湖北吉富罗非鱼源Ⅰa无乳链球菌毒力分析及药敏特性

杜苏兰，雷连成，3，王玲玲，张付贤，2，4

(1.长江大学动物科学学院，湖北荆州 434025；2.湿地生态与农业利用教育部工程研究中心，湖北荆州 434025；3.吉林大学动物医学学院，长春 130062；4.涝渍灾害与湿地农业湖北省重点实验室，湖北荆州 434025)

罗非鱼(Tilapias)是联合国粮农组织(Food and Agriculture Organization of the United Nations，FAO)向全球推广养殖的鱼类，现养殖范围覆盖100多个国家和地区。但随着规模化养殖模式的大面积推广，再加上养殖水体环境的改变，罗非鱼养殖病害越来越严重，其中以无乳链球菌(Streptococcusagalactiae，Sa)造成的危害最大[1]。无乳链球菌是革兰氏阳性菌，是近年来鱼类链球菌病的主要病原菌之一，该菌可引起多种鱼类如梭鲈(Percafluviatilis)[2]、虹鳟(Oncorhynchusmykiss)[3]、光唇鱼(Acrossocheilusfasciatus)[4]等的脑膜炎和败血症。研究发现，无乳链球菌可导致人类新生儿脑膜炎，存在跨宿主感染人类的潜在风险[5]。2020年农业农村部公告第256号将鱼类链球菌病列为动物二类传染病[6]。该病不但死亡率高，而且死亡和传播速度均极快，给养殖户造成了巨大的经济损失[7]。当前生化药剂和抗菌药品对无乳链球菌的治疗效果不理想，出现多重耐药菌株，给水域环境、水产品安全和公共卫生安全带来威胁。

罗非鱼无乳链球菌主要分布在我国南方地区，如广西、广东、海南等地[8-10]，但随着罗非鱼养殖规模的扩大，罗非鱼无乳链球菌逐渐出现在我国其他地区，因此加强对罗非鱼无乳链球菌的监测和防控，对罗非鱼养殖业健康发展和兽医公共卫生具有重要意义。湖北省2020年罗非鱼养殖量为2 525吨，但对于罗非鱼源无乳链球菌的流行病学调查、血清型、毒力基因、致病性和耐药性以及有效的无抗防控措施尚无系统性的研究。

2021年7月至8月，湖北荆州某养殖场吉富罗非鱼(Genetic Improvement of Farmed Tilapia，GIFT)出现打圈、不食、肛门红肿、眼球突出等症状，且大量死亡。本研究从病鱼脑组织分离到致病菌，通过形态学观察、生理生化鉴定和16S rRNA测序等试验对病原菌进行血清型鉴定、毒力基因筛查和人工感染试验，分析无乳链球菌的致病性，进一步药敏试验分析分离株对抗生素和中药在体外和体内的敏感性和治疗效果，以期为罗非鱼的无乳链球菌感染的精准检测和高效防治提供新的思路和对策。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 培养基、抗菌药物和分子生物学试剂

革兰氏染色剂、胰蛋白胨大豆琼脂(tryptone soy agar，TSA)、胰蛋白胨大豆肉汤(tryptone soy broth，TSB)，购自北京索莱宝生物科技有限公司产品；药敏纸片、细菌微量生化管，购自杭州微生物试剂有限公司产品；2×PCR Mix酶、DL 2000 DNA Marker，购自北京聚合美生物科技有限公司产品；细菌基因组提取试剂盒，购自北京天根生化科技有限公司产品；引物合成及测序委托生工生物工程(上海)股份有限公司进行。

1.1.2 试验用动物及菌种

患病吉富罗非鱼由湖北荆州某水产养殖企业提供，体质量200 g左右。嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila，Ah)、温和气单胞菌(A.sobria，As)、维氏气单胞菌(A.veronii，Av)、无乳链球菌和类志贺邻单胞菌(Plesiomonasshigelloides，Ps)由本实验室分离保存；金黄色葡萄球菌标准菌株(ATCC25923)由本实验室保存。

1.2 病原菌鉴定

1.2.1 病原菌的分离培养

检查记录患病吉富罗非鱼的外观症状，在超净工作台中，用75%的消毒酒精给罗非鱼的体表消毒，在无菌条件下解剖罗非鱼，观察记录内部组织病变情况取病变明显的脑、肾脏和肝组织至无菌PBS中进行匀浆，接种环蘸取组织匀浆液在BHI平板上划线，37 ℃静置培养24 h；观察培养平板上细菌生长情况和菌落形态，挑取典型、优势菌落进行连续传代，革兰氏染色后使用光学显微镜进行镜检观察。

