浙江省肉鸡源耐药大肠杆菌耐药表型及耐药基因型的分析

宗帅州，辛丽娜，白佳琪，韩剑众，曲道峰

（浙江工商大学 杭州 310018）

中国是禽肉消费大国，自2017 年以来，中国的肉鸡出栏量已超过每年100 亿只鸡[1]。在鸡养殖过程中，大肠杆菌被认为是主要病原体[2]。致病性大肠杆菌往往会引起重大传染病，其症状多为呼吸道感染、卵黄囊感染、肠炎、败血症、浆膜炎和输卵管炎等[3]。此外，大肠杆菌还能与其它病原体共同作用于宿主，造成混合感染，其高发病率与高死亡率，给畜禽养殖业造成巨大的经济损失[4]。目前来看，抗生素仍是治疗大肠杆菌感染的主要手段，然而，在鸡养殖产业中大量使用治疗性抗生素与抗生素生长促进剂已经引发严重的动物源和食源性细菌耐药性问题[5]。据高玉斌等[6]的报告，2017年于国内7 个代表性地区（山西、山东、西藏、云南、新疆、江苏、吉林）养殖场中分离到130 株鸡源大肠杆菌，对四环素、氨苄西林、磺胺异噁唑、复方新诺明、氟苯尼考的耐药率分别为91.54%，90.77%，78.13%，79.83%，81.25%。据唐标等[7]的报道，2019 年于湖南省部分鸡养殖场中分离到的146 株大肠杆菌对四环素、氨苄西林、磺胺异噁唑、复方新诺明、氟苯尼考的耐药率分别为87.7%，85.0%，78.1%，75.3%，67.1%。从以上数据来看，国内鸡源大肠杆菌耐药率处于较高的水平，耐药情况非常严重，而养殖环境中的耐药菌不仅提高畜禽细菌病治疗难度，也可以通过污染水源、土壤传播给人，还可以通过禽类产品加工链进行更广泛的传播[8]。我国虽然已经开展动物源细菌耐药性检测，但是仅在省级层面对个别养殖场进行样品采集，对于市级层面的耐药菌研究仍存在很大空缺[9]。

本研究对浙江省湖州、嘉兴、绍兴市共12 家肉鸡养殖场进行粪便与环境样品的采集，通过16S rRNA 测序进行菌株鉴定，对分离得到的大肠杆菌进行耐药表型与基因型检测，共现网络分析整合子与耐药基因的相关性，揭示耐药基因的传播特点，为鸡源耐药菌的监测提供依据，为当地保证食品安全提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 样品采集

2021 年5 月分别从浙江省3 市共12 家养殖场（每市各4 家养殖场）中，各采集粪便样品20份、土壤样品20 份，污水样品20 份，共720 份样品置于无菌样品袋与采样管中。样品采集后均立刻置于低温（2～8 ℃）样品箱中，待采样结束后运至实验室进行大肠杆菌分离。

1.2 主要试剂

Mueller-Hinton肉汤、脑心浸液（BHI）培养基、缓冲蛋白胨水（BPW）、细菌琼脂粉，购自青岛海博生物技术有限公司；麦康凯琼脂培养基，购自美国BD 公司；药敏纸片，购自杭州微生物试剂有限公司；细菌基因组DNA 快速抽提试剂盒、16S rRNA 通用引物与50X TAE 缓冲液，购自上海生工生物工程有限公司；2X Taq PCR Master Mix、10 mg/mL 溴化乙锭（EB）、琼脂糖、DL2000 DNA Marker，购自BBI 生命科学有限公司。

1.3 菌株初筛与鉴定

将采集到的样品接种至BPW 中，37 ℃条件下增菌12 h 后，使用接种环取菌液在麦康凯琼脂培养上进行划线分离，于37 ℃恒温培养箱内培养18～24 h，挑取可疑菌落（鲜桃红色或微红色，菌落中心呈深桃红色），在BHI 琼脂培养基上进行划线纯化，再次于37 ℃培养18～24 h 后进行PCR 鉴定。

