超快脉冲控制PCR（upPCR）技术及应用*

景 伟 马富强

（1）中国科学技术大学生物医学工程学院（苏州），生命科学与医学部，合肥 230026；2）中国科学院苏州生物医学工程技术研究所，中国科学院生物医学检验技术重点实验室，医药酶工程研究中心，苏州 215163）

分子诊断技术在疾病诊断与治疗中发挥着极为重要的作用，目前广泛应用在传染病、性病、优生优育、司法鉴定、肿瘤、遗传病等多个领域。2019年国内分子诊断市场规模达132.1 亿元，年复合增长率达31.63%，是体外诊断领域种增速最快的细分领域。2020年初新型冠状病毒感染（COVID-19）疫情的爆发更是极大地促进了分子诊断技术的发展［1-4］。据国家卫生健康委员会统计，截至2022年4 月，中国已经完成约115 亿人次的严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）核酸检测。目前中国拥有15.3万的专业技术人员从事核酸检测技术工作，拥有1.3 万家医疗卫生机构可以开展核酸检测，全国二级以上医院几乎都配备核酸检测能力，检测能力达到5 700 万管/d，相比于2020 年3月COVID-19 疫情爆发初期（约126 万管/d）提高了将近50倍。COVID-19疫情极大促进了分子诊断技术的发展和普及，也为分子诊断技术的发展带来了契机［5-6］。

分子诊断技术包括核酸扩增检测、基因测序、基因芯片等［7-10］，其中核酸扩增技术是目前应用最广泛的分子诊断技术［3］。实时荧光定量PCR（qPCR）是最广泛使用的靶核酸检测技术［11-12］，是多种疾病诊断的金标准，目前中国绝大多数SARSCoV-2 核酸检测都是基于该技术平台［13］。qPCR 的发展大致经历了6个阶段（图1）。1986年，美国学者Mullis 等［14］开创了PCR 技术，并由美国Cetus公司开发，推出了第一台PCR 自动化热循环仪，PCR 技术整个扩增流程包括高温变性、低温退火、适温延伸三个步骤［15］，反应步骤简单，逐渐成为生命科学研究领域中最常规的实验方法之一。1988年Saiki等［16］将分离出的耐热型DNA聚合酶（Taq DNA 聚合酶）运用于PCR 技术，实现了PCR 过程自动连续循环，Taq DNA 聚合酶的引入为PCR 的广泛应用带来革命的突破。1993 年Higuchi 等［17］首次采用封闭式检测方式和动态PCR 的方法对目的核酸数量进行定量分析，首次提出了qPCR技术的概念，qPCR利用荧光染料检测每次PCR循环后产物总量，提高了反应自动化水平，实现了从定性到定量的飞跃。1995年美国Perkin Elmer（PE）公司开发出了TaqMan 荧光探针定量技术，荧光探针只与目的序列结合，不受非特异性产物的影响，特异性更高，且定量更准确。Taqman 荧光探针定量技术将qPCR 带入了更广阔的应用空间，是qPCR技 术 的 重 要 里 程 碑［18-19］。1996 年 美 国Applied Biosystems 公司推出全世界首台荧光定量PCR 仪，从而正式使qPCR 技术应用到市场［20］。1999 年，Bert Vogelstein 创造了“数字PCR”［21］，适用于依靠Ct值不能很好分辨的应用领域，实现了对起始样品的绝对定量。到目前为止qPCR仍是中国核酸检测的主流技术和金标准，已具备良好的临床基础，是应用最成熟、市场份额最大的分子诊断技术平台［22］。

Fig.1 The development of PCR nucleic acid amplification technology图1 PCR核酸扩增技术的发展历程

全球COVID-19疫情的爆发使原本在专业实验室开展的核酸检测技术为大众所认知，核酸检测是疫情防控的有效手段，可以尽早发现传染源并从源头上抑制疫情的传播。随着分子诊断的发展和推广，对于家庭自测、社区即时核酸检测的需求也逐渐凸显，但目前进行核酸检测的主要方法仍是集中采样后转运至实验室处理，一般要6~48 h才能出检测结果，无法实现即时、快速检测。若要实现快速社区、居家检测等分子即时检测（point-of-care testing，POCT）应用场景，必须满足检测时间快、设备成本低、操作简便等要求［23-26］。

