黄酒多酚对阿霉素心脏毒性的保护作用研究

陆燕 韩敏 孟立平

随着医疗技术水平的提高，化疗药物以及新型靶向药物的问世，恶性肿瘤患者长期存活率不断提升。但是，抗肿瘤药物是一把双刃剑，在杀伤肿瘤细胞的同时，也会损伤自身的组织细胞，特别是心脏细胞。心血管疾病现在已经成为长期生存的癌症患者的第二大死亡原因。如何减轻肿瘤药物的心脏毒性，是肿瘤科医师和心血管医师当下共同面对的挑战。阿霉素（doxorubicin，Dox）是目前广泛应用的抗肿瘤药物之一，可有效抑制肿瘤细胞的生长，同时也是公认可以引起心脏毒性的药物。心脏纤维化导致的心脏重构是Dox 心脏毒性作用发生过程中的关键一步，而心脏成纤维细胞是诱导纤维化的主要原因。然而，目前尚未发现可有效抑制Dox 心脏毒性的药物。黄酒多酚（yellow wine polyphenolic compounds，YWPC）不仅能抑制同型半胱氨酸诱导的血管平滑肌细胞迁移和增殖，还能抑制基质金属蛋白酶-2（matrix metalloproteinases-2，MMP-2）的表达，减缓高脂饮食诱导小鼠的动脉粥样硬化斑块形成[1-2]。此外，本团队前期研究发现YWPC 可以降低Dox 的大鼠心脏毒性作用[3]。本研究旨在探索YWPC 对Dox 心脏毒性的保护作用及其可能机制。

1 材料和方法

1.1 材料 （1）实验动物：Wistar大鼠32只，180～220 g，购自浙江省动物研究中心。（2）实验试剂：YWPC 从黄酒中提取（由上海中药制药技术有限公司，国家中药制药工程技术研究中心提供），具体操作步骤参照文献[4]，YWPC 为白色粉末状，溶解于无菌水（YWPC 1 g溶解于1 000 mL 无菌水）后按照30 mg/kg 给大鼠灌胃（200 g 体重大鼠灌胃6 mL）；Dox 粉剂购自美国Sigma公司，溶解于无菌水（1 g Dox 溶解于1 000 mL 无菌水）后按照3 mg/kg 腹腔注射（200 g 体重大鼠腹腔注射0.6 mL）；过氧化物酶体增殖物激活受体-γ（peroxisome proliferator activated receptor-γ，PPAR-γ）拮抗剂GW9662 购自美国Sigma 公司，溶解于无菌水（1 g GW9662 溶解于1 000 mL 无菌水）后按照1 mg/kg 腹腔注射（200 g 体重大鼠腹腔注射0.2 mL）。兔抗鼠肌动蛋白α（smooth muscle actin α，SMα）（ab128857）、转录因子21（transcription factor 21，Tcf21）（ab182134）、MMP-2（ab256748）、PPAR-γ（ab310323）单克隆抗体购自美国ABCOM 公司；辣根过氧化酶标记的羊抗兔或者羊抗鼠二抗以及蛋白免疫印迹相关试剂购自江苏碧云天生物技术研究所。本研究经浙江大学实验动物福利伦理审查委员会审查通过（批准文号：11883）。

1.2 方法

1.2.1 分组及干预 将32 只Wistar 大鼠饲养1 周后，按随机数字表法分为对照组、Dox 组、Dox+YWPC 组、Dox+YWPC+GW9662 组，每组各8 只。对照组大鼠不做处理，仅给予正常饮食；Dox 组大鼠在正常饮食基础上每2 d 腹腔注射1 次Dox 3 mg/kg；Dox+YWPC 组大鼠在正常饮食和腹腔注射Dox 的基础上，同时每天灌胃YWPC 30 mg/kg[4]；Dox+YWPC+GW9662 组大鼠在正常饮食、腹腔注射Dox、YWPC 灌胃的基础上，在Dox 治疗前30 min 腹腔注射GW9662 1 mg/kg。所有大鼠干预4周，均饲养在黑暗的房间里，12 h 光照和12 h 黑暗循环，严密监测各组大鼠的健康状况和活动情况，以及液体摄入量和食物摄入量，每周监测体重。