本研究采用16S rRNA 测序技术对分离得到的菌株进行鉴定。按细菌基因组DNA 快速抽屉试剂盒的要求提取经分离纯化后的大肠杆菌疑似菌株。上下游引物采用16S 通用引物27F（YMAGAGTTTGATYMTGGCTCAG）和 1492R（TACCTTGTTACGACTT），将配置好的PCR 体系（2X Taq PCR Master Mix 25 μL、ddH2O 19 μL、上游引物0.5 μL、下游引物0.5 μL、模板DNA 5 μL）使用涡旋振荡仪上振荡混匀后低速离心。PCR 扩增条件为96 ℃预变5 min，以95 ℃变性30 s、50 ℃退火90 s、72 ℃延伸60 s 进行30 个循环后，最后72 ℃再延伸5 min，PCR 程序结束后于4 ℃保存。取5 μL 扩增产物加入1.5%琼脂糖凝胶中进行电泳，电压为120 V，电泳时长30 min。经蛋白印迹检测系统下观察琼脂糖凝胶是否在1 500 bp 处有对应条带，将扩增成功的PCR 产物送至上海生工股份有限公司进行双向测序，测序结果经NCBI 数据库blast 比对鉴定菌株。

1.4 药敏试验

本次试验分离得到的大肠杆菌耐药谱根据纸片扩散法（Kindy-Bauer）进行测定，选择8 大类20种抗生素，参照美国临床实验室标准化委员会（CLSI）标准进行结果判定和质量控制。

1.5 耐药基因及整合子的PCR 鉴定

根据已有文献报道过的引物序列，对常见的9 大类抗生素耐药基因进行PCR 鉴定，配置耐药基因扩增体系，扩增条件为：95 ℃下预变性5 min，95 ℃下变性30 s，对应引物的退火温度40 s，72 ℃延伸40 s，进行30 个循环；72 ℃最终延伸5 min。

根据已有文献报道过的整合酶基因引物，对已被报道过的3 类整合子进行检测，并对整合酶阳性菌株进行整合子内部基因盒扩增与分析。按各自PCR 扩增条件扩增后，对成功扩增出条带的整合子基因盒扩增产物送至上海生工股份有限公司进行一代测序，测序结果经blast[10]比对后进行下一步分析。

1.6 数据分析

运用SPSS 16.0[11]对试验数据进行统计分析，并通过Origin 8.0 可视化。耐药基因与可移动元件的相关性通过R 软件包“vegan”与“psych”进行计算，并适应Gephi[12]实现共现网络图的可视化。

2 研究结果

2.1 细菌的分离鉴定

3 市采集的720 份样品经涂板培养与16S rRNA 鉴定后，共分离得到234 株大肠杆菌，分离率为32.5%。按地区来看，3 市大肠杆菌分离率均在30%以上，分离率从高到低依次为嘉兴（34.6%，72/240）、绍 兴（32.1%，83/240）、湖 州（30.8%，77/240）。按样本类型来看，3 市养殖场分离出的大肠杆菌主要来源于粪便，分离率均高于其它样本类型，而3 市粪便样本中分离率最高来自嘉兴，高达58.8%。其次，3 地土壤样本的分离率均高于污水，土壤分离率最高的样本来自绍兴，为28，8%。对污水样本而言，分离率最高的为嘉兴21.3%。

2.2 分离株大肠杆菌的耐药表型

根据CLSI-2020[13]和EUCAST-2020[5]制定的关于纸片扩散法药敏试验的R/I/S 判定折点，对分离株大肠杆菌的药敏试验结果进行判定。由图1可知，3 市分离的大肠杆菌对8 大类，20 种抗生素呈现出不同的耐药表型。其中耐药率最高的为四环素，均在90%以上，嘉兴市分离株耐药率最高，高达95.31%，其次分别为绍兴市分离株的94.28%、湖州市分离株的91.26%。其次，3 市的分离株也对甲氧苄氨嘧啶、磺胺异噁唑呈现出高度耐药，耐药率均在80%以上。嘉兴市分离株对这两种抗生素耐药程度比其他两市更严重，对甲氧苄氨嘧啶的耐药率为92.1%，高于湖州的87%和绍兴的84.44%，对磺胺异噁唑的的耐药率为95.43%，高于绍兴的92.34%和湖州的89%。除了上述的3 种抗生素外，头孢他啶、头孢唑啉、头孢西丁、亚安培南、美罗培南、氨曲南、阿米卡星、链霉素、庆大霉素、环丙沙星、氯霉素、磷霉素、阿奇霉素、米诺环素这14 种抗生素的耐药率均为嘉兴市分离株高于其他两市分离株，嘉兴市肉鸡源大肠杆菌耐药程度更高。碳青霉烯类抗生素作为肉鸡养殖中禁用的抗生素，3 市分离株对亚胺培南的耐药率均高于10%，需要引起重视，而美罗培南的耐药程度较轻，湖州市分离株耐药率为4.76%，绍兴市分离株耐药率为8.61%，但嘉兴市分离株耐药率高达17.63%。