1.2.2 病原菌PCR检测

取患病吉富罗非鱼的肠道、肾脏和脑组织各100 mg，用灭菌研磨器匀浆后，再用PBS稀释，按照细菌基因组DNA提取试剂盒操作说明提取病料DNA；参照文献[11-13]合成各病原菌的特异性引物(表1)；以基因组DNA为模板，分别扩增Ah、As、Av、Ps和Sa的特异基因，PCR产物使用1.0%琼脂糖凝胶进行电泳。

表1 引物序列信息Tab.1 Primer sequence information

1.2.3 生理生化鉴定

将分离菌株接种到BHI液体培养基中，37 ℃摇床培养24 h。将10 μL菌液接种到各个生化管中，37 ℃放置12～36 h后进行生理生化分析。

1.2.4 16S rRNA 基因序列分析

合成细菌16S rRNA通用引物(表1)，以分离菌株基因组DNA为模板，进行PCR扩增。PCR扩增体系(20 μL)：Mix 10 μL，上下游引物各0.5 μL，模板1 μL，ddH2O 8 μL。PCR扩增程序：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性1 min，50 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，共35个循环；72 ℃终延伸10 min。PCR产物使用1.0%琼脂糖凝胶进行电泳，PCR回收产物委托上海生工生物工程有限公司武汉测序部进行测序；测序结果在GeneBank数据库上进行序列比对分析。

1.3 病原菌毒力分析

1.3.1 血清型鉴定

合成无乳链球菌分型引物[14]，采用多重PCR进行血清型鉴定，引物信息见表2。PCR扩增体系(25 μL)：Mix 12.5 μL，1和16号引物400 nmol/L，其余引物250 nmol/L，模板1 μL，ddH2O 补足。PCR扩增程序：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性1 min，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，共35个循环；72 ℃终延伸10 min。PCR产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳。

1.3.2 毒力基因检测

合成无乳链球菌的8种主要毒力基因sodA、cylE、gapC、scpB、hly、rib、bca、bac的引物(表3)[15]，PCR检测分离菌株毒力基因。PCR扩增程序：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性1 min，退火温度见(表3)40 s，72 ℃延伸1 min，共35个循环；72 ℃终延伸10 min。PCR产物使用1.0%琼脂糖凝胶进行电泳。

表3 无乳链球菌毒力基因检测引物Tab.3 The primers of S.agalactiae drug gens

1.3.3 人工感染试验和半数致死量(LD50)测定

选取健康吉富罗非鱼经特定病原体无乳链球菌检测为阴性后，随机分成1个对照组和3个试验组，每组15尾吉富罗非鱼；挑取单菌落接种于BHI液体培养基中，37 ℃振荡培养6 h，离心收集菌体并以无菌生理盐水洗涤三次，平板法测定菌液浓度，以生理盐水重悬制成攻毒细菌悬液。以腹腔注射方式每尾鱼注射100 μL细菌悬液，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组攻毒剂量分别为1.42×105、2.82×105、7.11×105CFU/尾，对照组注射100 μL生理盐水。试验期间持续泵气增氧，水温28 ℃，连续观察7 d，记录各组罗非鱼死亡情况；采用SPSS 25.0(Bliss法)计算攻毒菌株对吉富罗非鱼的LD50，并对感染后具有典型症状的吉富罗非鱼进行病原菌分离和鉴定。

1.4 抗菌药物筛选

1.4.1 药敏试验

以金黄色葡萄球菌标准菌株(ATCC25923)验证药敏试验的有效性；在此基础上选取β-内酰胺类、头孢类、磺胺类、氨基糖苷类、四环素类、大环内酯类、喹诺酮类、氯霉素类、利福霉素类、糖肽类的青霉素、庆大霉素、新霉素、红霉素、丁胺卡那、卡那霉素等36种抗菌药物，参照美国临床和实验室标准研究所(CLSI)制定的抗菌药物敏感性实验执行标准，以Kirb-Bauer(K-B)纸片扩散法测定分离菌株的药物敏感性。

1.4.2 抗菌中药筛选

选取黄连、桑皮、蒲公英等39味中药，打磨成粉，分别制成终浓度为1 g/mL中药药液，过滤除菌，4 ℃保存备用。将菌液均匀涂布到BHI平板上，把空白药敏片放入提前制好的中药药液中，充分浸润，再贴到平板上，37 ℃培养24 h，每种药物重复三次，取平均值。敏感性判定标准[16]：抑菌圈直径>20 mm，为极度敏感；抑菌圈15～20 mm，为高度敏感；抑菌圈直径10～15 mm，为中度敏感；抑菌圈直径<10 mm，为低度敏感；无抑菌圈则为不敏感。选取具有较强抑菌作用的中药，用二倍稀释法测定中药的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)[17]。

