急性高温胁迫对黑龙江茴鱼血清生化指标、消化酶、抗氧化酶活性及其基因表达的影响

丰超杰，张 颖，张永泉，刘霞飞，吕伟华，马 波，韩世成

(1.上海海洋大学水产与生命学院，上海 201306；2.中国水产科学研究院黑龙江水产研究所，哈尔滨 150076)

温度是鱼类生长、发育、代谢和繁殖过程中最重要的的生态因子[1]。鱼类作为变温动物自身缺乏体温调节机制，其体温随环境温度变化而变化[2]。当养殖水温超过鱼类耐受范围时会对鱼体的正常生命活动产生不利影响，导致其机体新陈代谢失衡、免疫应答紊乱，从而引发疾病甚至造成死亡[3，4]。近年来，由于温室效应的影响，全球气候变暖，极端高温、严寒天气出现的频率增加，对鱼类的生长和存活产生诸多不良影响[5]。此外，鱼类养殖过程中出现的急性高温应激极易给鱼体造成损伤，甚至会造成死亡，因此温度对鱼体的影响受到越来越多学者的广泛关注及研究。

研究证实，急性高温胁迫可显著影响鲤(Cyprinuscarpio)[6]、大菱鲆(Scophthalmusmaximus)[7]及虹鳟(Oncorhynchusmykiss)[8]等鱼类血清中总蛋白(TP)、谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)等生化指标水平，因而这些指标常被用于评估鱼类生理健康状况。同样，高温胁迫也对鱼类消化酶活性产生显著的影响，以往的研究表明，鱼体肠道消化酶活性的高低能直观反映鱼类对营养物质消化吸收能力，且极易受到水温变化的影响[9]。目前，有关水温变化对鱼类消化酶活性影响的研究已有较多报道，如银鲳(Pampusargenteus)[10]、美洲鲥(Alosasapidissima)[11]及翘嘴鳜(Sinipercachuatsi)[12]等鱼类在急性高温胁迫下，消化酶活性发生显著变化，但鲜见针对黑龙江茴鱼的相关报道。此外，高温胁迫还会导致鱼体内源性活性氧(ROS)增加，对细胞或组织造成氧化损伤[13]。鱼类可通过抗氧化防御系统中超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽抗氧化物酶(GPX)等抗氧化酶消除过多的ROS，维持机体的活性氧处于正常水平[14]。在对翘嘴鳜[5]、施氏鲟(Acipenserschrencki)[15]、硬头鳟(Salmongairdneri)[16]及马口鱼(Opsariichthysbidens)[17]等鱼类的研究发现，高温胁迫引起抗氧化酶活性及其基因呈规律性表达，整体上表现为先上升后下降的变化趋势。因此，急性高温胁迫下鱼类生理变化机制对于鱼类的健康养殖具有重要的实践指导意义。

黑龙江茴鱼(Thymallusarcticusgrubei)隶属于鲑形目(Salmoniformes)茴鱼科(Thymallida)茴鱼属(Thymallus)，为北温带小型溪居冷水性鱼类，主要分布于我国黑龙江、牡丹江、乌苏里江及松花江等流域[18]。黑龙江茴鱼肉质细嫩，味道鲜美，营养丰富，是黑龙江省特有的名优经济鱼类[19]。近年来，受过度捕捞、环境污染以及栖息地破坏等因素影响，黑龙江茴鱼的野生资源量急剧下降，已被列入《中国国家重点保护野生动物名录》二级[20]。作为冷水性鱼类，黑龙江茴鱼的适宜生长温度为8～18 ℃，对外界环境温度变化较为敏感，尤其是在全球环境变暖和夏季连续高温的大趋势下[21]。因此开展高温胁迫对其机体生理代谢及抗应激反应等研究，对黑龙江茴鱼在实际养殖生产过程中具有重要的指导意义。然而，目前有关黑龙江茴鱼对高温胁迫响应的生理机制研究还尚未见报道。因此，本研究以黑龙江茴鱼为研究对象，研究急性高温胁迫对其血清生化指标、消化及抗氧化能力的影响，初步探索黑龙江茴鱼在急性高温胁迫下的适应性及响应机制，以期为黑龙江茴鱼在健康养殖过程中抵御高温胁迫提供参考资料。