为实现快速便捷分子POCT，人们围绕检测设备、检测原料和试剂、技术原理等方面进行了不断改进提升，例如在检测设备上节省设定程序、对升降温速度进行改进、优化结果分析的时间等。伯乐的CFX-96 仪器能在55 min 内完成40 循环的升降温，相比于传统热循环仪的1.5 h大大加快了速度；另外，科学家们还从核心酶角度进行了扩增速度及耐热性改进，比如Kapa公司研制的2G Fast taq酶，该酶通过分子进化显著提升了持续合成能力和延伸速度，相比于野生型Taq DNA 聚合酶可以缩短20%~70%的反应时间；在技术原理方面，开发了一系列速度快、操作便捷的等温扩增方法，包括滚环 扩 增 技 术（RCA）［27-28］、重 组 酶 等 温 扩 增（RPA）［29-30］、链代替扩增（SDA）［31］、环介导等温扩增反应（LAMP）等［32-34］，等温扩增技术具有无需昂贵PCR 仪器、速度快（10~60 min 完成反应）等优势，成为分子POCT领域的重要技术，但是相比于传统qPCR技术，等温扩增技术普遍存在不容易进行多重靶标检测、假阳性严重、灵敏度不高等缺点［35］，因此开发速度快、且多重检测和灵敏度等关键性能等指标能够媲美传统qPCR的快速核酸检测技术具有重要的应用价值。

超快脉冲控制PCR（ultra-fast pulse-controlled PCR，upPCR）是近年来开发出来的分子诊断新技术，是传统qPCR技术的延伸和升级，该技术在保留传统荧光定量PCR 高灵敏度、高特异性和多重检测等优势的基础上，还具有超快速、设备简单、能耗低等新优势，非常适合分子POCT。自从21世纪初被发明以来，upPCR 技术经过一系列迭代升级，在加热源、光热纳米粒子、升降温方式上都经历了一系列发展和完善。2008 年Stehr 等［36］使用DNA 结合的金纳米棒聚集体作为光吸收剂，将300 ns激光脉冲的光能局部转换为热能，在微秒时间尺度上熔化双链DNA，奠定了纳米金作为upPCR 的核心加热材料的地位。2012 年，Roche等［37］使用金纳米球作为光热纳米材料，结合相关配套设备的开发，首次建立了upPCR 技术。2017年GNA Biosolutions GmbH 公司［38］开发出商业化的upPCR产品，设备到目前为止已经过多代更新，形成较为成熟的产品体系。此外还有ROVER diagnostics公司也推出LightSpeed系统［39］，该技术展示出广阔的应用前景。

upPCR 通过向反应体系中引入能够快速进行光热/电热转换的纳米材料（例如纳米金），从而大幅度提升了反应体系的温度变化速度，例如，通过脉冲控制激光或LED 灯加热溶液中的纳米材料，能够在毫秒时间实现溶液微环境的快速升温，停止加热后通过环境溶液对微环境进行快速降温，该方法的升降温速度远远高于传统热循环仪的加热模块的升降温度速度，因此可以在15 min 以内完成整个检测反应。以GNA Biosolutions 公司开发的upPCR 技术为例（图2），将含有模板DNA 的溶液加入到upPCR 混合溶液，PCR 混合溶液中的金纳米粒子被目标特异性引物功能化，反应体系在脉冲控制扩增仪中，当高功率的激光束通过快速脉冲对反应体系进行照射时，由于激光波长和金纳米粒子的等离子体吸收特性相匹配，胶体金纳米粒子的激光照射能够对均匀分散的纳米粒子进行微秒级超快速局部加热，使纳米粒子周围溶液温度迅速上升，导致DNA 双链变性解链，当停止激光照射时，反应的主体溶液可作为内置冷却容器对反应微环境进行迅速冷却，单链模板DNA 与金纳米颗粒上的特异性引物退火，在DNA 聚合酶的作用下延伸，生成新的DNA 双链。经过多次循环，最终实现模板DNA 的大量扩增和检测。在该技术体系中，由于激光以短脉冲（微秒级）加热纳米粒子（皮摩尔浓度），并将热循环限制在以纳米粒子为核心的反应微环境中，因而只对小部分反应体积进行升降温，主体反应温度基本不变，从而可实现超快的加热和冷却循环［38］。upPCR技术的单个变性-扩增循环仅需1.5~5 s，远低于传统PCR 所需的时间（约90 s/循环），从而能够在15 min以内完成扩增检测。

Fig.2 Principle of ultrafast pulse-controlled PCR amplification图2 超快脉冲控制PCR扩增原理

upPCR技术开发的设备重量轻，能耗低，可由电池供电，便携且易于使用，灵敏度与传统qPCR相当，同样支持多重靶标检测，可以在很短的时间内提供具有高灵敏度和特异性的结果。基于此，upPCR 可以在实验室外快速检测传染原［40］，在家庭自检和社区快检等分子POCT场景中具有重大应用潜力。本文介绍了upPCR 技术的最新进展，对近年来upPCR 技术的原理、核心原料、仪器设备的发展情况进行综述，并讨论了该技术的发展趋势和应用前景。

