甘蔗ShPR10基因的克隆及其编码蛋白与甘蔗线条花叶病毒P1蛋白的互作研究

2023-11-23黄佳艳冯小艳沈林波王文治胡海燕张树珍

生物技术通报 2023年10期

黄佳艳冯小艳沈林波王文治胡海燕张树珍

（1. 海南大学热带作物学院，海口 570228；2. 中国热带农业科学院热带生物技术研究所，海口 571101）

植物病程相关蛋白（pathogenesis related pro‑teins, PRs）是一类在植物受到逆境胁迫后诱导产生并积累的蛋白质的总称［1］。根据蛋白结构、理化性质和生物活性等特征，将PR蛋白分成17个家族，即PR1-PR17［2］。其中PR10是一类分子量小、等电点呈酸性、无信号肽的胞内蛋白［3］。PR10蛋白不仅参与植物对炎热、寒冷、干旱、盐碱、细菌、真菌等逆境胁迫的响应，还在植物抵抗病毒侵染过程中发挥重要作用［1-3］。辣椒（Capsicum annuum）CaPR10蛋白受烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus,TMV）诱导表达水平显著升高并发生磷酸化，增强了CaPR10的核酸酶活性，促使CaPR10对入侵的病毒RNA进行切割，从而达到抗病毒的作用［4］。烟草（Nicotiana tabacum）NtPR10基因应答TMV侵染，感、抗烟草品种在感染TMV后，其NtPR10表达水平整体呈现相反的变化趋势，表明NtPR10可能在TMV侵染过程中发挥作用［5］。岷江百合（Lilium regale）编码的LrPR10基因受黄瓜花叶病毒（Cucu‑mber mosaic virus, CMV）诱导上调表达，接种CMV 4 d后，LrPR10的表达水平达到最大值，为处理前的58倍，表明LrPR10可能在岷江百合抗CMV防御反应中发挥作用［6］。烟草NbPR10a基因受烟草曲茎病毒（Tobacco curly shoot virus, TbCSV）诱导上调表达，在烟草植株中沉默NbPR10a基因导致TbCSV积累量显著增加，表明NbPR10a具有抵抗TbCSV侵染的作用［7］。

甘蔗（Saccharum spp.）是重要的糖料作物和能源作物，甘蔗糖约占我国食糖总产量的90%［8-9］。甘蔗线条花叶病毒（Sugarcane streak mosaic virus,SCSMV）是引起甘蔗花叶病的主要病原之一，其侵染甘蔗导致叶片褪绿斑驳、植株矮化、分蘖变少，继而影响甘蔗的品质和产量［10-11］。SCSMV在我国各大蔗区广泛分布，对我国甘蔗产业的发展造成严重威胁［11］。其隶属马铃薯Y 病毒科（Potyviridae）禾本科病毒属（Poacevirus），基因组大小约10 kb，编码1个多聚蛋白，该蛋白进一步被蛋白酶水解成11个成熟的功能蛋白，从N端到C端依次是P1、HC‑Pro、P3、P3N‑PIPO、6K1、CI、6K2、VPg、NIa‑Pro、NIb和CP［12-14］。其中，P1蛋白是RNA沉默抑制子，能够抑制寄主的RNA沉默防御机制，从而帮助SCSMV成功侵染寄主［14-15］。

本课题组在前期研究中，以SCSMV编码的P1蛋白为诱饵，采用酵母双杂交（yeast two hybrid,Y2H）技术筛选获得一个与SCSMV P1蛋白互作的甘蔗PR10蛋白，命名为ShPR10［15］。在本研究中，首先利用同源克隆技术克隆ShPR10基因的完整开放阅读框（open reading frame, ORF）序列，并对其编码蛋白进行生物信息学和亚细胞定位分析；然后利用Y2H和双分子荧光互补（bimolecular fluorescence complementation, BiFC）技术验证ShPR10与SCSMV P1的互作关系；最后采用农杆菌共浸润瞬时表达系统和Western blot技术分析ShPR10对SCSMV P1沉默抑制子活性的影响。研究结果揭示ShPR10在甘蔗应答SCSMV侵染过程中的作用，为甘蔗抗SCSMV育种奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料甘蔗品种为ROC22，种植于中国热带农业科学院热带生物技术研究所海南文昌试验基地。野生型本氏烟草（Nicotiana benthamiana）种植于相对湿度60%、光照16 h/d、温度25℃的培养箱中。