1.4.3 中药体内治疗实验

图6、图7分别为实验系统跑车过程中GPS信号失锁后没有BP神经网络辅助的东速和北速以及东速、北速漂移情况,可以看出在GPS信号失锁后的200 s中,东向、北向速度漂移分别最大达到2.3 m/s、1.97 m/s。

实验分为6组：阴性对照组、黄连组、乌梅治疗组、朱砂治疗组、野菊花组和氟苯尼考治疗组。将浓度为1 g/mL的中药药液按质量比1∶2.5拌入饵料中，氟苯尼考按说明书配比(1∶250)拌入饵料中，烘干。每组15尾罗非鱼，腹腔注射细菌悬液，攻毒剂量为3.4×105CFU/尾。攻毒后每天分两次定时投喂，每天投喂饵料量为鱼体重的2%。连续观察7 d，统计各组死亡鱼数；剖检死鱼，确定死亡原因。

2 结果

2.1 病原菌鉴定

2.1.1 病鱼病理特征

患病吉富罗非鱼主要表现为鱼体运动失衡，在水面上转圈打转；体表鳃盖出血、眼球突出、胸鳍出血、肛门红肿溃烂等(图1a)；体内胃囊和肠道无食物，肠道、肝脏、肾脏等器官出血严重(图1b、1c)。

图1 病理特征图Fig.1 Pathological featuresa：患病吉富罗非鱼全身图；b：患病吉富罗非鱼内脏病变；c：患病吉富罗非鱼肠道出血

2.1.2 特定病原菌PCR检测

5种病原菌特异性PCR结果如图2所示，无乳链球菌检测为阳性，其他病原菌检测均为阴性，表明该养殖场吉富罗非鱼的死亡可能与无乳链球菌的感染有关。

图2 病原菌检测Fig.2 Detection of pathogensM：DL2000 DNA Marker；1、4、7、10、13号泳道分别为Ah、As、Av、Ps、Sa阳性样本；2、5、8、11、14号泳道为样本；3、6、9、12、15分别为Ah、As、Av、Ps、Sa阴性样本

2.1.3 形态学观察

蘸取患病罗非鱼病变组织匀浆在BHI固体平板上划线，生长出光滑、圆形、乳白色、不透明的小菌落，直径约1～3 mm(图3a)；在光学显微镜下可见单个、成对或球形短链状，长短不一的革兰氏阳性球菌(图3b)，符合无乳链球菌的基本形态特征。

图3 JZ-202108形态学观察Fig.3 Morphological observation of JZ-202108a：培养基生长形态；b：革兰氏染色镜检(1 000×)

2.1.4 生理生化鉴定

生理生化试验结果如表4所示，分离菌株能利用麦芽糖、葡萄糖、蔗糖和乳糖，不能利用阿拉伯糖、菊糖、木糖和棉子糖，不能水解马尿酸钠，不能发酵山梨醇和甘露醇。分离菌株的生化特性与《伯杰细菌鉴定手册》中无乳链球菌的生化特性一致，表明分离菌株疑似为无乳链球菌。

表4 JZ-202108生理生化结果Tab.4 Physiological and biochemical results of JZ-202108

2.1.5 系统发育树构建

将分离菌株的16S rRNA序列上传至国家微生物科学数据中心,获得序列编号(NMDCN000149D)。在NCBI上比对分析发现,分离菌株与无乳链球菌标准菌株ACC13813的序列相似性达98%;构建发育树发现,分离菌株与链球菌属种类同源性最高,并且与无乳链球菌标准菌株ATCC13813(NR040821.1)亲缘关系较近(图4)，进一步确定分离菌株为罗非鱼无乳链球菌，命名为JZ-202108。

2.2 病原菌毒力分析

2.2.1 血清型鉴定

采用多重PCR方法对分离菌株JZ-202108进行血清型鉴定，结果显示分离株扩增出680和270 bp两个条带(图5)，与无乳链球菌血清型Ⅰa型PCR条带相符，表明JZ-202108为血清型Ⅰa型无乳链球菌。

图5 无乳链球菌血清型鉴定结果Fig.5 Results of serotype identification of S.agalactiaeM：DL2000 DNA Marker；1～3：无乳链球菌分离株；4：阴性对照