1 upPCR技术的发展

与普通qPCR 相比，upPCR 技术通过引入纳米金辅助加热。金纳米粒子在PCR 中的应用研究可追溯至2005 年，上海交通大学与中国科学院应用物理所［41-42］首次报道了金纳米粒子对于PCR 体系的提升作用，该方法通过引入金纳米粒子从而有效抑制了PCR 中的非特异性反应，显著提升了PCR技术的性能。同年，Li 等［43］通过将0.7 nmol/L 的13 nm 金纳米粒子添加到PCR 试剂中并与不同的PCR 系统比较，结果显示金纳米粒子可用于提高PCR 效率和缩短反应时间。2012 年，Roche 等［37］将金纳米球作为光热纳米材料引入PCR 体系，结合相关配套设备的开发，将商业热循环器中使用的微升体积减少到纳升或皮升体积，首次建立了upPCR 技 术。2017 年GNA Biosolutions GmbH 公司［38］将金纳米颗粒与引物偶联，通过高功率激光束快速脉冲选择性和特异性地照射金纳米颗粒，从而实现反应微环境局部加热，和环境溶液快速降温，开发出了商业化的脉冲控制PCR产品。

纳米金的光热效应主要依靠其对不同特定波长的光的强烈吸收，通过非辐射弛豫途径将光能转化为热能。金纳米粒子对激光脉冲能量的吸收分为三个步骤：电子吸收、电子-声子热化、外部热扩散［44-46］。原理如图3所示：激光照射时，在共振波长的激发下，在粒子表面形成的极化电荷导致振荡偶极子，表现出增强的吸收和散射截面。共振相对于波长的位置由颗粒的大小和几何形状决定。振荡偶极子的共振能量通过欧姆加热损失分散到周围介质。释放的能量可用于快速加热溶液，其中每个颗粒成为加热元件。停止激光照射后，具有高导热性的金纳米颗粒可以借助周围溶液快速冷却。通过打开或关闭激发光，可以实现在金纳米颗粒表面上快速加热和冷却。因此，使用该方法可以在几分钟内实现具有高加热和冷却速率的超快PCR。应用纳米材料的光热效应优点是可以很容易地控制溶液的加热和冷却，进而控制溶液中DNA 的变性和扩增［37］。

Fig.3 Schematic diagram of photothermal effects of gold nanoparticles图3 金纳米粒子光热效应原理图

金纳米粒子可以使用各种技术灵活合成，得到所需的形状和大小［47-51］，其中金纳米球、金纳米棒和金双锥体等是upPCR 中常用形状［52-53］，相较于其他贵金属，金纳米粒子有其独特优势［44，54-56］，包括：a.金纳米粒子具有较高的表面等离子体吸收和高光散射能力，在短时间内可迅速升温，使其在upPCR 技术中得到广泛应用［57-60］；b.金纳米粒子可通过调整金尺寸和形状，导致其从可见光调谐到近红外光（NIR）的共振，由于组织在NIR范围内的吸收性较低，因此它非常适合生物学应用；c.金纳米粒子表面可以简单地进行修饰，允许用各种化合物对金纳米粒子进行功能化，例如DNA、抗体、蛋白质、碳水化合物、脂质等；d.金纳米粒子的氧化作用很弱，生物相容性高，无细胞毒性，兼容多种生化、分子和细胞实验。

不同形状的金纳米粒子具有不同的光学性能。a.金纳米薄膜可快速吸光强光，使其表面电子激发到更高的能量状态并产生热电子，从而对PCR 溶液进行加热。b.金纳米球比表面积高，负载量高，易于表面功能化，在upPCR 中可通过与特异性引物偶联实现溶液局部加热，并通过主体溶液实现冷却。c.金纳米棒比金纳米球具有更为独特的光电性质，在近红外区对光的吸收和散射能力都很强，可快速吸收光源实现加热，另外金纳米棒还具有合成方法简单、化学性质稳定等优点。d.金双锥体具有更高的吸光度系数，尺寸分布更均匀，这使得它们更有效地吸收入射光，此外，金双锥体具有更高的光热转换效率，可以进一步提高入射光的利用率。近年来，科学家们将不同形状的金纳米粒子应用于PCR 反应体系中，结合引物偶联、光加热、脉冲控制等辅助手段，形成了具有不同性能的upPCR体系，下文将对这些体系进行了归纳和讨论。

第一，树立和坚持正确的历史观，坚持历史唯物主义，反对历史虚无主义。要尊重历史，明确“中国的今天是从中国的昨天和前天发展而来的”[注]习近平：《牢记历史经验历史教训历史警示 为国家治理能力现代化提供有益借鉴》，《人民日报》2014年10月14日，第1版。。近年来,历史虚无主义沉渣泛起。历史虚无主义否定中华民族的历史贡献，扭曲中国共产党带领中国人民进行革命、改革、建设的历史，消解中华民族的民族凝聚力，动摇中国人民的爱国主义信念，为害甚大，不容轻忽。为此，必须要引导人们树立和坚持正确的历史观。深入挖掘历史上的爱国主义精神，传承中华民族爱国主义优良传统。

