CRISPR 相关技术在肉牛领域的研究进展

吴天弋，党靖宇，王添祯，张路培，高 雪，李俊雅，徐凌洋*

（1.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，北京 100091；2.富平县畜牧发展中心，陕西渭南 711700）

基因编辑技术是指使用分子生物学手段对目标基因进行删除、插入和替换等操作的生物工程技术[1,2]。在其发展过程中，最重要的成果就是各种基因组编辑器的发现和开发。其中又以锌指核酸酶（Zinc-Finger Nucleases，ZFN）、类转录激活因子效应物核酸酶（Transcription Activator-Like Endonucleases，TALEN）和成簇而规律的间隔短回文重复序列（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats，CRISPR）[3]三个系统最为成熟。但是，与基于蛋白-核酸结合的ZFN和TALEN 基因组编辑器不同，CRISPR 是最新被发现、开发的一种基于碱基互补规则的基因组编辑器，这使得CRISPR 系统相比前两者具有更简便的设计和使用步骤，这一系统的发现极大的促进了基因编辑技术的发展。

如今CRISPR 已经在疾病治疗[4]与动植物育种领域取得较大突破，本文简单回顾CRISPR 技术的开发现状，并就CRISPR 技术在肉牛育种、生产过程中的应用现状与挑战进行阐述。

1 基于碱基配对的基因编辑器：CRISPR/Cas9

成簇而规律间隔的短回文重复序列（CRISPR）系统是在细菌和古生菌内天然存在的免疫系统，能够保护其免受外源DNA 的入侵[5]。早在1987年，Nakata 和他的团队就在E.coli 基因组中发现了这种特别的重复结构[6]，每2 个重复序列间被独特的间隔序列所分隔，因此将这种结构命名为成簇而规律间隔的短回文重复序列（CRISPR）。2007 年，人们在嗜热葡萄球菌中发现CRISPR 中间独特的间隔序列来自于噬菌体的攻击，细菌可以通过将噬菌体基因组DNA 添加到CRISPR 序列中，再配合 CRISPR 相关核酸内切酶（CRISPR-Associated Endonuclease，Cas）蛋白形成对特定噬菌体的抗性[7]。如今我们常用的CRISPR/Cas9 系统，来自于对一种II 型CRISPR系统的改造，该系统来自化脓链球菌（Streptococcus pyogenes），由CRISPR 特异性决定RNA（crRNA）、辅助反式激活crRNA（tracrRNA）和核酸酶Cas9 组成[8]。crRNA/tracrRNA 复合物引导核酸酶Cas9 在crRNA 配对的DNA 序列靶位点触发双链断裂（Double-Strand Break，DSB），进一步的研究通过将crRNA 和tracrRNA 连接融合，形成单引导RNA（Single guide RNA，sgRNA）介导的CRISPR/Cas9 酶切体系，进一步简化了该工具的使用步骤[9]。

成簇而规律间隔的短回文重复序列/ 相关核酸内切酶9（CRISPR/Cas9）系统要求的靶位点都有一个重要的共同特征，即原间隔物相邻序列（Protospacer Adjacent Motif，PAM），而其原本作用是细菌的自我识别，由于细菌CRISPR 阵列中不含有PAM，从而避免了CRISPR/Cas9 系统对自身的剪切，一个典型的PAM 是5’-NGG-3’[9]。通过设计sgRNA，CRISPR/Cas9 系统可以靶向任意紧邻PAM 的一段20 个核苷酸序列，并且允许同时靶向多个基因组位点[8]，研究人员甚至可以快速设计大量sgRNA 进行高通量敲除和基因筛选[10]。目前，CRISPR/Cas9 载体可以通过商业市场简单获取，通过设计特异性引导RNA（gRNA）序列并导入能生产sgRNA 的质粒后即可使用。对于合子阶段的基因组编辑，CRISPR/Cas9 展现了与TALEN 一样高有效性[11]，这让CRISPR/Cas9载体的细胞质显微注射（Cytoplasmic Microinjection，CMI）得到了广泛的运用，研究显示通过在合子阶段进行CMI 足以导致大多数（约2/3）出生的后代具有靶基因座的双等位基因修饰[12]，这使得研究者可以绕过培养、筛选编辑成功的细胞，以及体细胞核移植（Somatic Cell Nuclear Transfer，SCNT）的步骤，极大的简化了生产基因编辑动物的实验流程。