1 材料与方法

1.1 实验材料及暂养条件

实验用鱼取自中国水产科学研究院黑龙江水产研究所渤海试验基地，运回实验室后放置于全自动控温循环水实验室中，黑龙江茴鱼规格平均体长(14.26±1.20)cm、平均体质量(32.34±3.71)g。利用自动控温仪将鱼置于(11.0±0.5)℃的水环境下暂养14 d，光暗比为1∶1。暂养期间水中溶解氧、pH和盐度分别为大于6 mg/L、6.91±0.08和0，由便携式多功能溶解氧测量仪测定。每天换水一次并持续曝气，保证水体溶解氧含量在适宜范围内。暂养期间每日于8：00、18：00投喂至饱食状态，饲料为水蚯蚓，实验开始前24 h停止投喂，实验期间不投喂，尽量减少人为干扰。

1.2 实验设计

实验开始前，选取健康状况良好、体表无明显外伤且规格相近的黑龙江茴鱼240尾放入鱼缸中(80 cm×50 cm×40 cm)。基于课题组前期的研究发现，黑龙江茴鱼养殖在11～20 ℃温度下，其死亡率随养殖温度的升高成正比，其中当温度高于17 ℃时，死亡率明显上升。

故将实验设置11(对照组)、14、17、20 ℃共4个温度水平，每个处理设置3个平行，每个平行放养20尾，用全自动温控仪调节所需温度(±0.5 ℃)。本实验使用自动控温系统调节温度，升温速率为1 ℃/h，直至达到实验目标温度，对照组11 ℃温度保持不变。在达到设置温度的0、24及48 h分别取样。

1.3 样品采集与处理

每个平行随机取3尾鱼，每个处理组共9尾鱼。使用200 mg/L的MS-222做快速深度麻醉，麻醉后置于冰盘上采用尾静脉采血。血样于4 ℃冰箱中静置2 h，在4 ℃，3 500 r/min离心20 min制备血清，上清液移置-80 ℃冰箱中保存备用。取血后立即解剖黑龙江茴鱼采集肝脏和肠道组织，使用现配的生理盐水进行冲洗，经液氮处理后放入-80 ℃冰箱保存备用。

1.4 测定指标与方法

1.4.1 血清生化指标测定

利用全自动生化分析仪依次测定血清中的总蛋白(TP)、谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)、碱性磷酸酶(ALP)等血清生化指标。

1.4.2 肠道消化酶活性测定

肠道样品解冻后，用预冷生理盐水冲洗，滤纸吸干水分后称重，加入一定体积预冷生理盐水，在冰浴条件下研磨制作匀浆。匀浆液经4 ℃离心(3 500 r/min，10 min)后，取上清液于预冷的无菌离心管中，-20 ℃保存，用于肠道消化酶活性的测定。肠道胰蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶均采用南京建成试剂盒测定；其中，胰蛋白酶和脂肪酶采用比色法，淀粉酶采用碘-淀粉比色法。酶活性单位采用U/mg或U/g表示。

1.4.3 肝脏抗氧化酶活性测定

肝脏中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、过氧化氢酶(catalase，CAT)和谷胱甘肽抗氧化物酶(GPX)的活性测定，均采用南京建成生物工程研究所有限公司提供的试剂盒，参照试剂盒说明书测定。

1.5 实时荧光定量PCR

采用TRlzol法提取每个肝脏组织样本总RNA，使用Nano Drop®ND-2000测定RNA浓度和纯度，测量前先用溶解RNA的RNase-Free ddH2O调零，变性琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性。采用HiScript Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis Kit进行cDNA反转录，实验操作按产品说明书进行，cDNA保存放-20 ℃冰箱备用。根据NCBI数据库获得SOD和CAT基因序列，以β-actin为参考基因，利用NCBI数据库的Primer-BLAST程序设计引物，委托库美生物科技有限公司(吉林)合成引物，引物序列见表1。实时荧光定量PCR反应体系20 μL：2×AceQ Universal SYBR qPCR Master Mix 10 μL，cDNA模板2 μL，正、反引物各0.4 μL，RNase Free ddH2O 7.2 μL。PCR反应程序为：95 ℃；72 ℃，3 min，10 min；40个PCR循环(95 ℃，15 s；60 ℃，1 min；72 ℃，2 min；72 ℃，3 min)。

表1 实时荧光定量PCR扩增引物序列Tab.1 RT-PCR primer sequence

1.6 统计分析

实时荧光定量PCR分析的试验结果数据，采用2-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量。采用SPSS 22.0软件对试验数据进行统计分析，同一时间点不同处理组间数据运用单因素方差分析(One-way ANOVA)，Duncan检验进行多重比较，试验数据以平均值±标准差(X±SD)表示，以P<0.05表示差异显著，并使用Excel绘制图表。