1.1 基于金纳米膜的upPCR技术

2015 年，Son 等［61］开发了一种基于金纳米膜的upPCR 技术，基于金纳米膜作为光热转换器的光子PCR 使用LED 作为激发光。当LED 照射金纳米膜时，金纳米膜会发生对等离子体辅助的强光吸收，导致等离子体表面附近的电子激发到更高的能量状态，在100 fs内产生热电子。热电子可以迅速扩散到整个金属薄膜，从而形成平衡且均匀的温度场。当关闭LED 灯后，加热后的溶液可通过散热风扇和高导热率的金薄膜散热，从而实现快速热循环。反应加热速率约为12.8℃/s，冷却速率为6.6℃/s，可在5 min内完成30个超快热循环。但单层金纳米薄膜层技术的热扩散引起的PCR 溶液温度均匀性差，导致扩散效率相对较低，2016年Son等［62］通过引入两个平行的金纳米膜形成3D PCR室，解决了仅一侧加热导致溶液温度均匀性差及用于温度控制的热电偶的可靠定位问题。改进后技术的原理为：LED 的光首先被反射、吸收并传输到底部金纳米薄膜，被底层吸收产生热量，随后透射光被反射、吸收并透射到顶部的金纳米薄膜，反射光经多次反射、吸收和透射并产生热量。相对于单层金纳米薄膜层技术，双层金纳米薄膜层温度变化相对较慢，但精度和稳定性显着提高，灵敏度和可重复性也显著提升，可以实现10 min内完成反应。

1.2 基于金纳米双锥体的upPCR技术

2017 年，Lee 等［63］通过使用具有更高光吸收系数的金双锥体实现了超快热循环。将金双锥体纳米粒子均匀分散在PCR 反应混合物中，溶液的加热与冷却可通过脉冲红外LED（IR-LED）实现，当红外发光二极管照射时，金双锥体作为纳米反应器可以吸收光子能并将其转化为热能，金双锥体吸收光子后，除散热外没有明显的能量损失途径。在热扩散的作用下迅速提高整体溶液的温度，实现DNA 双链的变性。该方法使用的金纳米双锥体允许特定的光激发和热释放，并确保精确均匀的加热，可以在7.5 min内可以完成40个循环，实现更快的热循环，加热过程只是对占比很少的微环境进行加热，但该体系中引物和模板是随机分布在反应体系，大部分的模板并没有被加热，存在靶向性加热不强的问题，理论扩增效率低，如果将纳米金与引物偶联则有望大幅度提升加热和反应效率。

1.3 基于镀金钨丝的upPCR技术

GNA Biosolutions 公司使用成本更低的镀金钨丝（直径15 μm，Au 涂层200 nm）替代纳米金颗粒，开发了一种更为经济的upPCR 方法［40，64］。该体系采用电流而非光能对反应体系进行加热——通过将快速脉冲电压施加到75 根镀金钨丝阵列，仅在每根导线周围的微米级液体层内引起超快速加热，实现溶液局部加热。而剩余的大部分反应体积（超过99%）则保持在用于退火和延伸的基础温度。由于局部加热的方法仅在导线周围的加热层内使双链DNA 变性，该技术对引物进行了局部加热，以提高加热和反应效率。该技术通过Au-S 键将引物固定到镀金钨丝，使其中引物5'端连接到镀金钨丝的表面，3'端在溶液中保持游离，以便于扩增反应。扩增反应的双链DNA 变性步骤只需要热循环总反应体积通常所需的能量的一小部分即可。局部加热使得大部分反应溶液体积可用作镀金钨丝被动冷却过程的冷却容器，在电压脉冲后镀金钨丝通过热扩散在毫秒时间尺度上冷却下来，从而产生超快的热循环。由于直接将引物偶联在纳米金载体上流程复杂，工艺要求高等，GNA Biosolutions 公司通过磁珠与引物结合替代电阻丝直接固定的方式，将引物悬浮在镀金钨丝两侧从而进行局部脉冲加热，实现热循环。磁珠在偶联上具有更高的比表面积和操作更加方便、快捷的优点，该方法每个循环的周期为1.5~5 s，可在14 min内完成扩增。

1.4 基于金纳米棒的upPCR技术

2022 年，ROVER diagnostics 公司推出了一种基于金纳米棒的可多路荧光监测的LightSpeed 系统［39］。金纳米棒对近红外区对光的吸收和散射能力都很强，可快速实现溶液整体加热。该系统将金纳米棒悬浮在0.2 ml PCR 管中的溶液中，将3 个LED 模块同心放置在PCR 管周围并连接到散热器和散热器风扇上，通过带有线热电偶的闭环传感或通过非接触式开环控制来实现温度控制。加热时金纳米棒快速吸收LED 发出的光，由于红外辐射与金纳米棒的电子相互作用产生热量，对溶液整体进行加热，DNA 双链在高温下变性成为单链。停止加热后使用风扇对溶液辅助冷却，目的片段进行退火延伸，从而实现快速循环扩增。该装置在初始温度保持2 min（用于逆转录），变性时间为10 s，可在15 min 内完成45 个快速热循环周期，每周期加热时间为6.7℃/s，降温速度为4.7℃/s。每次退火延伸结束时可通过488 nm 激光和光谱仪设置进行实时荧光检测从样品到结果检出可在30 min 内完成。