图1 三市大肠杆菌分离株对20 种抗生素的耐药率Fig.1 Antibiotic resistance rate of Escherichia coli to 20 antibiotics in 3 cities

表1 大肠杆菌的分离率Table 1 Isolation rate of Escherichia coli

2.3 大肠杆菌的耐药基因型鉴定

本研究分离得到的234 株大肠杆菌中耐药基因的检出率概况如表2 所示。β-内酰胺类耐药基因blaTEM有着非常高的检出率，达到76.9%，其次分别为blaCTX-M与blaSHV，检出率为26.06%与23.93%，而这3 种耐药基因均可编码超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）。介导碳青霉烯类耐药的blaNDM的检出率较低，仅为0.85%，其编码B 类碳青霉烯酶。而编码A 类与D 类碳青霉烯酶的基因blaKPC与blaOXA均为检出。氨基糖苷类耐药基因中，aadA1 的检出率最高，为88.89%，其次为aphA6、aacC、aac（6'）-Ib-cr，耐药率分别为21.79%，19.23%和11.53%。喹诺酮类耐药基因qnrA、qnrB、qnrD、qnrS 的检出率为34.19%，21.36%，16.67%以及36.75%。磺胺类耐药基因检出率较高的为sul1与sul2，分别为81.20%与23.08%，其余4 类均在10%以下，未检出sul3。酰胺醇类耐药基因floR、cmlA 的检出率为49.15%与18.38%，未检出cfr。而磷霉素耐药基因检出率整体较低，fosA 与fosB的耐药率分别为20.51%与11.97%。大环内酯类耐药基因中检出率最高的为mph（A）70.99%，其次为mph（E）的37.18%，ermA 最低，为8.12%。四环素类耐药基因中，检出率最高为tet（A），高达84.1%。tet（B）与tet（C）的检出率相对较低，为29.49%与16.67%。

2.4 大肠杆菌分离株耐药基因检出率地域性差异

进一步分析8 大类抗生素耐药基因检出率的地域性差异，由图2 可知，四环素耐药基因tet（A）、氨基糖苷类耐药基因aadA1、磺胺类耐药基因sul1 在3 市均有较高的检出率，且3 市之间检出率相差不大，而ermA 在3 市分离株中检出率均低于20%，blaNDM、folp3 的检出率低于10%，处于较低的水平。在检出的29 种耐药基因中，嘉兴市分离的大肠杆菌有18 种耐药基因的检出率高于其他两市，分别为tet（B）、mph（E）、mph（A）、qnrA、qnrD、qnrS、ac（6'）-Ib-cr、aacC、aadA1、blaCTX-M、blaSHV、blaNDM、folp1、folp3、dfrA27、floR、cmlA、catA1、fosA、fosB，其中blaNDM仅在嘉兴市分离株中被检出。而四环素耐药基因tet（A）、大环内酯类耐药基因ermA、喹诺酮类耐药基因qnrB、氨基糖苷类耐药基因aphA6、β-内酰胺类耐药基因blaTEM、磺胺类耐药基因sul1、folp2 的检出率均为湖州市最高。绍兴市分离株的tet（C）、sul2 检出率高于其他两市。根据耐药基因的检出率分布来看，耐药基因在嘉兴市流行率更高，嘉兴市的耐药情况相比于其他两市更严重。

图2 3 市大肠杆菌分离株耐药基因检出率Fig.2 Detection rate of antibiotic resistance genes of Escherichia coli in 3 cities