2 CRISPR/Cas9 系统的发展

成簇而规律间隔的短回文重复序列/ 相关核酸内切酶9（CRISPR/Cas9）系统自首次发布至今已有近10 年的时间了，人们也在开发应用过程中发现了其存在的不足之处，包括原始的Cas9蛋白介导的基因切割效率低、碱基失配导致的非靶标位置切割、sgRNA 设计时需要寻找特定PAM 序列等，并通过各种技术策略做出相应的改进。

2.1 提高编辑效率

核酸酶对细胞基因组的编辑需要进入细胞核发挥作用，因此为Cas9 蛋白添加核定位序列（NLS）可以优化其工作效率[8]，这在如今的商业化质粒中非常常见。又因包括CRISPR/Cas9 在内的基因编辑工具本身只能产生DSB，后续都需要借助细胞自生的DNA 修复机制产生非同源末端接 合（Non-Homologous End Junctions，NHEJ）和同源定向修复（Homologous Directed Repair，HDR/HR）[2]，其中HDR 能为细胞引入受控的突变，因而价值更大[13]。但是受限于HDR 的效率问题，实际试验的成功率并不是很高。目前，已有研究证明添加NHEJ 抑制剂SCR7[14]，能有效提高了HDR 效率。另外，由于HDR 发生在细胞周期的S 期和G2 期，在另一项研究中，通过多种药物控制细胞周期[15]，显著提高了HDR 比例，其中诺考达唑（nocodazole）效果最佳。也有研究通过siRNA 或shRNA 介导基因沉默下调NHEJ，从而间接提高HDR 效率[16]。此外，使用包含单链DNA 的特殊不对称模板[17]、化学修饰的sgRNA[18]和一些小分子化合物也可以刺激HDR[19]。

由于染色质开放程度的不同，基因编辑效率也有显著差异，Liu 等[20]的研究发现HDACI/II/III抑制剂恩替诺他（entinostat）使基因编辑频率增加了3.7 倍，而泛HDAC 抑制剂帕比诺他（panobinostat）使效率增加了10.5 倍。

成簇而规律间隔的短回文重复序列/ 相关核酸内切酶9（CRISPR/Cas9）的另一个常见缺点是它的gRNA 设计总是需要紧贴着PAM，这极大的限制了其应用范围。后来通过对Cas9 蛋白进行修饰，分别开发出了5′-NNG-3′[21]和几乎无特定PAM 需求[22]的Cas9 蛋白，并证明修饰过的Cas9蛋白与原版有着相似的编辑效率，很好的解决了这一缺点。当然，在实际应用过程中，由于CRISPR/Cas9 目前仍然没有完全解决脱靶问题，因此选择适当的PAM 序列也能够提高编辑的精确性，减少碱基错配导致的脱靶事件。

2.2 提高编辑准确率

脱靶，也即在非目标位置引入了计划外的基因编辑，是CRISPR 系统最被关注的问题，因此研究人员通过很多办法来提高这个工具的靶向特异性[23]。比如通过对Cas9 蛋白结构进行合理设计，他们开发了eSpCas 9（1.1）[24]、SpCas 9-HF 1[25]、HeFSpCas 9[26]和HypaCas 9[27]等多种具有更高靶向特异性的酶。