随着upPCR 技术的发展，upPCR 形成了不同的性能体系（表1）。在对PCR溶液加热范围方面，可通过将纳米金与引物偶联的方式实现溶液的局部加热，溶液整体温度不变；也可将纳米金直接加入到溶液内对溶液进行整体加热。局部加热靶向性强，升降温速度快，但引物偶联到纳米金的技术复杂，成本较高；而整体加热无需额外的引物偶联，但需要较长的升降温时间。在PCR 溶液的加热方式上，可分为光加热与电加热，电加热成本更低，可控性更强，但需要将电阻丝和反应芯片整合，反应容器制备工艺较复杂，光加热相比于电加热，光源高频通断控制相比电流控制技术难度稍高，但非接触加热方法降低了芯片制造的复杂性，因而适用性高，目前应用更广。

Table 1 Comparison of ultra-fast pulse-controlled PCR experimental technology based on different thermal cycling modes表1 基于不同热循环方式的超快脉冲控制PCR实验技术对比

2 upPCR技术的核心原料

2.1 引物及功能化

upPCR 技术兼容荧光染料法的qPCR 体系，也兼容多重Taqman 探针，在整体加热的upPCR 中，可直接兼容常规qPCR引物，引物无需功能化，而在局部加热的upPCR 技术中，需要将引物与纳米金特异性偶联，使加热温度局限在纳米金表面，从而实现反应的局部化。由于纳米金合成方式不同，导致其表面化学性质不同，进行引物功能化的方式也不同。

金纳米球易于表面修饰并且能与柠檬酸盐离子直接置换，它们可以通过直接吸附未修饰的寡核苷酸或接枝硫醇末端寡核苷酸实现引物功能化［65］。相比之下，金纳米棒由于其表面生长所必需的十六烷基三甲基溴化铵双层，与DNA 的功能化更具有挑战性［66］。金纳米棒功能化主要分三步：第一步用巯基-聚二乙醇-甲氧基（HS-PEG-OMe）部分置换十六烷基三甲基溴化铵分子并转移到有机介质中；第二步用6-巯基己酸对金纳米棒的表面进行改性，通过添加异丙醇使末端羧酸基团电离，并在缓冲介质中再分散；第三步通过电荷筛选进行DNA功能化，洗涤3次后在缓冲液中再分散。对于使用镀金钨丝的upPCR 技术而言，如果在镀金钨丝上直接偶联引物，需要用硫醇修饰的正向引物对镀金钨丝进行功能化，使用多聚A 尾（poly-A-tail）和亚磷酰胺（Int Spacer 9）将硫醇修饰添加到引物的5'端，通过强Au-S 键将引物固定到镀金钨丝实现引物功能化。磁珠与寡核苷酸的偶联有以下几种方法［67-68］：a.共价固定法，典型的共价化学连接键包括形成酰胺键、酯键或者二硫键，通过5'-反应基团-（如5'-氨基-）固定；b.离子或偶极作用，通过离子或偶极相互作用将带负电荷的磷酸主链与部分带正电荷的表面作用，并通过紫外线照射进行交联；c.亲和作用，利用亲和配体相互作用，例如生物素化核酸在亲和素表面的偶联。

2.2 核心酶

upPCR 技术可以将PCR 运行时间从几小时缩短到几分钟，因而对酶的模板亲和力、催化速度等关键性能提出了更高要求。PCR 过程的速度取决于许多因素［45，69］，包括所用聚合酶的延伸率、热循环器的升降温速度和DNA 模板的复杂性等。选择合适的DNA 聚合酶对PCR实验尤为重要，是开展实验前首要考虑的问题。DNA 聚合酶是影响反应速度的重要因素，PCR 体系中最常用的DNA 聚合酶是Taq DNA 聚合酶，Taq DNA 聚合酶具有较好的耐热性，可在PCR高温变性过程中保持活性，在整个PCR 循环中无需多次补加酶［70-72］。但用于常规PCR 的Taq DNA 聚合酶延伸速度较慢，Taq DNA 聚合酶的标准延伸率约为1 kb/min［73］，而upPCR 技术通常需要具有更快的延伸速率的热稳定聚合酶。例如快速Taq DNA 聚合酶，快速Taq DNA 聚合酶在扩增速度、扩增效率、特异性以及酶本身的稳定性都显著优于普通Taq酶，在大幅度缩短反应时间的同时能提高扩增效果。科学家们对Taq DNA 聚合酶进行了一系列提升反应速度的酶工程改造，Davidson等［74］通过在Taq DNA聚合酶拇指结构与上插入硫氧还蛋白结构域，将DNA 聚合酶速度提升了20~50倍。Wang等［75］将Taq DNA聚合酶和非序列特异性的dsDNA 结合蛋白Sso7d融合，增强酶和DNA模板结合，将DNA聚合酶速度提升了16 倍。这些快速突变体及其组合有望用于upPCR体系。