1.2.2 心功能检测 干预4 周后，将各组大鼠腹腔注射氯胺酮75 mg/kg 麻醉后使用实验动物心电图机记录心电图检查结果，并根据心电图示踪计算心率。使用Philips iE33 系统（荷兰Philips Medical 公司）行心脏超声检查评估心脏结构和功能，测定左心室缩短分数（left ventricular fractional shortening，LVFS）和左心室射血分数（left ventricular ejection fraction，LVEF）评价左心室收缩功能，检测舒张早期二尖瓣峰值流速（E）和心房收缩（A），计算E/A 比值。测量连续3 个心脏周期后取平均值。实验重复3 次。

1.2.3 心脏纤维化程度检测 干预4 周后，采用颈椎脱臼法处死大鼠，取出完整心脏，部分心脏组织用10%甲醛固定，石蜡包埋，切成5 μm 薄片，进行HE 染色和Masson 染色检测大鼠心脏纤维化程度，使用Image-Pro Plus 6（美国Media Cybernetics 公司）软件计算心脏纤维化程度，结果以百分比表示。

1.2.4 心肌细胞超微结构检测 上述1.2.3 方法取出的部分心脏组织用PBS 清洗。用眼剪低温切左心室心肌成直径1 mm×1 mm 的组织，固定、浸泡、逐步乙醇脱水、置换、包埋、聚合、切片、染色后记录图像，采用电镜（日本日立公司，型号：JEM-2000EX）观察心肌细胞超微结构变化。实验重复3 次。

1.2.5 心脏成纤维细胞中PPAR-γ 表达的检测 采用免疫组化法。上述1.2.3方法获取的薄片使用抗PPARγ 抗体（1∶100）进行免疫组化染色。薄片用苏木精反染色，显微镜（德国莱卡公司，型号：DM3000）下成像，用Image pro-Plus 6 软件分析PPAR-γ 在各组大鼠心脏成纤维细胞中的表达和分布情况。实验重复3次。

1.2.6 心脏成纤维细胞中SMα、Tcf21、MMP-2 和PPAR-γ 表达的检测 采用Western blot 法。将1.2.3取出的部分心脏组织匀浆后，4 ℃、13 000 r/min 离心5 min。 然后用BCA 法检测上清液中蛋白质的浓度。将上清液与5×SDS 样品缓冲液混合，在沸水浴中加热5 min，使蛋白变性。之后将变性蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，转移到PVDF 膜上，与SMα、Tcf21、MMP-2 和PPAR-γ 一抗（1∶1 000）在4 ℃孵育过夜。用TBS-T 冲洗膜3 次，10 min/次，室温下在辣根过氧化物酶标志的二抗（1∶5 000）中孵育1 h。信号由Immobilon Western chemiluminescent HRP Substrate（Millipore）测定，以βactin 做参照。辣根过氧化物酶标记的二抗孵育后ECL化学发光法检测目标蛋白。暗室柯达胶片显影，Quantity one 软件定量分析各组大鼠心脏成纤维细胞中SMα、Tcf21、MMP-2和PPAR-γ的表达情况。实验重复3次。

1.3 统计学处理 采用SPSS 20.0 统计软件。计量资料以表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 4 组大鼠心功能指标的比较 干预4 周后，与对照组比较，Dox 组大鼠心率增加，而LVEF、LVFS、E/A下降（均P＜0.05）。与Dox 组比较，Dox+YWPC 组大鼠心率降低，LVEF、LVFS、E/A 增加（均P＜0.05）。此外，与Dox+YWPC 组比较，Dox+YWPC+GW9662 组大鼠心率增加，而LVEF、LVFS、E/A 均下降（均P＜0.05），见表1；4 组大鼠心超检查结果见图1。

