斑马鱼chac1基因的表达特征及其在髓系造血中的功能研究

陈紫涵，周 静，王德成，晏 博

(1.三峡大学肿瘤微环境与免疫治疗湖北省重点实验室，三峡大学感染与炎症损伤研究所，三峡大学基础医学院，湖北宜昌 443002；2.上海市(复旦附属)公共卫生临床中心结核病研究中心，上海 201508)

谷胱甘肽是一种含硫醇的三肽，在真核生物中主要以还原型谷胱甘肽(GSH)和氧化型谷胱甘肽(GSSG)的形式存在，其中GSH是真核生物维持和调节组织氧化还原稳态所必需的[1，2]。近年来越来越多的研究聚焦于GSH降解途径[3，4]，以探讨GSH稳态对细胞功能的影响。γ-谷氨酰环转移酶(γ-glutamyl cyclotransferase，γ-GCT，GGCT)是调节抗氧化剂GSH代谢的γ-谷氨酰循环的主要酶之一，其可以催化γ-谷氨酰肽氨基酸分解为5-氧代脯氨酸和游离氨基酸，同时也可以作为GSH限速酶，与γ-谷氨酰半胱氨酸(γ-Glu-Cys)作用从而调节GSH的合成[5]。近年来，还发现了一些新的能降解GSH的酶，2009年在哺乳动物细胞中发现了一种定位于胞质中的新型促凋亡蛋白CHAC1/MGC4504，参与内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ER)的未折叠蛋白反应(unfolded protein reaction，UPR)，位于ATF4-ATF3-CHOP级联通路的下游[6]，随后chac1被证实属于γ-GCT家族，有与γ-GCT家族成员类似的BtrG/γ-GCT折叠，作为一种新型特异性降解GSH的酶，在促凋亡信号传导和氧化还原生物学中发挥着重要作用[7，8]。

随着研究的逐渐深入，发现chac1的表达水平与多种疾病密切相关。chac1基因作为铁死亡标志物和促凋亡诱导因子[9]，在炎症、神经系统氧化应激、动脉病变、实体肿瘤、白血病等疾病的发生或发展中发挥作用[10-16]。有趣的是，近期一项有关凋亡中性粒细胞的代谢组学研究提示，GSH代谢是凋亡中性粒细胞中最易受干扰的代谢途径之一，chac1作为GSH降解酶，在凋亡的中性粒细胞中表达增加[17]。在肺部炎症疾病中，转录组学研究提示chac1可能参与诱导肺泡巨噬细胞(AM)的凋亡，从而加速炎症的消退[18]。这些研究提示了chac1可能与先天免疫细胞的发育及功能相关，但具体机制还不清楚。为进一步探索基于代谢和转录组的先天性免疫细胞功能提供了思路。

有研究显示，在生物早期发育时注射吗啉代反义寡核苷酸(morpholino antisense oligo，MO)下调斑马鱼(Daniorerio)chac1的表达[19]，发现chac1敲除胚胎致死率较高，提示chac1可能在斑马鱼早期发育中所必需，但其在斑马鱼胚胎和组织中的表达特征及在早期造血发育中扮演的角色仍不明确。本研究运用CRISPR/Cas9技术敲除斑马鱼chac1基因，并通过苏丹黑B染色、qRT-PCR检测髓系造血发育过程中关键转录因子的表达情况，以期了解chac1基因在早期造血发育过程中可能的作用，从而为相关疾病治疗提供新的思路和参考。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及仪器

RNAiso Plus购自Takara(9109)，HiScript®Ⅲ RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司(R323-01)，Hieff UNICON®Universal Blue qPCR SYBR Green Master Mix购自翌圣生物科技股份有限公司(11184ES25)，Cas9 Nuclease购自近岸蛋白质科技有限公司(E365-01A)，RNase-free water购自武汉塞维尔生物技术有限公司(G4700-500ML)，苏丹黑染料购自BBI LIFE SCIENCES(4197-25-5)，三卡因(E10521-10G)、PTU(P7629-10G)购自Alorich，PCR引物由苏州金唯智生物科技有限公司合成，sgRNA购自南京金斯瑞生物科技有限公司。