2.2.2 毒力基因检测

PCR检测分离菌株的毒力基因，结果如图6所示，分离菌株JZ-202108携带gapC、sodA、bac、bca和hly5种毒力基因，不携带毒力基因scpB、rib、cylE。

图6 8种毒力基因检测Fig.6 PCR detection of eight virulence-related genes in Sa strain JZ-202108M：DL2000 DNA Marker；1：scpB基因；2：scpB基因阴性对照；3：hly基因；4：hly基因阴性对照；5：sodA基因；6：sodA基因阴性对照；7：bac基因；8：bac基因阴性对照；9：rib基因；10：rib基因阴性对照；11：gapC基因；12：gapC基因阴性对照；13：bca基因；14：bca基因阴性对照；15：cylE基因；16：cylE基因阴性对照

2.2.3 人工感染实验和半数致死量(LD50)测定

以不同浓度的菌液分别对健康吉富罗非鱼进行人工感染,感染的罗非鱼出现游动缓慢、摄食减少、打转、翻转等临床症状;与健康组罗非鱼相比,感染组吉富罗非鱼眼球突出,胸鳍、鳃盖不同程度出血(图7a和7c);剖检发现感染组死亡的罗非鱼肝脏肿大、肠壁充血、胆汁呈现淡红色(图7b和7d),与自然发病罗非鱼症状类似。在感染12 h后,Ⅲ组罗非鱼开始死亡,7 d全部死亡;Ⅱ组吉富罗非鱼感染24 h开始死亡,7 d共计死亡6尾;Ⅰ组吉富罗非鱼在感染5 d后,死亡1尾。统计得到JZ-202108菌株对罗非鱼的LD50为3.4×105CFU/尾(表5)。取发病试验鱼的组织,无乳链球菌检测为阳性,并能从病鱼脑部分离出攻毒菌。因此判定JZ-202108菌株是引起此次吉富罗非鱼死亡的病原菌。

图7 分离株感染吉富罗非鱼的症状Fig.7 Symptoms of GIFT infected by isolatesa：空白组外观；b：空白组解剖图(b图所圈为正常罗非鱼的肝脏和胆囊)；c：感染组外观(c图所指为鳃盖出血点和突眼症状)；d：感染组解剖(d图所圈为感染罗非鱼的肝脏和胆囊)

2.3 药物敏感性分析

2.3.1 药敏实验

药物敏感性实验以金黄色葡萄球菌(ATCC25923)作为质控菌株，试验结果在质控规定范围内。如表6所示，分离菌株JZ-202108对青霉素、庆大霉素、新霉素、红霉素、丁胺卡那、卡那霉素、多粘菌素B、呋喃唑酮耐药；对复方新诺林、大观霉素、诺氟沙星中度耐药；对β-内酰胺类、头孢类等药物敏感。

表6 JZ-202108药敏性试验Tab.6 Antimicrobiel susceptible test of the Sa strain JZ-202108

2.3.2 中药药敏实验结果

采用药敏片法对无乳链球菌分离菌株进行中药敏感性分析，如表7所示，在39种中药中，乌梅抑菌圈>20 mm，为极度敏感；黄连抑菌圈为20 mm，为高度敏感；朱砂、野菊花、桑皮、三七抑菌圈10～15 mm，为中度敏感；丁香抑菌圈<8 mm，为低度敏感；其余中药无抑菌圈，为不敏感。选取4种具有较强抗菌作用的中药测试其MIC、MBC，结果显示，乌梅对分离菌株的抑菌作用最好，其MIC为2.0～3.9 mg/mL，MBC为3.9 mg/mL；黄连的MIC为31.25～125 mg/mL，MBC为31.25 mg/mL；朱砂的MIC为31.25～62.5 mg/mL，MBC浓度为62.5 mg/mL；野菊花的MIC为62.5～125 mg/mL，MBC为125 mg/mL。

表7 中药对无乳链球菌的体外抑菌作用Tab.7 Antibacterial effects of Chinese traditional herbs on Sa strains in vitro

2.3.3 中药体内治疗效果

中药对罗非鱼无乳链球菌病的治疗效果结果见图8，在感染7 d后阴性对照组、黄连治疗组、朱砂治疗组、乌梅和野菊花及抗菌药物氟苯尼考治疗组吉富罗非鱼的存活率分别为26%、20%、60%、80%和93%。试验结果表明，中药乌梅和野菊花对罗非鱼的无乳链球菌感染具有较好的治疗效果。

图8 中药治疗后吉富罗非鱼存活率Fig.8 Survival rate of GIFT after traditional Chinese medicine treatment