另外，配对酶切是增加靶向特异性的方法。Shen 等[28]设计了一种Nickase Cas9（nCas9），这使得每个gRNA 只能产生一个对应的DNA 单链断 裂（Single-Strand Break，SSB），每次完成DSB 需要一对临近的gRNA 共同引导，有效避免了脱靶编辑，后发现使用nCas9 可提高6 倍HDR插入效率[29]。也有研究将FokI 内切酶连接到酶切活性失活的Cas9（dCas9）上，由于该酶在切割前必须二聚，相比普通Cas9，其靶向特异性提高了140 倍[30,31]。另有研究发现，使用截短的gRNA（16～19nt）也能进一步降低Cas9 的脱靶概率进而提高其靶向特异性[32,33]。而使用更短的gRNA（<16 nt）（论文中称为dead-RNAs，dRNAs）允许其仅引导Cas9 蛋白结合脱靶位点但不进行切割，这可以有效保护这些容易出错的位点[33]。

同时，通过开发和应用如SeqMap[34]、Cas-OFFinder[35]和sgRNAcas9[36]等脱靶预测软件也可以减少潜在的脱靶位点，进而挑选出最佳的gRNA 序列，帮助降低试验中出现脱靶的概率。

2.3 拓展编辑器功能

Komor 等[37]通过将胞苷脱氨酶与dCas9 工程化融合首次实现在不引入DSB 的前提下完成靶向的C>T 或G>A 转换，该系统被称为碱基编辑（Base Editing，BE）。根据不同碱基修饰酶，BE可分为胞嘧啶碱基编辑器（Cytosine base editor，CBE）和腺嘌呤碱基编辑器（Adenine base editor，ABE）[38]，分别完成C-G>T-A 或A-T>G-C 的转换。最新的研究更是成功开发了一种C>G 的碱基编辑器CGBE1 及其小型化版本miniCGBE1，受控颠换突变（C>G）现在也是可能的[39]。

2019 年，一种名为先导编辑（Primer Editor，PE）的新型基因编辑方式被开发[40]，这是一种基于CRISPR/Cas9 的基因编辑方式，Andrew[41]通过将nCas9 蛋白与反转录酶融合，赋予该系统在靶位点切口处基于给定的RNA 模板延伸切口后端DNA 链的能力。后续通过细胞自身的修复能力将新的DNA 链替换入基因组。通过合理设计反转录模板链，该技术几乎可以在基因组的任意位置进行1～30bp 长度的碱基编辑，这极大地拓展了对基因组中短片段的基因编辑能力，较好的解决了碱基编辑器编辑种类固定和编辑位置限制的问题。

3 CRISPR 在肉牛育种研究领域中的应用

传统家畜育种的主要方法包括杂交育种和选择性育种。当下几乎所有牲畜都是通过杂交和长期选择培育出来的[42]。与传统育种不同，基因编辑育种可以在生物基因组中人为选定精确位点，直接删除、修改或插入关键调控基因，从而快速培育出具有特定性状的家畜新种质。与过去的基因编辑技术相比，CRISPR 技术可以有效避免重复而困难的蛋白设计、提纯操作，是用于家畜遗传改良的更有效工具[43]。近些年，研究者们已经利用CRISPR 技术在家畜领域中取得了许多突破性的进展[44]。

3.1 抵抗疾病

动物传染病是严重影响世界畜牧业发展的重要因素Gao 等[45]使用基于nCas9 的HDR 技术将牛的NRAMP1 基因构建到了牛的F-A 基因座上，使该基因原位过表达，显著提升转基因牛对牛分枝杆菌（Mycobacterium bovis）的抗病能力。Yuan 等[46]使用CRISPR/Cas9 结合HMEJ 的方法在牛的ROSA26 基因座中插入NRAMP1 基因，同样获得了有结核病抗性的牛。