显微注射仪PCO-1500(上海玉研科学仪器有限公司)，电热恒温培养箱DHP-9032(Blue Pard)，凝胶成像系统Tanon-3500(上海天能科技有限公司)，生物显微镜ECLIPSE Ci(Nikon)，离心机5424R(Eppendorf)，实时荧光定量PCR仪CFX96TM Real-Time System(BIO RAD)，Nanodrop 2000核酸浓度检测仪(Thermo Fisher)，盘旋式混合器KB-3-D(其林贝尔仪器制造有限公司)。

1.2 斑马鱼品系及养殖条件

本实验所用野生型AB斑马鱼成鱼或胚胎均由本课题组繁育，专人饲养于(28.5±0.5)℃恒温自动循环水系统中，以光照养殖14 h后黑暗养殖10 h作为斑马鱼的光照周期，养殖环境为pH 7.0～8.0，盐度0.25‰～0.50‰，电导率500～800 μS/cm。用于显微注射的胚胎由雌鱼和雄鱼按照1 ∶1的比例放置于产卵缸中，用挡板分隔开，次日取单细胞时期受精卵进行显微注射操作后移入胚胎培养液(MgSO4·7H2O 0.163 g/L，KCl 0.03 g/L，NaCl 1 g/L，CaCl20.04 g/L)中置于28.5 ℃恒温培养箱培养。

1.3 序列和生物信息学分析

从Ensemble网站(http：//asia.ensembl.org/index.html)获取人、小鼠、斑马鱼的Chac1蛋白氨基酸序列，使用CLC Sequence Viewer 8软件进行氨基酸序列比对，使用NCBI数据库中CD-Search工具查找基因家族保守结构域并做出标识。使用NCBI数据库HomoloGene板块成对比较智人与不同物种(黑猩猩、恒河猴、家牛、大鼠、小鼠、非洲爪蟾、斑马鱼)之间氨基酸和核苷酸序列的一致性和相似性。

用MEGA 11软件的Clustal W方法进行蛋白质氨基酸序列比对[20]，NJ法(Neighbor-Joining Algorithm)构建系统进化树[21]。

1.4 基因表达分析

组织的基因表达谱分析：选择3尾3个月以上的成年斑马鱼并分离出不同组织，斑马鱼在收集组织前禁食1天。斑马鱼死亡后解剖，取出心、鳔、肠道、卵巢、精巢、肌肉、肝脏、肾脏、眼睛、脾脏、脑，分别浸泡于1 mL RNAiso Plus中并用TRizol法提取总RNA。

胚胎期的基因表达谱分析：根据斑马鱼胚胎不同发育阶段，收集野生型斑马鱼0、0.5、1、3、5、10、12、24、48、72、96、120 hpf共12个时相的胚胎样本，每个时期随机收集30个受精卵用于总RNA的提取。

TRizol法提取不同样本的总RNA后测定其浓度和纯度。通过HiScript®Ⅲ RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)对1 μg总RNA逆转录成第一链cDNA，反应体系为20 μL，反应程序为42 ℃，2 min；37 ℃，15 min，85 ℃，5 s。逆转录后的cDNA稀释5倍作为实时荧光定量PCR的模版，并置于-20 ℃长期保存。