3 讨论

3.1 无乳链球菌的危害与分离鉴定

无乳链球菌是罗非鱼的主要致病菌之一，中国自2007年起，无乳链球菌病的爆发给罗非鱼养殖区造成了巨大损失[18-19]，严重影响罗非鱼养殖业的经济发展。本研究从患病罗非鱼的组织中分离到优势菌株JZ-202108，经鉴定为无乳链球菌。分离菌株JZ-202108感染可导致罗非鱼出现打转游动、眼球和肛门突出等临床症状，与李永福和袁橙等的报道一致[20-21]。本研究以分离菌株JZ-202108人工感染吉富罗非鱼，其表现症状与临床症状一致，而且成功从人工感染鱼病变组织再分离到攻毒菌株，证实了罗非鱼源无乳链球菌分离菌株JZ-202108是此次湖北荆州某养殖场罗非鱼患病死亡的致病原。根据前期无乳链球菌血清型调查可知，中国罗非鱼源无乳链球菌的分子血清型可分为Ⅰa、Ⅰb和Ⅲ型三种[22]，其中以Ⅰa血清型菌株最为流行。无乳链球菌分离株JZ-202108经鉴定为血清型Ⅰa型，与近年来的我国南方沿海地区流行的罗非鱼无乳链球菌血清型一致。此外，对发病罗非鱼养殖环境调查得知，罗非鱼发病期间天气闷热高温、水质变差是罗非鱼无乳链球菌高发的诱因。因此在罗非鱼养殖中，要加强水质和微生物环境的监测和预警。

3.2 无乳链球菌的致病性分析

细菌的致病过程主要包括黏附-侵袭-免疫逃逸和毒素的分泌等，菌株毒力的强弱与多种毒力因子紧密相关。与已报道的鱼源无乳链球菌相似，菌株JZ-202108携带hly、sodA、bac、bca和gapC5种毒力基因。其中hly编码的透明质酸酶与细菌侵袭有关[23]；sodA编码的超氧化物歧化酶，参与细菌感染宿主后适应宿主的氧化应激[24]；Bca和Bac编码的α、β抗原参与细菌的免疫逃逸；gapC基因编码的3-磷酸甘油醛脱氢酶与无乳链球菌黏附细胞有关。研究发现，无乳链球菌分离株JZ-202108携带人源无乳链球菌特有的毒力基因scpB和广西地区无乳链球菌的cylE基因[25]，表明不同地区，不同宿主来源的无乳链球菌在毒力基因谱和致病机理存在一定差异，有待进一步病原溯源和致病机理的研究。无乳链球菌毒力强弱是由多种毒力因子共同作用，菌株JZ-202108携带的主要毒力基因与罗非鱼源无乳链球菌强毒株GD201008-001具有高度一致性；无乳链球菌分离株JZ-202108的LD50为3.4×105CFU/尾，与已报道的鱼源无乳链球菌的毒力相比[26-27]，无乳链球菌分离株JZ-202108的毒力较强，确认其为Ⅰa型强毒株。药物敏感性试验发现无乳链球菌JZ-202108对氨基糖苷类药物和临床常用药物青霉素、庆大霉素、诺氟沙星、多粘菌素B、呋喃唑酮均表现为耐药，为多重耐药菌株，这与其他研究者从鱼源[28-30]和其他源[31]分离的无乳链球菌的药敏结果均存在差异，这可能与不同宿主来源、地域、养殖环境和养殖者的用药习惯有关。

3.3 无乳链球菌的药物敏感性

本研究发现，乌梅、朱砂、黄连和野菊花在体外对菌株JZ-202108具有较强抑制作用。在无乳链球菌吉富罗非鱼感染模型上的治疗效果显示，乌梅治疗组和野菊花治疗组吉富罗非鱼的存活率虽不及抗菌药物氟苯尼考治疗组，但仍达到了80%的存活率，具有较好的治疗效果。黄连虽然在体外抑菌的效果较好(表7)，但在体内治疗试验中吉富罗非鱼的存活率低于阴性对照组(图8)，这可能与黄连的毒性、药物代谢动力学和药物适口性等因素有关。中药乌梅和野菊花对无乳链球菌JZ-202108在体内和体外均具有较好的杀灭作用和治疗效果，其发挥作用的单体成分和作用机理有待进一步深入研究。因此在开展无乳链球菌感染罗非鱼的治疗时，可考虑氟苯尼考、盐酸多西环素和阿莫西林等抗菌药物和乌梅、野菊花等中药的联合用药，进行综合防控。