2.5 3 市整合子地域性分布差异

对3 市分离到的大肠杆菌进行整合酶基因PCR 鉴定，Ⅰ型整合酶基因intI1 阳性大肠杆菌共80 株，Ⅱ型整合酶基因intI2 共15 株，未检出intI3，且未在同一株菌中同时检出intI1 与intI2。如图3 所示，intI1 在湖州、嘉兴、绍兴市的检出率分别 为28.38%（n=21）、40.96%（n=34）、32.47%（n=25），而intI2 的检出率较低，在湖州、嘉兴、绍兴的检出率为6.76%（n=5）、3.61%（n=3）、9.09%（n=7）。对检出整合酶的大肠杆菌进行进一步分析，对整合子内部可变区进行PCR 扩增，并对扩增产物进行测序分析。通过测序鉴定，在29 株intI1 阳性大肠杆菌中共检出3 种不同类型的基因盒序列（dfrA17 -aadA5 -sul1 -tetR、aadA1 -aadA22 -aadA23、aadB-aadA1-cmlA6），在4 株intI2 阳性大肠杆菌中检出1 种基因盒序列（dfrA1-sat2-aadA1）。其中的Ⅰ型整合子包含两种甲氧苄啶耐药基因dfrA17、dfrA1，一种卡那霉素耐药基因aadB，4 种链霉素耐药基因aadA1、aadA22、aadA23、aadA5，以及一种氯霉素耐药基因cmlA6。而Ⅱ型整合子基因盒序列为一个甲氧苄啶耐药基因dfrA1，一个链丝霉素耐药基因sat2 和一个链霉素耐药基因aadA1。

图3 3 市大肠杆菌分离株整合酶基因检出率Fig.3 Detection rate of integrase genes of Escherichia coli in 3 cities

2.6 嘉兴市耐药基因与可移动元件的共现网络分析

经耐药表型的鉴定分析，对所检测的20 种抗生素中，嘉兴市大肠杆菌分离株对其中17 种的耐药率高于其他两市。而耐药基因型的鉴定分析表明，在所检测的29 种耐药基因中，嘉兴市大肠杆菌分离株共有18 种耐药基因的检出率高于其他两市，且嘉兴市分离株中Ⅰ型整合酶的检出率也高于其他两市。说明在嘉兴市中耐药基因分布广泛，且随移动元件进一步传播的风险更大，为此，我们对嘉兴市分离株中整合酶、耐药基因、整合子中插入序列进行共现网络分析，每个节点代表一个可移动元件或耐药基因，两点之间的连接线代表其在同一株菌中共现，连接线越粗表明共现的频率越高。结果如图4，其中8 个耐药基因tet（A）、sul1、sul2、floR、aadA1、tet（B）、tet（C）以及blaTEM处于共现网络的中心，这些耐药基因与其余耐药基因或可移动元件的相关性更强，是耐药性传播过程中其主要作用的几种耐药基因，需要进行重点监测。qnrA-mph（A）、fosA-sul1、fosA-blaTEM，sul2-aadA1，这4 组耐药基因之间共现频率较高，它们分别介导喹诺酮与大环内酯类抗生素，磷霉素与磺胺类、磷霉素与β-内酰胺类、磺胺类与氨基糖苷类耐药，表明在嘉兴市分离株中这几种耐药表型很可能同时出现。而Ⅰ型整合酶与sul1、blaTEM、tet（C）、sul2、tet（B）、floR 存在共现关系，说明这几类耐药基因随Ⅰ型整合子传播的风险较大。