3.2 提高产量

成簇而规律间隔的短回文重复序列/ 相关核酸内切酶9（CRISPR/Cas9）技术已被应用于改善肉牛的产肉能力[47]。肌肉生长抑制素（MSTN，或GDF-8）是在牛的双肌性状中被发现的一个关键基因，其被证明能有效抑制肌肉生长[48]。通过CRISPR/Cas9 敲除MSTN 能提高包括肉牛在内的多种畜禽的产肉性能[49-51]。

3.3 改善动物福利

在肉牛的养殖过程中，犊牛经常被人工去角，以便减少争斗和被更好的管理，然而去角的过程通常违背动物福利原则，因而开展无角牛的育种具有很大的应用前景。目前牛角形成的机制尚不清楚。有研究表明，polled 基因座上的基因突变与牛角形成密切相关，并且目前已知4 种诱发无角等位基因的变体，分别为：蒙古无角（PM）[52]、瓜拉尼无角（PG）[53]、弗里斯兰无角（PF）和凯尔特无角（PC）[54,55]。Carlson 等[56]使用TALENs 技术将PC突变引入牛基因组中，成功获得无角牛。然而Hennig 等[57]通过CRISPR/Cas9 敲除polled 基因座中PC突变的关键序列，以期获得无角牛，但即使是双等位基因敲除也没有成功，这表明polled 基因座中的部分序列缺失并不一定能导致无角表型。因此仍然需要进一步针对无角表型的成因进行研究。

3.4 提高DNA/RNA 鉴定精确性

聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction，PCR）一直是基于DNA 的标准鉴定技术，但是在实际生产中，因为步骤繁琐、仪器限制而难以推广。CRISPR 技术可以提供一种37℃恒温孵育的基于碱基配对的核酸鉴定方法。CRISPRCas13a 是II 型CRISPR 系统中唯一能够切割RNA 的蛋白，Yao 等[58]使用CRISPR-Cas13a 技术开发了灵敏、特异且简单的牛病毒性腹泻病毒（Bovine Viral Diarrhea Virus，BVDV）检测方法，该方法是将待测样品溶液与反应液的混合液置于37℃孵育后使用仪器检测荧光亮度，其30min 检测灵敏度达到了1nmol/L，可以帮助用户快速检测特定病原体。另一种方法是将重组酶聚合酶扩增技术（RPA）与CRISPR 系统相结合，从而极大提高检测灵敏度与准确性。RPA 是一种由Piepenburg 等[59]在2006 年开发的相对较新的等温扩增技术，可以37℃恒温下用不到30min 的时间扩增各种生物体中的RNA 和DNA 靶标[60]。CRISPR 系统可以通过基于碱基配对的特异性切割对RPA 扩增产物进行二次验证，大幅降低由引物错配导致的假阳性出现。在植物领域中已经开发了多种基于CRISPR/Cas12a 与RPA 结合的用于现场检测方法，可检测样品中是否含有病原体[61]或转基因[62]的DNA 片段。在动物领域也有相关研究成果，Huang 等[63]使用该技术在37℃恒温下45min 内完成羊奶粉中的牛奶掺假检测，并且灵敏度达到1%，对基因组的绝对灵敏度为10-2ng/μL，并使用这一技术检测购买的55 份羊奶粉样品，共发现15 份样品存在牛奶掺假。龙翠钰[64]使用类似技术开发了猪瘟病毒（Classical Swine Fever Virus，CSFV）的核酸检测方法，该方法仅需37℃反应30min，即可通过在蓝光下观察肉眼可见的荧光判断阳性样品，其灵敏度极好，即使模板拷贝数低至7×100拷贝数时，仍能检测出目的核酸。上述方法能快速、准确地鉴定目标DNA 和RNA，囊括了绝大多数生物材料的鉴定需求，未来应用前景十分广阔。