1.5 斑马鱼chac1基因的敲除和鉴定

在NCBI gene数据库(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/)中找到目的基因序列，利用在线设计网站CRISPRscan(https：//www.crisprscan.org/？page=gene)选择得分最高的3条sgRNA序列。在金斯瑞生物科技公司合成sgRNA。将3条sgRNA与Cas9蛋白按1∶1体积混匀后，注射到单细胞时期野生型斑马鱼胚胎中，同批次等体积注射3条混合scramble sgRNA与Cas9的混合物作为对照[22]，chac1 sgRNA和scramble sgRNA靶序列见表1。收集1 dpf的突变组和对照组胚胎，50 mmol/L NaOH和1 mol/L Tris-HCl提取基因组DNA，用PCR扩增引物进行PCR反应，对扩增产物sanger测序以进行突变效率检测。PCR扩增引物序列见表2。同时，收集1、3、5、7 dpf的突变组和对照组的存活胚胎或幼鱼各20枚，TRizol法提取总RNA后逆转为第一链cDNA，qRT-PCR定量突变斑马鱼chac1的3个靶位点的转录本活性，qRT-PCR引物序列见表3。

表1 chac1 sgRNA和scramble sgRNA靶序列Tab.1 chac1 sgRNA and scramble sgRNA target sequences

表2 PCR扩增引物序列Tab.2 List of primers for PCR amplification

表3 qRT-PCR引物序列Tab.3 List of primers for qRT-PCR

1.6 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)

以ef1a为内参，利用Hieff UNICON®Universal Blue qPCR SYBR Green Master Mix在Real-Time PCR上进行实时荧光定量PCR(qRT-PCR)，反应体系为10 μL：mix 5 μL，H2O 3.6 μL，Primer F 0.2 μL，Primer R 0.2 μL，cDNA 1 μL；反应条件为：95 ℃，2 min；95 ℃，10 s，60 ℃，30 s，40个循环；65 ℃，5 s，95 ℃。引物序列见表3。用2△△Ct法处理实验数据得出基因的相对表达量。统计结果为三次独立重复实验。

1.7 苏丹黑染色

收取3 dpf的野生型和chac1突变型斑马鱼幼鱼，放入1 mL 4%的多聚甲醛固定液中4 ℃过夜固定。第二天移除固定液并用1 mL PBST洗3次，加入500 μL苏丹黑常温染色30 min。70%乙醇洗净后，用PBST摇洗3次×5 min。最后加入1 mL 70%甘油，置于-20 ℃保存。

1.8 统计学处理

所有相关实验至少独立重复3次，使用GraphPad Prism 5.0软件进行统计分析，所有数据都显示为平均值±SEM。用T-test方法进行差异显著性分析，对于所有比对结果，P>0.05表示无显著性差异；0.01

2 结果

2.1 斑马鱼Chac1蛋白的序列特征

从Ensemble网站获取斑马鱼chac1基因序列，其CDS长度为591 bp，编码由197个氨基酸组成的蛋白质。将斑马鱼Chac1与其他11个不同物种的CHAC1进行多序列比对，并用NJ法构建系统发育进化树，结果显示(图1A)，斑马鱼Chac1的进化分枝与哺乳动物分开，且与大多数物种保持了高度的进化关系，尤其与斑点叉尾的亲缘关系最近，其次是塞内加尔多鳍鱼和青鳉。利用CLC Sequence Viewer 8软件对人、小鼠和斑马鱼chac1进行氨基酸序列比对，发现ChaC样结构域作为专门降解谷胱甘肽的结构域在不同物种中高度保守(图1B)。利用NCBI数据库HomoloGene板块将人与不同物种chac1的氨基酸和核苷酸进行比对，发现斑马鱼与人的氨基酸一致性为60.6%，基因相似性为63.4%(表4)。

2.2 chac1基因在斑马鱼胚胎和成鱼不同组织中的表达特征

为了确定chac1基因在斑马鱼发育过程中的表达模式，我们检查了斑马鱼不同发育阶段的胚胎和成鱼不同组织chac1 mRNA的表达量。结果显示chac1从斑马鱼胚胎的合子期到囊胚期中均为高表达(图2A)，提示斑马鱼chac1是母源基因。chac1基因在斑马鱼成鱼不同组织(心、鱼鳔、肠道、卵巢、精巢、肌肉、肝脏、肾脏、眼睛、脾脏、脑)中都有表达，但其表达水平在肌肉、卵巢、脑中明显较高(图2B)，提示chac1在这些组织中参与重要功能，可能导致不同类型的疾病。