当检测靶标是RNA 时，需要通过逆转录酶（reverse transcriptase）将RNA 逆转录为DNA 才能进行PCR 扩增。目前已发现的逆转录酶大多不能耐受高温环境，在PCR 过程中难以保持活性。例从如从克隆有莫洛尼氏鼠白血病病毒逆转录酶基因的大肠杆菌中分离到的莫洛尼鼠白血病病毒（MMLV）逆转录酶和从禽类成骨髓细胞白血病病毒纯化到的禽类成髓细胞病毒（AMV）逆转录酶等。用于PCR 的逆转录酶需要高度耐热性，科学家利用蛋白质工程的方法对MMLV 进行了一系列改造，大幅度提升了稳定性，耐热温度提高到60℃以上，并实现了商品化，如赛默飞公司的SuperScript系列等，在提升热稳定性的同时也提升了逆转录活性和产量。另外从自然界中发现超级耐热的逆转录酶也在开展，例如Moser 等［76］从病毒宏基因组库中分离出一种基于热稳定3173 Pol的先天逆转录酶活性的独特单酶替代品，该酶具有高热稳定性、高灵敏度和特异性。上述这些新酶资源有望运用到upPCR中。

除此之外，upPCR 体系还包括其他核心酶，例如RNase 抑制剂、尿嘧啶DNA 糖基酶（UDG）等。RNase 抑制剂可以减少和控制RNase 的污染，提高转录及翻译的效率，确保RNA 分析结果的准确性。常用的RNase 抑制剂有焦碳酸二乙酯（DEPC）、氧钒核糖核苷复合物（RVC）、异硫氰酸胍和RNA 酶的蛋白质抑制剂（RNasin）等。尿嘧啶DNA 糖基酶（UDG）可与脱氧尿苷三磷酸（dUTP）搭配使用，建立PCR 防污染体系，避免气溶胶污染，提升扩增结果的准确性。

3 upPCR设备体系开发

upPCR 技术需要配备特殊的配套设施，近年来陆续有几家国外公司开发出upPCR 设备，例如GNA Biosolutions 公司开发的一系列脉冲控制设备，Pharos V8、Pharos Micro、GNA Octea 等，Curiosity Diagnostics 公司开发的PCR One 设备及ROVER diagnostics公司开发的LightSpeed设备等。

GNA Biosolutions 公司基于upPCR 技术开发了一系列的设备产品（图4a），第一台设备Pharos 400世界上第一台upPCR仪器，可快速安全的制备样品，超快分析DNA，但由于技术成本等问题并未商业化供应。Pharos V8 是世界上第一台商业化的的upPCR 仪器，Pharos V8 通过利用纳米金将温度循环控制在纳米尺度上，实现溶液局部加热，可在10 min或更短的时间内进行超快实时核酸检测，将PCR 反应时间加快了10 倍，同时仪器具有直观的操作界面和易于使用的软件，并可以远程访问。但目前该平台无法进行实时PCR，只能用于半定量的检测。Pharos Micro 是一台可实时荧光检测的脉冲PCR 设备。两个常规加热块在芯片底部和顶部设置为恒温，通过USB 连接到仪器的平板电脑上使用专用软件进行操作，可以将反应体积保持在65℃的恒温以进行引物的退火和延伸。该设备可以连接到固定实验室中的电源也可以由电池供电以供现场使用。GNA Octea是第一台使用薄箔电加热完成的脉冲扩增PCR仪。GNA Octea通过将磁珠结合的样品悬浮在反应容器的两侧，从而实现局部温度脉冲进行快速热循环。可以在20 min内分析8个样本，包括咽拭子和测试准备的总时间约为40 min，灵敏度为96.7%，特异度为100%，体积小、重量轻、可移动，可以快速、方便地安装和使用。GNA Helios 是一个自动化的样本-结果分子测试系统，目前还未上市，GNA Helios 主要由分析仪和一次性集成测试盒组成。该系统可同时检测9~12种目标病原体，并可在15~30 min 内提供结果。GNA Nano是一种小型化的分子诊断系统，目前正处于研发状态，该系统可用于一次测试一个患者样本，或并行地添加一个基站，可以在10~20 min内提供结果。