4 CRISPR 技术的应用展望

如今CRISPR 技术已经在改善牛的抗病、动物福利和牛肉产量等方面取得多方面的卓越成果。与以前的基因编辑技术相比，CRISPR 编辑系统可以显著提高家畜育种的效率和准确性，但是仍然需要发现更多的高价值基因编辑位点，才能进一步开发CRISPR 编辑系统在基因育种中的巨大潜力。首先，在无角牛的育种中，尚未明确解析无角牛的形成机制，导致已有的成功案例无法简单复制到其他牛品种中[57]，因此探索牛无角表型的分子机制，为无角牛编辑找到更有效的基因位点是无角牛育种中的重要工作。其次，在当今肉牛育种中，其生长和胴体性状是两类关键性状，但目前对调控这些性状的分子机制仍然缺乏研究，通过寻找更多有效的基因或变异位点，能帮助提高肉牛生长速度和胴体品质。再次，对于高品质牛肉的开发，肌内脂肪含量一直是育种工作的重点，但是肌内脂肪的沉积往往伴随大量其他区域的脂肪，显著降低了高品质牛肉的产出速度，提高了消费成本，因此找到调控肌间脂肪沉积的关键基因具有重要意义。最后，衡量肉牛经济价值的另一个重要指标是饲料转换率，饲料在舍饲肉牛养殖成本中占比极高（86%～91%）[65]，因而探索相关基因和变异位点以提高饲料转化率能显著降低饲养成本。

已有的研究表明CRISPR/Cas12a 与Cas13a 蛋白在细胞外能在对应的crRNA 引导下分别靶向与非靶向地切割目标及其附近的DNA（Cas12a）[64]或RNA（Cas13a）[58]。将这一特性应用于现场核酸检测能实现便捷、精准且高灵敏度的快速检测，比如快速检测牛肉中的其他肉类混合，或者在牛的血液中检测各种可能的病原微生物，这将极大地降低生物样品的检测门槛。应当进一步完善相关技术的开发，在保持可靠性的同时降低核酸检测的试验门槛与使用价格，才能让这一技术真正服务于生产。

但是CRISPR 技术发展至今仍然有许多缺点需要优化。进一步提高基因编辑的效率仍然是CRISPR 技术的研发重点，Allen 等[66]最新研究发现，通过将敲入位点选择在GAPDH 这样的必需基因的外显子内，并结合特殊设计的质粒载体，实现了90%以上的基因敲入效率，这一技术为特定的基因敲入提供了高效的选择，极大地缩短了基因编辑动物的获取时间。但是与选择在基因间区的“安全港”插入目的基因相比，这一技术因为涉及重要的功能基因，也可能增加其他未知的风险。

降低基因编辑带来的不确定风险同样值得关注，Xin 等[67]研究首先发现在多种CRISPR 系统编辑后的细胞中存在染色体易位、染色体大片段缺失，特别是Cas9 进行的基因编辑中，5.2%的受编辑细胞中产生了外源性DNA 片段（来源于载体）插入，这些不确定性始终是该技术应用于基因编辑动物生产的巨大障碍。目前，解决此障碍的方式有2 种。一是研发具有更高特异性和安全性的核酸酶，例如Cas12f。二是使用无DNA技术进行基因编辑，即直接使用Cas9 蛋白与sgRNA 复合物（RNP）进行编辑，从而排除外源DNA 片段插入的风险。

最后，确保农业转基因产品不会对人类健康或环境造成危害是我国推进基因编辑育种的重要前提。因此基因编辑动物的肉质安全不容忽视，Zhao 等[68]研究结果表明，MSTN 和FGF5 双基因敲除的羊肉对大鼠的健康无影响。同时使用引物延伸介导测序（PEM-seq）和基因组深度测序等技术精确鉴别转基因动物的靶外事件也是这些动物产品流向大众前的重要安全保证。

综上所述，CRISPR 技术在农业育种与核酸检测方面展现了巨大的价值，极大地推动着肉牛领域的研究。我们应当思考如何更好地开发、应用和监管这一技术以加速我国肉牛育种和生产水平的进步。