1.1.2 主要试剂 EZNA Plant RNA Kit购自Omega BIO‑TEK公司；RevertAid First‑Strand cDNA Synthesis Kit购自Thermo Scientific公司；Nimble Cloning试剂盒购自海南壹田生物科技有限公司；HiPure Gel Pure DNA Mini Kit购自Magen公司；2× Magic Green Taq Mix购自TOLOBIO公司；大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司；Y2H Gold酵母（Saccharomyces cerevisiae）感受态细胞和农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）GV3101感受态细胞购自上海唯地生物技术有限公司；Bsa I内切酶、2× EasyClone Mix和pBWA（V）HS‑ccdB载体购自武汉伯远生物科技有限公司；pNC‑GADT7、pNC‑BiFC‑Ecn、pNC‑BiFC‑Enn、pNC‑Cam33FN和pNC‑Cam33HN载体由中国热带农业科学院热带生物技术研究所言普研究员馈赠；P1‑18T、ShPR10‑18T、GFP‑18T、pGBKT7‑P1和pCam3304‑35S‑GFP质粒为课题组构建并保存。

1.1.3 主要仪器 Biometra TAdvanced PCR仪购自德国Analytikjena公司；琼脂糖凝胶电泳仪购自美国Bio‑Rad公司；凝胶成像分析仪器购自上海天能科技有限公司；LSM800激光共聚焦显微镜购自德国卡尔蔡司光学有限公司；长波紫外灯购自上海路阳仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取和cDNA第一链合成称取 0.1 g ROC22叶片，用液氮研磨成粉末，按照EZNA Plant RNA Kit说明书的步骤提取甘蔗总RNA。cDNA第一链合成用RevertAid First‑Strand cDNA Synthesis Kit进行，产物置于‑20℃保存。

1.2.2 ShPR10基因的克隆及生物信息学分析以酵母双杂交文库筛选获得的ShPR10基因序列和NCBI数据库中玉米（Zea mays, EU976710.1）、野生二粒小麦（Triticum dicoccoides, XM_037558368）及一粒小麦（Triticum monococcum, JX424309.1）的PR10序列为参考，设计ShPR10基因ORF序列的特异扩增引物ShPR10‑F和ShPR10‑R（表1）。以ROC22叶片cDNA为模板，参照冯小艳等［16］的方法克隆ShPR10基因，并送生工生物工程（上海）股份有限公司测序。

表1 本研究使用的引物Table 1 Primers used in this study

利用ProtParam（http://expasy.org/tools/protparam.html）预测ShPR10编码蛋白的理化性质；利用NP‑SA‑PRABI（https://www.so.com/s?ie=utf‑8&src=360se7_addr&q=NPSA‑PRABI）、TMHMM 2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）和 SignalP 5.0（http://www.cbs.dtu.dk /services /Signal P/）分别预测ShPR10的二级结构、跨膜特性和信号肽；利用Blastp在线工具查找ShPR10的同源氨基酸序列，使用DNAMAN软件进行同源氨基酸序列比对分析，并使用MEGA 11.0软件构建进化树。

1.2.3 ShPR10的亚细胞定位以GFP‑18T质粒为模板，GFP‑p‑F和GFP‑p‑R（表1）为引物扩增绿色荧光蛋白GFP基因。以ShPR10‑18T质粒为模板，ShPR10‑p‑F和ShPR10‑p‑R（表1）为引物扩增ShPR10基因。两个基因扩增产物分别通过琼脂糖凝胶电泳后，切下目的条带置于同一EP管中进行回收。回收产物与经Bsa I酶切线性化的pBWA（V）HS‑ccdB载体进行重组，重组体系：线性化的pBWA（V）HS‑ccdB载体5 μL，回收产物5 μL，2× EasyClone Mix 10 μL，37℃反应30 h获得重组质粒pBWA（V）HS‑GFP‑ShPR10。将该重组质粒转入GV3101农杆菌感受态细胞中，参考尹梦莹等［17］的方法进行农杆菌侵染实验，将带有重组质粒的农杆菌注入本氏烟草叶片，48 h后在激光共聚焦显微镜下观察叶片中荧光蛋白的位置。

1.2.4 Y2H验证ShPR10与SCSMV P1的互作以ShPR10‑18T质粒为模板，ShPR10‑JT‑F和ShPR10‑JT‑R（表1）为引物扩增ShPR10基因。按照Nimble Cloning试剂盒说明将ShPR10基因连接到pNC‑GADT7载体上，获得猎物质粒pNC‑GADT7‑ShPR10。将猎物质粒pNC‑GADT7‑ShPR10与课题组保存的诱饵质粒pGBKT7‑P1共同转化Y2H Gold酵母菌株，转化产物涂布于SD/‑Trp/‑Leu平板上，28℃培养至长出单菌落。挑取单菌落于SD/‑Trp/‑Leu液体培养基中培养至OD600值为1.0，用ddH2O将菌液进行10倍系列稀释，取4 μL分别点到SD/‑Trp/‑Leu和SD/‑Trp/‑Leu/‑His/‑Ade/X-α-Gal平板上，3-5 d后观察菌落生长情况。以pGBKT7‑53 和 pGADT7‑T 组合为阳性对照，pGBKT7‑Lam 和pGADT7‑T 组合为阴性对照，pGBKT7 和pNC‑GADT7‑ShPR10组合、pGBKT7‑P1和pNC‑GADT7 组合为自激活验证。