2 结果与分析

2.1 急性高温胁迫下黑龙江茴鱼血清生化指标的变化

急性高温胁迫下黑龙江茴鱼TP含量、ALT、AST及碱性磷酸酶(ALP)活性变化规律见图1。在急性温度胁迫下，随胁迫时间的延长，17 ℃组和20 ℃组的TP含量呈下降趋势，均显著低于对照组；14 ℃组TP含量在实验期间与对照组(11 ℃)无显著性差异(图1A)。高温组(14、17和20 ℃)血清中ALT活性随胁迫时间的增加呈先上升后下降的变化规律，在胁迫24 h时ALT活性均最高且显著高于对照组；17 ℃组和20 ℃组在胁迫48 h时，ALT活性显著高于对照组，而14℃组差异不显著(图1B)。高温组(14、17和20 ℃)AST活性随胁迫时间的增加而上升，且在实验期间血清中AST活性均显著高于对照组(图1C)。此外，14 ℃组血清中ALP活性在胁迫24 h时显著下降，随后上升；17 ℃组和20 ℃组血清ALP活性随胁迫时间的延长呈先下降后上升的变化规律，除升温初期(0 h)，各时间点ALP活性均显著低于对照组(图1D)。

2.2 急性高温胁迫下黑龙江茴鱼肠道消化酶的变化

急性高温胁迫下黑龙江茴鱼肠道淀粉酶、脂肪酶和蛋白酶活性变化规律见图2。高温组(14、17和20 ℃)肠道淀粉酶活性随胁迫时间的延长呈先升高后下降的变化趋势，其中17 ℃组和20 ℃组肠道淀粉酶活性在胁迫24 h时显著高于对照组，在胁迫48 h时淀粉酶活性显著低于对照组；14 ℃组与17 ℃组和20 ℃组有一致的变化规律，但在胁迫48 h时淀粉酶活性显著高于对照组(图2 A)。高温组(14、17和20 ℃)肠道脂肪酶活性随胁迫时间增加缓慢上升，其中17 ℃组和20 ℃组在实验期间脂肪酶活性显著高于对照组(图2B)。此外，高温组(14、17和20 ℃)肠道蛋白酶活性均在胁迫前期(24 h)显著上升；在胁迫48 h时，14 ℃组蛋白酶活性显著高于对照组，而17 ℃组和20 ℃组显著低于对照组水平(图2C)。

2.3 急性高温胁迫下黑龙江茴鱼肝脏抗氧化酶的变化

急性高温胁迫下黑龙江茴鱼肝脏SOD、CAT和GPX活性变化规律见图3。高温组(14、17和20 ℃)肝脏中SOD活性随胁迫时间的增加均呈先升后降的变化规律，在胁迫24 h时SOD活性达到最高值；其中17 ℃组和20 ℃组在胁迫48 h时显著高于对照组，而14 ℃组在胁迫48 h时下降至对照组水平(图3A)。17 ℃组和20 ℃组在胁迫24 h时肝脏CAT活性显著上升，随后显著下降；14 ℃组也有类似的趋势，但CAT活性在48 h时下降至对照组水平(图3B)。此外，高温胁迫组(14、17和20 ℃)肝脏中GPX活性随胁迫时间的延长呈先上升后下降的变化趋势，且GPX活性均显著高于对照组(图3C)。

图3 急性高温胁迫对黑龙江茴鱼肝脏抗氧化酶活性的影响Fig.3 The effect of acute high temperature stress on antioxidant enzyme activity in the liver of T.arcticus grubei

2.4 急性高温胁迫下黑龙江茴鱼肝脏抗氧化基因相对表达量的变化

急性高温胁迫下黑龙江茴鱼肝脏SOD和CAT基因相对表达量变化规律见图4。17 ℃组和20 ℃组肝脏中SOD、CAT基因相对表达量在胁迫期间显著上升；14 ℃组肝脏中SOD、CAT基因相对表达量随胁迫时间的延长呈先上升后下降的趋势，在胁迫24 h时显著高于对照水平，至48 h下降至对照组水平。

图4 急性高温胁迫对黑龙江茴鱼肝脏SOD、CAT基因表达的影响Fig.4 Effect of acute high-temperature stress on the expression of SOD and CAT genes in the liver of T.arcticus grubei