3 讨论

多年来，抗生素作为促进畜禽生长、预防和治疗细菌性疾病的药物被广泛用于畜禽养殖业[14]，然而，抗生素的不合理使用对养殖环境中的细菌造成了长期的选择性压力[15]，导致了动物源性耐药菌大量出现，并可借助质粒、整合子等可移动元件跨种属传播耐药基因[16]，而耐药菌又可通过动物性食品生产链传播给相关工作人员或通过食品商品传播给消费者，严重影响食品卫生与安全[17]。大肠杆菌是广泛存在于人体肠道与畜禽养殖环境中的一种条件致病菌，同时也是极为重要的耐药基因“储存库”[18]。本研究在浙江省湖州、嘉兴、绍兴三市共分离得到234 株大肠杆菌对磺胺类、四环素有较高的耐药率，其他研究中江苏省鸡源大肠杆菌对复方新诺明与四环素的耐药率为75%与85%，山东省鸡源大肠杆菌对这两类抗生素的耐药率为93.33%与100%，说明复方新诺明与四环素的耐药率在多个地区均处于较高水平，这可能与这两种药物在养殖过程中大量使用有关。在3市中，嘉兴市分离株对美罗培南的耐药率最高，为17.63%，而其他研究中湖南省养殖场分离的大肠杆菌对美罗培南的耐药率为0%[19]，在新疆分离的鸡源大肠杆菌对美罗培楠的耐药率为85.71%[20]，这表明美罗培南的耐药率在各地差异较大，这可能与养殖过程中的用药量差异有关。本研究中3市大肠杆菌分离株对环丙沙星的耐药率均在20%以上，且嘉兴市最高，超过了40%，而其他研究中从某养殖场分离的大肠杆菌对氟喹诺酮类抗生素的耐药率均在40%以上[21]，从江苏泰州地区分离的大肠杆菌对环丙沙星的耐药率为51.9%[22]，从腹泻猪源分离的大肠杆菌对氟喹诺酮类抗生素的耐药率达到了60%[23]，表明全国范围内不同地区间大肠杆菌对氟喹诺酮类抗生素存在不同程度的耐药性，而我国于2016 年禁用了4 种喹诺酮类药物在养殖业中使用，说明氟喹诺酮类抗生素耐药基因已广泛传播。

本研究中四环素类耐药基因tet（A）与磺胺类耐药基因sul1 的总体检出率较高，tet（B）在嘉兴市检出率较高，而sul2 在绍兴市检出率较高，与表型结果相一致，嘉兴市大肠杆菌分离株中的耐药基因与可移动元件的共现网络分析表明，四环素耐药基因与磺胺类耐药基因是嘉兴市肉鸡养殖场中非常重要的耐药基因，处于共现网络的中心，能与其它多种耐药基因发生共传递。其它研究中，在贵州地区分离的猪源大肠杆菌中tet（A）的检出率为92.6%，tet（B）为41.5%[24]；在河南地区分离的猪源大肠杆菌tet（A）的检出率为87.1%，tet（B）为0%[25]；而在唐山及秦皇岛地区分离的鸡源大肠杆菌tet（A）的检出率为86.4%，tet（B）为81.8%[26]。tet（A）在全国畜禽源大肠杆菌的检出率均处于较高的水平，tet（B）的检出率则有着明显的地域性差异，随着耐药基因的不断传播，tet（B）在各地的检出率仍有提高的风险。除此之外，β-内酰胺类耐药基因blaTEM在湖州市大肠杆菌分离株中的检出率达到了91%，嘉兴与绍兴分离株的耐药率分别为78%，62%。对比其它研究中，昆明某养殖场分离的鸡源大肠杆菌blaTEM为77%[27]；采集于河南某养殖场中的猪源大肠杆菌blaTEM检出率为77%[28]；分离自上海地区的猪源大肠杆菌blaTEM的检出率为88.5%[29]；分离自山东莱西的鸡源大肠杆菌blaTEM的检出率为72%[30]。blaTEM可介导ESBLs 的产生，且TEM 型酶有115 种，是目前数量最多的ESBLs[31]，由此对青霉素类、头孢菌素及单环酰胺类抗生素产生耐药性[32]，给临床治疗带来了巨大威胁。而共现网络分析表明，blaTEM与磷霉素耐药基因fosA有较高的共转移频率，有研究报道fosA3 常通过质粒与ESBLs 基因共转移，且与IS26 相关，这与本研究结果相一致。而磷霉素可用于对产ESBLs大肠杆菌的治疗[33]，但随着这两种基因的共转移，产ESBLs 大肠杆菌对磷霉素耐药率不断提高，大大削弱了磷霉素对其的治疗效果。

4 结论

本研究从720 份肉鸡源样品中分离鉴定出234 株大肠杆菌，通过对表型与基因型的鉴定，发现大肠杆菌对养殖过程中常用的四环素、磺胺类、头孢类抗生素具有较高的耐药率，tet（A）、sul1、blaTEM、mph（A）、aadA1 在3 市中均有较高的检出率。对整体耐药情况比较严重的嘉兴市分离株大肠杆菌的共现网络分析表明，qnrA-mph（A）、fos-A-sul1、fosA-blaTEM，sul2-aadA1 这4 组耐药基因存在较高的耐药频率，需要对这7 种耐药基因进行重点监测。本研究对保障动物性食品安全，控制耐药性传播提供了理论依据。