后出现急性呼吸衰竭及脓毒症，由于用药不当最终死亡，对其脓性分泌物进行基因检测同时对药敏进行分析最终确定为路邓葡萄球菌引起的侵袭性感染。而对本研究收集的51 株路邓葡萄球菌引起感染的患者，根据药敏结果进行合理用药后，患者症状减轻，复查结果显示路邓葡萄球菌被抑制或杀灭，未引起进一步的菌血症或脓毒血症。

总之，针对路邓葡萄球菌的研究仍处于初级阶段，亦出现将致病菌误诊污染菌而不去治疗，最终导致菌血症甚至脓毒血症，引起严重的临床症状。因此，仍需加大样本量对路邓葡萄球菌进一步探索，进而挽救因路邓葡萄球菌造成严重感染的患者性命。