图2 chac1基因在斑马鱼中的表达特征Fig.2 Expression characteristics of chac1 gene in D.rerioA：chac1在斑马鱼胚胎发育不同阶段的表达谱(以12hpf为对照组)；B：chac1在成年斑马鱼不同组织中的表达谱(以心脏组织为对照组)。“*”表示0.010.05)。下图同

2.3 CRISPR/Cas9构建chac1基因突变斑马鱼

我们通过CRIPSR/Cas9基因编辑工具构建chac1基因突变斑马鱼模型，设计了3条具有不同靶位点的sgRNA(图3A)，与Cas9混合后共注射到野生型斑马鱼单细胞时期胚胎中以构建chac1的突变体(图3C)。1天后对突变组胚胎的PCR产物进行一代测序检测其突变效率，发现PCR产物在PAM序列之后出现乱峰(图3B)，说明Cas9对靶序列的切割导致斑马鱼chac1在基因水平上发生错乱，导致转录提前出现终止密码子，进而使基因沉默。3条sgRNA都能高效诱导靶位点发生突变，3条sgRNA联合注射导致的突变效率为100%(表5)。同时，利用qRT-PCR技术分析突变斑马鱼chac1 3个靶位点的转录本活性，结果显示突变品系中chac1的mRNA水平在显微注射后1、3、5、7天均存在不同程度的下降(图3D)。chac1基因敲除斑马鱼模型构建成功。

图3 利用CRISPR/Cas9技术构建斑马鱼chac1突变体Fig.3 Targeting strategy for generating D.rerio chac1 crispant by CRISPR/Cas9A：chac1基因结构与位点突变示意图；B：基因敲除斑马鱼胚胎PCR产物一代测序峰图，图中红色方框为PAM区域；C：斑马鱼显微注射示意图；D：qRT-PCR检测野生型及敲除品系的斑马鱼不同靶位点chac1的mRNA水平(每个样本为3次生物学独立重复收集，每次每组25尾幼鱼)

表5 不同靶位点的sgRNA突变效率Tab.5 sgRNA mutation efficiency at different target sites

2.4 chac1突变促进斑马鱼中性粒细胞的生成

通过苏丹黑B染色观察发现3 dpfchac1突变斑马鱼较野生型斑马鱼的苏丹黑B染色阳性信号明显增多(图4A)。进一步利用qRT-PCR检测了斑马鱼粒细胞标志物mpo、lyz的mRNA表达量均升高(图4B)。以上结果表明斑马鱼中性粒细胞的早期发育与chac1基因有关。

图4 斑马鱼chac1基因突变表型分析Fig.4 Phenotype analysis of chac1 gene mutation in D.rerio larvagesA：(左)用于中性粒细胞量化的代表性图片，红色箭头所指为中性粒细胞，(右)斑马鱼幼鱼全身中性粒细胞数量统计(n=20)；B：斑马鱼中性粒细胞标志物mRNA的水平变化(n=20)

2.5 斑马鱼chac1缺失影响髓系造血基因表达

为了解释chac1敲除后早期中性粒细胞增多的现象，我们进一步检测了chac1敲除后pu.1、cebpa、cebp1等髓系造血发育相关转录调控因子的mRNA表达变化，并发现pu.1在chac1突变体中表达明显上调(图5)。该结果提示斑马鱼chac1可能通过调节髓系造血相关转录因子的表达进而调控骨髓祖细胞向中性粒细胞的分化过程。

图5 造血相关转录因子pu.1、cebpa、cebp1的mRNA水平变化Fig.5 Changes in mRNA levels of hematopoietic transcription factors such as pu.1，cebpa，and cebp1