3 讨论

3.1 急性高温胁迫对鱼类血清生化指标的影响

鱼类血清生化指标可以反映其对环境应激时机体内物质代谢和组织器官功能的变化情况[6]。TP水平可反映鱼体健康状态，具有维持血液正常胶体渗透压和pH稳定的作用，参与固醇与脂肪酸等物资运输并与机体免疫应激功能相关[22]。强俊等[23]发现，在26℃以上的高温胁迫下，尼罗罗非鱼(Oreochromisniloticus)血清TP随胁迫时间的增加呈下降趋势。温海深等[24]研究发现，急性高温胁迫下许氏平鲉(Sebastesschlegelii)TP含量显著降低。本实验也有类似的结果，在17 ℃和20 ℃急性高温下TP含量随胁迫时间的延长显著下降。推测黑龙江茴鱼在长时间的高温应激下，机体合成的能量主要应对环境胁迫，而用于合成鱼体蛋白质的比例减少，因此血清中TP含量下降[23]。

ALT活性和AST活性可作为判断肝脏是否损伤的指示物。正常生理代谢条件下，ALT和AST在血清中含量相对恒定且较低[25]。但当环境胁迫引起机体肝脏损伤时，组织细胞膜通透性改变，肝细胞内的转氨酶会透过细胞膜进入血液中，引起转氨酶活力升高[7]。研究发现高温应激鳜幼鱼血清中AST和ALT活性显著增加[5]；对许氏平鲉的研究发现，急性高温27 ℃胁迫下血清中AST和ALT活性显著上升[26]；研究表明30 ℃高温胁迫下美洲鲥血清AST和ALT活性随时间增长呈升高趋势[27]。这与本研究结果相似，在本研究中17 ℃组和20 ℃组血清中AST和ALT活性随胁迫时间的延长显著上升，表明急性高温可能引起肝脏组织受损，细胞膜通透性增大，致使血清中酶活性升高。

ALP是鱼类重要的非特异性免疫标志酶，也是重要的代谢调控酶，其活性受环境温度变化的影响，可作为评价机体免疫能力、代谢水平的指标[28]。对银鲳的高温胁迫研究结果表明，血清ALP活性随温度升高呈下降趋势[29]。本实验中也有类似的变化趋势，17 ℃组和20 ℃组在胁迫前期显著上升，之后显著降低。分析原因可能在实验开始时，受高温的影响，黑龙江茴鱼通过提升血清中的ALP的活力，提升自身的免疫力，以此抵御环境应激；而随胁迫时间延长，由于其机体免疫能力的下降，血清中的ALP活力显著降低。

3.2 急性高温胁迫对鱼类肠道消化酶活性的影响

消化酶活性的高低反映鱼类机体对摄入的营养物质进行消化吸收的能力[30]。酶作为一种蛋白质，环境因素如酸碱度、盐度及温度等对其活性影响较大，其中环境温度作为最关键的影响因子之一，直接影响着鱼体内的消化酶活性[9]。研究发现，对银鲳幼鱼进行48 h高温胁迫时，随胁迫时间的增加肠道淀粉酶、蛋白酶活性呈先上升后下降的趋势，在胁迫24 h时达到最高值[10]。石鲷(Oplegnathusfasciatus)幼鱼随着温度的升高，其肠道淀粉酶和蛋白酶活性均呈现先升高后降低的趋势[31]。本研究结果显示，17 ℃组和20 ℃组肠道淀粉酶和蛋白酶活性随胁迫时间的增加均呈先上升后下降的趋势，于胁迫24 h时达到最大值，与上述的研究结果基本一致。表明在此温度胁迫下，黑龙江茴鱼淀粉酶及蛋白酶的结构可能被破坏，导致其酶活性降低[10]。而翘嘴鳜在急性温度胁迫下的研究表明，淀粉酶和蛋白酶随胁迫时间的增加呈先下降后上升的变化趋势[12]，与本试验的结果相反，出现差异的原因可能与实验鱼种、实验温度及应激时间等不同有关。

脂肪酶是脂质代谢过程中非常重要的酶类，水解脂肪产生甘油一酯、游离脂肪酸及甘油二酯，最终转化为脂肪酸和甘油而为鱼体供能[32]。本研究中，17 ℃组和20 ℃组脂肪酶活性随胁迫时间的延长缓慢增加，说明此温度下黑龙江茴鱼脂肪酶的活性并没有被破坏。这与美洲鲥[11]研究的结果一致。由于在本实验过程中未对黑龙江茴鱼进行投喂，推测在急性高温胁迫前期可能主要水解糖类和蛋白质提供机体所需的能量，后期转为水解脂肪供能。