Fig.4 Development of equipment for ultra-fast pulse-controlled PCR technology图4 超快脉冲控制PCR技术的设备开发

Curiosity Diagnostics公司基于upPCR技术开发了PCR One系统（图4b），PCR One通过采用IR加热扩增技术，最快可在7 min 内完成40 个热循环。该系统可以在15 min 完成从样本到结果的检测，PCR One 的微流体在单独的微孔中进行每个PCR，并可以对来自患者的原始样本进行多达20 个目标的多重检测，每个靶标可进行3 孔重复。PCR One系统可做到样品进，结果出，适用于快速检测。

哥伦比亚大学Sia 教授和他的团队［39］开发了一种LightSpeed 仪器用于检测新型冠状病毒感染（COVID-19）（图4c），该设备使用金纳米棒粒子将光转化为热，通过冷却风扇实现热循环。LightSpeed 仪器主要由3 个850 nm IR-LED 模块、冷却风扇以及1个用于荧光检测的488 nm激光和分光光度计装置组成。LightSpeed仪器采用了质子纳米粒子热循环和基于荧光测量的光学读数的组合，可以在大约25 min 内完成从样本到结果的实时PCR检测，扩增速度比传统qPCR的快数倍。通过使用该仪器与赛默飞QuantStudio 6 Pro仪器进行的qPCR测试相比，LightSpeed仪器在上具有100%的灵敏度和特异性。LightSpeed仪器设备小巧，大约只有0.91 kg重，仪器的商品成本为1 500美元，每项检测的成本约为5美元，检测成本低，具备较好的便携性，且过程全封闭，适用于分子POCT应用场景。

4 upPCR技术的应用

upPCR 技术由于其检测快速、流程简单、无需提取核酸、可在非实验室环境的现场进行检测等特点，适用于分子POCT现场检测，目前在分子诊断领域具有广阔的应用前景（表2）。

Table 2 Practical application of ultra-fast pulse-controlled PCR technology表2 超快脉冲控制PCR技术的实际应用

2015年Son等［61］通过λ-DNA的扩增验证了基于金纳米膜的upPCR 的方法。通过E-Gel 2%琼脂糖凝胶和SYBR Safe可视化扩增后与台式热循环仪（Bio-Rad C1000）对比发现，upPCR能够有效扩增出目的条带，证明该方法可成功扩增λ-DNA。扩增结果与商用台式热循环仪的扩增结果一致，验证了该系统的实用性和对核酸扩增的适用性。2016年Son等［62］引入两个平行的金纳米膜形成3D PCR室，成功地扩增了从非小细胞肺癌细胞（NSCLC，H1975）制备的c-MET cDNA。该方法可以在4~10 min内完成30个PCR热循环，并可以在15 min内扩增低至2×106拷贝/L的核酸浓度，比传统PCR 的总反应时间减少了70%~85%，显示upPCR 对异质生物样品的实用性。GNA Biosolutions 公司将upPCR 技术用于检测埃博拉病毒［77］，该技术所使用的设备为Pharos 400，通过激光脉冲对所有cDNA立即扩增并实时荧光探针检测。该方法可以检测样品中最低6×107拷贝/L 的埃博拉病毒RNA，为快速诊断埃博拉病毒提供方法。该公司还采用Pharos V8 设备对MRSA（耐甲氧西林金黄色葡萄球菌）的mecA抗性基因进行检测［38］，在100 μl的反应体积中可以检测到从MRSA 基因组DNA 中纯化的10 拷 贝 的mecA。Muller 等［40］使 用Pharos Micro 检测鼠疫杆菌（Yersinia pestis），使用pla基因作为靶标，整个运行可在14 min 内完成。纯化DNA 每次反应的LOD（95%）为434 拷贝，对目标基因的测定可实现较低拷贝数，验证了该技术的有效性。

2021 年Zwirglmaier 等［64］将upPCR 技术用于模式样本检测，开发了一种逆转录upPCR 检测RNA靶标的方法，无需事先提取RNA便可直接从拭子样本中检测SARS-CoV-2。该方法使用的仪器为Pharos Micro，阳性样本可在15 min 内被检测到。整个运行在40 min 内完成，检测限为4.9×106拷贝/L。

2022 年Sia 等［39］通过使用LightSpeed 仪器检测以不同病毒载量掺入人类唾液中的灭活SARSCoV-2 病毒颗粒（BEI Resources），将upPCR 技术应用于临床样本检测。包括RT-PCR热循环的所有步骤在内，该技术平均运行时间为17.9 min。实时设置可以成功检测出低至每毫升4 425个拷贝的病毒浓度。为进一步分析等离子RT-qPCR 的定量能力，该团队测试了包括10个阳性和9个阴性在内的19 个人类唾液样本，将不同病毒检测浓度的Ct值与在实验室PCR 上运行的样本进行了比较，证明了在该仪器中进行定量分析的潜力。该团队还通过测试49 个经鼻收集的人体临床标本（20 个阳性和29 个阴性），在同一管中同时检测到两COVID 目标：N1 和N 基因。并与在基于实验室的PCR 仪器上运行的相同样品的Ct值相比，进一步说明这种方法的多功能性和广泛的适用性。