3 讨论

chac1作为UPR下游的促凋亡因子，是GSH分解代谢通路中的重要基因，在凋亡信号转导、氧化还原、铁死亡等多种生物学反应中发挥着重要作用。目前现有研究中，因为chac1敲除胚胎致死率较高，所以仍缺少chac1敲除模型以深入研究chac1的生理病理功能。CRISPR/Cas9作为一种强大的基因编辑工具[23，24]，可对基因组DNA进行修饰，在建立人类疾病模型[25]和个性化治疗人类疾病中起重要作用[26]。本研究利用CRISPR/Cas9靶向基因编辑技术，探讨了斑马鱼chac1基因的表达特征及其在髓系造血中的功能，发现斑马鱼chac1基因可能通过调节髓系造血相关转录因子从而影响斑马鱼中性粒细胞的形成。这将有助于深入了解chac1基因在斑马鱼早期造血中可能发挥的作用，同时为分析相关疾病的发病机制及寻找潜在治疗策略提供思路。

生物信息学分析发现斑马鱼chac1的ChaC样结构域作为专门降解GSH的结构域，在不同物种中高度保守，表明CHAC1降解GSH的功能在生物进化过程中非常重要，可能具有重要功能。同时chac1在发育过程中也具有独特的表达模式，我们的结果首次证明chac1是母源表达基因，同时，chac1在斑马鱼卵巢及脑组织中均高表达，这与chac1在小鼠中的表型相吻合[27]，但与小鼠不同，chac1在斑马鱼的心脏、肝脏、心脏等组织中表达较低，这有可能是因为在个体基因水平上，同一基因的发育轨迹在不同物种中进展不同，chac1有可能是发育动态基因，其编码的蛋白质在表达上呈现出时间差异有关[28，29]。

相关研究表明斑马鱼骨髓细胞分为粒细胞和单核/巨噬细胞两个亚类，他们与炎症、肿瘤、感染等疾病有关[30-32]。为了深入了解chac1在斑马鱼骨髓细胞早期造血中的生理功能，我们分析了突变斑马鱼基因靶位点的转录本活性以进行突变效率的验证[33]，成功构建了chac1 crispant斑马鱼。对斑马鱼进行苏丹黑染色，使成熟中性粒细胞染色[34]，发现3dpf的chac1 crispant斑马鱼全身苏丹黑阳性信号较对照组更多。提示在定向造血阶段，斑马鱼中性粒细胞发育与chac1有关。有研究表明，骨髓细胞的成熟是由多种组织特异性转录因子决定的，骨髓祖细胞需要这些转录因子来促进他们的成熟和分化[35]。PU.1是骨髓祖细胞(CMP)进一步分化发展的重要转录因子，其缺失会导致小鼠髓系和淋巴系细胞出现发育缺陷[36]。CCAAT/增强子结合蛋白(C/EBP)家族成员的转录因子C/EBPα和C/EBPε在髓系形成中起重要作用[37，38]。因此，造血转录因子的表达差异在正常造血调控中十分重要，我们发现在定向造血阶段，chac1 crispant的pu.1水平上调，与我们SB染色的结果相符。同时，CHAC1是一种促凋亡因子，中性粒细胞的凋亡可能与CHAC1消耗GSH有关，敲除CHAC1可能会影响中性粒细胞的凋亡。值得注意的是，C/EBPα和C/EBPε的斑马鱼同源物cebpa、cebp1这两种与中性粒细胞发育成熟有关的转录因子[39]，在本研究中其表达量并没有改变，这有可能是因为我们在这里测定的是3dpf斑马鱼整体的基因表达变化趋势，包括免疫细胞和非免疫细胞，其具体的作用机制还需要进一步研究。

综上所述，本研究对斑马鱼chac1的序列表征进行了生物信息学分析，分析了chac1在发育过程中表达模式。同时利用CRISPR/Cas9定向基因编辑技术敲除了斑马鱼chac1基因后，发现chac1基因突变斑马鱼可能通过调节髓系造血相关转录因子pu.1进而影响斑马鱼中性粒细胞的形成。在接下来的研究中，我们将运用chac1基因突变斑马鱼模型进一步研究chac1在造血及免疫中的生理病理功能，以深入了解chac1在相关疾病发生发展中的作用。