图1 4 组大鼠心脏超声检查结果

表1 4 组大鼠心功能指标的比较

2.2 4 组大鼠心脏纤维化程度的比较 HE 染色显示，对照组大鼠心脏成纤维细胞排列规则，Dox 组大鼠心脏成纤维细胞排列出现不规则，Dox+YWPC 组大鼠心脏成纤维细胞排列恢复规则，而GW9662 则减弱了YWPC 的作用，见图2A（插页）。Masson 染色显示，与对照组比较，Dox 组大鼠心脏纤维化明显，加入YWPC减弱了Dox 引起心脏纤维化的作用，同时，GW9662 可以逆转YWPC 的作用，见图2B（插页）。电镜检查显示，与对照组比较，Dox 组心肌细胞线粒体数量增加，肌丝排列紊乱；YWPC 可缓解Dox 引起的线粒体和肌丝变化，加入GW9662 后，YWPC 的作用被消除，见图2C（插页）。4 组大鼠心脏成纤维化程度比较见图2D（插页）。

图2 4 组大鼠心脏组织HE 染色、Masson 染色、电镜检查结果（A：HE 染色结果，×20；B：Masson 染色结果，×20；C：电镜检查结果，×30 000；D：4 组大鼠心脏纤维化程度比较）

2.3 4 组大鼠心脏成纤维细胞中PPAR-γ 表达情况的比较 与对照组比较，Dox 组PPAR-γ 表达量减少（P＜0.05）；与Dox 组比较，Dox+YWPC 组PPAR-γ 表达量增加（P＜0.05）；与Dox+YWPC 组比较，Dox+YWPC+GW9662 组大鼠心脏成纤维细胞中PPAR-γ 表达量降低（P＜0.05）。见图3。

图3 4 组大鼠心脏成纤维细胞中PPAR-γ 的表达及分布（A：4 组大鼠中PPAR-γ 表达的电泳图；B：4 组大鼠中蛋白电泳检测PPAR-γ 相对表达量比较；C：4 组大鼠中免疫组化检测PPAR-γ 相对表达量比较；D：4 组大鼠中PPAR-γ 检测的免疫组化染色结果，×20）

2.4 4 组大鼠心脏成纤维细胞中SMα、Tcf21 和MMP-2表达情况的比较 与对照组比较，Dox 组大鼠心脏组织中SMα、Tcf21 和MMP-2 的表达量增加（均P＜0.05）；与Dox 组比较，Dox+YWPC 组中SMα、Tcf21 和MMP-2 的表达量减少（均P＜0.05）；与Dox+YWPC 组比较，Dox+YWPC+GW9662 组中SMα、Tcf21 和MMP-2的表达量增加（均P＜0.05）。见图4。

图4 4 组大鼠心脏成纤维细胞中SMα、Tcf21 和MMP-2 的表达情况（A：4 组大鼠中SMα、Tcf21 和MMP-2 表达的电泳图；B：4 组大鼠中SMα 相对表达量比较；C：4 组大鼠中Tcf21 相对表达量比较；D：4 组大鼠中MMP-2 相对表达量比较）

3 讨论

与以往关注Dox 对心肌细胞损伤的研究不同，最近的一些研究表明Dox 对心脏成纤维细胞的影响也是其产生心脏毒性的关键步骤[5]。Mancilla 等[6]研究结果显示Dox 通过诱导线粒体损伤，引起心脏成纤维细胞的线粒体自噬，最终产生心脏毒性。此外，Doroshow等[7]发现Dox 诱导的活性氧可促进心脏成纤维细胞凋亡。此外，Narikawa 等[8]发现Dox 可以增加人心脏成纤维细胞中MMP-1、IL-6、TGF-β 和胶原蛋白的表达。这些研究从心脏成纤维细胞的纤维化改变的角度提出了Dox 心脏毒性的潜在新机制。