5 总结与展望

qPCR 由于其快速、高精度、技术成熟、可定量检测等优点牢牢占据着国内外市场，市场应用发展成熟，在疾病筛查领域被广泛使用。且随着技术的发展和进步，中国的qPCR检测仪器、设备及检测试剂已在一定程度上实现国产代替，在未来10年内qPCR 仍将是大型集中检测的主流技术。但qPCR 技术在实验室和非医疗环境中进行基因识别扩增时需要从DNA 样品制备和最终扩增子检测和量化的过程，以及对检测试剂、设备、场地、操作人员要求较高，难以做到大规模快速筛查，也不适合基层医疗机构及家庭检测。

等温扩增技术是一系列恒温分子诊断技术的统称，包括LAMP、RCA、RPA、SDA等，以其设备简单、反应快速等优势，在分子POCT领域崭露头角，以SARS-CoV-2检测为例，国外推出了一系列基于恒温扩增技术的快检产品，包括美国Lucira Health公司开发的Lucira COVID-19一体化试剂盒，Cue Health 公司开发的Cue’s COVID-19 Diagnostic Test，Detect 公司开发的Detect COVID-19 Test 等。已形成几十亿美元的销售额，等温扩增在未来分子POCT场景中具有重大应用潜力，但等温扩增技术目前也存在一系列缺点，比如较难兼容多重检测体系、假阳性较高、试剂稳定性不高（等温扩增大多采用中温酶）、灵敏度不够、试剂常温储存的冻干技术缺乏等。

upPCR 技术在继承了常规qPCR 的兼容多重检测、灵敏度高、试剂稳定性好等优势的基础上，也兼具了等温扩增的反应快速、设备简单等优点，在未来分子POCT 领域中具有很大应用潜力。此外，在转基因检测市场上，常规qPCR检测技术复杂且昂贵，而upPCR 技术操作简单、成本低，可对转基因成分准确定量检测，使其在转基因检测市场上具有较强的竞争力。可以预见，在未来发展中，upPCR及多种等温扩增技术有可能以与qPCR技术以互补的形式存在于市场：qPCR由于其特异性高、检测范围宽、可定量检测等特点，在大型医院、第三方检验机构、科研实验室等大型专业终端场景中仍然长期占据主要市场；而upPCR 及等温扩增技术有望成为家庭自检、社区快检等分子POCT领域中的主要技术。

值得注意的是，upPCR技术目前仍处于技术研发阶段，对扩增过程中所使用的核心酶仍具有改进空间，相较于普通PCR，upPCR 技术检测速度更快，在扩增过程中需要具有热稳定性更高、延伸速率更快的聚合酶。通过对核心酶分子进行改造，提升酶分子的热稳定性及延伸速度对upPCR 技术尤为重要，目前改造酶分子的方式主要是化学修饰法、通过基因工程技术生产酶和通过蛋白质工程技术改造酶。而近年来生物信息学的发展，使得关于酶序列和结构的数据更易获取，通过计算机辅助设计和基于结构信息的分析使得现有的酶分子定向进化技术得到进一步发展，使用计算机辅助联合方法对热稳定聚合酶进行改造将成为upPCR 技术研发的一种新方法。在探针法的upPCR 中，除了要求酶具有很高的延伸速度，还要求酶的5'→3'外切酶结构域能够更快速地切割荧光探针，目前这方面的分子改造仍缺乏报道，因此提升5'→3'外切酶活性是后续对快速Taq DNA 聚合酶进行研发的一个重点方向。除热稳定聚合酶外，逆转录酶的分子改造对提升upPCR 技术的灵敏性和检测速度也至关重要。upPCR 反应过程需要高度耐热性的逆转录酶，如何提高逆转录酶的耐热性，增强逆转录酶与模板的亲和力，也是后续研发的重点内容。除此之外，对局部加热与整体加热、光能加热与电能加热技术的优劣也并未形成定论，对纳米金批量制备技术、引物-纳米金偶联技术，以及超快速核心酶的开发也较为薄弱，因此upPCR 技术离真正的商业化成熟还有较大距离。upPCR技术相应的配套设备的开发也比较少，这使得upPCR 的技术研究缺少必要的硬件工具，也阻碍了该技术的进步。虽然目前国外已经有少数公司推出了upPCR 的商品化解决方案，但在国内关注并研究该技术的机构仍较少，期待随着国内分子诊断技术的进步，未来将会有越来越多的分子POCT新技术被开发出来。