3.3 急性高温胁迫对鱼类肝脏抗氧化酶活性的影响

水产养殖过程中，温度是影响鱼类生长发育的重要环境因子之一，水温突变会使鱼类产生氧化应激，导致组织氧化损伤[16]。鱼体在正常的新陈代谢下产生的活性氧自由基(ROS)处于动态平衡中，当受到外界环境因子的刺激时ROS就会大量生成，过量的ROS会对机体组织造成一定的损伤[17]。SOD、CAT是生物体清除ROS的关键抗氧化酶，SOD将机体内产生的ROS分解成过氧化氢，CAT和GPX作为过氧化氢的清除剂，将过氧化氢还原成氧分子和水，从而维持机体的正常生理活动，故可作为鱼类机体在氧化应激状态的重要指示物[14]。陆健等[33]发现急性高温胁迫下大口黑鲈(Micropterussalmoides)肝脏抗氧化酶活性随胁迫时间的增加呈先升高后下降的趋势。姜旭阳等[2]研究报道显示，温度升高对虹鳟和硬头鳟肝脏抗氧化酶有显著影响，在高温应激前期抗氧化酶活性均出现升高的趋势。急性高温应激对尼罗罗非鱼肝脏抗氧化酶影响显著，高温胁迫下SOD、CAT活性随胁迫时间的延长均呈先升高后下降的变化[23]。本研究结果显示，高温胁迫下(14、17和20 ℃)黑龙江茴鱼肝脏中SOD、CAT和GPX活性随胁迫时间的增加均呈先上升后下降的变化趋势，于胁迫24 h时显著高于对照组，与上述的研究结果相似。这可能是因为在胁迫前期，鱼类为了适应环境应激，通过提升各种抗氧化酶的活性以清除产生的自由基，使得机体维持相对稳定的状态。随后17 ℃组和20 ℃组在胁迫24 h后，CAT活性显著降低于对照组水平以下，而SOD、GPX活性降低但显著高于对照组水平，这可能是SOD和GPX对温度敏感性较低，CAT活性被抑制诱导GPX活性上升，GPX发挥其代偿作用清除机体内过多的H2O2[2]。这与谢明媚等[34]研究温度对银鲳幼鱼肝脏抗氧化酶活性影响的结果相似。

3.4 急性高温胁迫对鱼类抗氧化基因表达的影响

超氧化物歧化酶和过氧化氢酶是非常重要的应激指示物之一[33]。外界环境因素会显著影响机体SOD、CAT基因的表达量，如温度、低氧、盐度及微生物等[35]。孙旋辉等[5]研究发现鳜幼鱼在高温应激下，SOD基因相对表达量显著升高。研究表明黑鲷(Acanthopagrusschlegeli)在热应激后SOD、CAT基因表达量显著升高[36]。张美东等[37]研究发现，鲢(Hypophthalmichthysmolitrix)经低氧胁迫后，肝脏中SOD活性在低氧胁迫24 h时显著上升，且SOD基因表达趋势与酶活一致。孔嘉明等[38]研究表明，罗氏沼虾(Macrobrachiumrosenbergii)被细菌感染后SOD基因、CAT基因的相对表达量呈先升高后降低再升高的变化趋势。本研究发现，高温胁迫下肝脏中SOD、CAT基因相对表达量均显著上调表达，与上述的研究结果一致。表明机体在高温胁迫下产生氧化应激，机体通过促进大量SOD、CAT基因的表达以清除组织中活性氧自由基，维持机体平衡。此外，肝脏中CAT基因表达量与相应酶活性的变化趋势不同，推测可能是因为基因翻译为蛋白的过程中受多种调控因素影响[39]。抗氧化酶活性及其基因表达和蛋白质水平上有差异，也可能与生物体内酶的类型有关，具体机制还有待进一步深入探究。

4 结论

本实验研究表明，在17～20 ℃高温处理下，黑龙江茴鱼血清中ALT和AST活性显著上升，TP和ALP活性显著下降；肠道淀粉酶和蛋白酶活性显著降低，脂肪酶活性显著增加；肝脏中SOD和GPX活性显著上升，CAT活性显著下降，对鱼体的生理代谢和抗氧化防御能力造成显著的影响。因此在黑龙江茴鱼养殖生产操作过程中，应密切关注养殖温度的变化且控制其养殖温度在11～14 ℃左右，尽量避免高温和温度急剧变化对鱼体造成应激损伤。