在正常的心肌组织中，大多数构成心脏网状纤维结构成纤维细胞处于静止状态。静止的心脏成纤维细胞呈梭形，增殖和迁移能力较弱。在各种炎症介质、细胞因子、物理张力和其他病理因素刺激的作用下，静止的心脏成纤维细胞被激活并转化为活化的心脏成纤维细胞。活化细胞具有以下特征：（1）表达促炎和促纤维化因子水平升高，直接促进炎症细胞浸润和成纤维细胞增殖；（2）分泌高水平MMPs 促进成纤维细胞迁移；（3）促进胶原蛋白和其他细胞外基质蛋白沉积，导致瘢痕形成；（4）表达SMα、Tcf21 和其他特异性标记蛋白。在病理因素刺激下，活化的心脏成纤维细胞大量增殖和迁移，并分泌MMP-2 等促进心脏重构的蛋白酶，改变心脏的间质结构，最终导致心脏重构。本研究结果表明，Dox 可以促进激活型心脏成纤维细胞标志物的表达，包括SMα、Tcf21 和MMP-2。这些结果表明，除了引起心肌细胞凋亡或焦亡外，心脏成纤维细胞的激活可能是Dox 心脏毒性的另一个关键机制。

流行病学研究表明，适量饮酒，尤其是红酒，与某些心脏疾病的风险成反比。在前人对红酒研究的基础上，笔者团队过去研究一直专注黄酒对心脏疾病的潜在保护作用。最早笔者团队发现黄酒可显著降低同型半胱氨酸诱导的大鼠血管平滑肌细胞中MMP-2的表达[9]。后续还证明了黄酒通过抑制低密度脂蛋白受体敲除小鼠中MMP-2 的表达和激活来改善动脉粥样硬化斑块[10]。黄酒是一种复杂的混合物，含有多种成分，包括多肽、低聚糖和YWPC 等多种对人体有益物质，笔者团队在前期研究中从黄酒中提取了上述成分，发现YWPC 和多肽在动物和细胞层面对冠心病都有保护作用[1,11]。之后的研究进一步证实YWPC 可以通过靶向雷帕霉素/P70S6K 通路的哺乳动物靶点抑制血管平滑肌细胞表型转化[11]。在上述研究结果的基础上，本研究证明了YWPC 还具有预防Dox 心脏纤维化的作用，同时YWPC 可以降低Dox 诱导的心脏成纤维细胞激活。这可能是YWPC 防止Dox 产生心脏毒性的机制。

引起心脏成纤维细胞激活的机制过去已有不少报道。Tian 等[12]发现Anoctamin-1 通过atir 介导的MAPK 信号通路调节心脏成纤维细胞增殖。Miao 等[13]报道了Toll 样受体/MyD88 信号通路参与心脏成纤维细胞迁移的调节。最近，Chen 等[14]也发现PPAR-γ 通过抑制瘦素下游信号STAT3 磷酸化在心肌纤维化和心肌重塑活性中发挥关键作用。PPAR 是配体激活的核转录因子，分为3 个亚型，即α、β/δ 和γ。其中，PPAR-γ 在心肌重塑中具有多种药理活性。例如，PPAR-γ 具有抗心脏纤维化作用，抑制局部血管紧张素Ⅱ诱导的瘦素自分泌活性，抑制心脏成纤维细胞增殖和迁移。本研究发现，Dox 处理的大鼠心脏成纤维细胞中PPAR-γ 被抑制，而YWPC 可以增加PPAR-γ 的表达。这些结果表明YWPC 可能是通过增加PPAR-γ的表达来抑制Dox 的心脏毒性。此外，在加入PPAR-γ拮抗剂GW9662 后，YWPC 对Dox 诱导的心脏成纤维细胞活化和心脏纤维化的保护作用消失，从另一个层面证明YWPC 可能是通过增加PPAR-γ 的表达来抑制Dox 的心脏毒性。

本研究发现，YWPC 可以抑制Dox 诱导的大鼠心脏成纤维细胞的激活和心脏纤维化，从而减缓Dox 的心脏毒性。YWPC 的心脏保护作用可能与其增加PPAR-γ 表达的能力有关。因此，笔者推测少量饮用黄酒可能可以减少Dox 的心脏毒性。本研究没有进一步通过体外培养成纤维细胞来验证YWPC 作用，是一大遗憾，有待今后再作努力。