1.2.5 BiFC验证ShPR10与SCSMV P1的互作以P1‑18T质粒为模板，P1‑JT‑F和P1‑JT‑R（表1）为引物扩增P1基因。以ShPR10‑18T质粒为模板，ShPR10‑JT‑F和ShPR10‑JT‑R1（表1）为引物扩增ShPR10基因。参照Nimble Cloning试剂盒说明将ShPR10和P1基因分别连接到pNC‑BiFC‑Ecn和pNC‑BiFC‑Enn载体上，获得重组质粒pNC‑BiFC‑Ecn‑ShPR10和pNC‑BiFC‑Enn‑P1。将重组质粒转入GV3101农杆菌，参照朱海龙等［18］的方法将含有pNC‑BiFC‑Ecn‑ShPR10和pNC‑BiFC‑Enn‑P1的农杆菌等比例混合后注射本氏烟草叶片，48 h后在激光共聚焦显微镜下观察拍照。以pNC‑BiFC‑Ecn和pNC‑BiFC‑Enn‑P1组合、pNC‑BiFC‑Ecn‑ShPR10和pNC‑BiFC‑Enn组合为对照。

1.2.6 ShPR10对SCSMV P1沉默抑制子活性的影响以P1‑18T质粒为模板，P1‑JT‑F和P1‑JT‑R1（表1）为引物扩增P1基因。以ShPR10‑18T质粒为模板，ShPR10‑JT‑F和ShPR10‑JT‑R（表1）为引物扩增ShPR10基因。按照Nimble Cloning试剂盒说明将P1和ShPR10基因分别连接到植物表达载体pNC‑Cam33FN（带Flag标签）和pNC‑Cam33HN（带HA标签），获得重组质粒pNC‑Cam33FN‑P1和pNC‑Cam33HN‑ShPR10。将pNC‑Cam33FN‑P1、pNC‑Cam33HN‑ShPR10和课题组保存的pCam3304‑35S‑GFP质粒分别转化GV3101农杆菌。参考Chen等［19］方法将携带pCam3304‑35S‑GFP、pNC‑Cam33FN‑P1和pNC‑Cam33HN‑ShPR10质粒的3种农杆菌等比例混合后注射本氏烟草叶片，以携带pCam3304‑35S‑GFP、pNC‑Cam33FN‑P1和pNC‑Cam33HN空质粒的3种农杆菌混合注射为对照。此外，为了说明ShPR10本身不具有沉默抑制子的活性，将携带pCam3304‑35S‑GFP、pNC‑Cam33HN‑ShPR10和pNC‑Cam33FN空质粒的3种农杆菌混合注射烟草叶片。注射4 d后，在长波紫外灯下观察注射区域GFP的荧光强度并采用数码相机拍照记录。在紫外灯下剪下注射区域的烟草叶片，参考Chen等［19］方法进行总蛋白提取和Western blot检测GFP、P1和ShPR10蛋白的表达水平，使用Image J软件对蛋白条带进行定量分析。

2 结果

2.1 ShPR10基因的克隆

以甘蔗ROC22叶片cDNA为模板，ShPR10‑F和ShPR10‑R为引物进行扩增，获得一条600 bp左右的条带（图1‑A），与预期大小相符。回收该条带将其连接至T载体并送测序。结果（图1‑B）显示，克隆获得甘蔗ShPR10基因的完整ORF，其长度为570 bp，编码189个氨基酸，其氨基酸序列中含有以“GxGGxG”为特征的P‑loop基序。

2.2 ShPR10序列分析

ProtParam分析表明，ShPR10的分子量为21.17 kD，等电点为4.77，为酸性蛋白；不稳定系数为70.86，为不稳定蛋白；脂溶指数为48.47，总平均亲水性是‑0.93，可能是亲水性蛋白。NPSA‑PRABI预测表明（图2），ShPR10中无规则卷曲占比为51.85%，α-螺旋占比为35.98%，延伸链占比为7.41%，β-转角占比为4.76%。TMHMM 2.0分析表明（图3），ShPR10蛋白无跨膜结构域。SignalP 5.0分析表明（图4），ShPR10蛋白不含信号肽，是非分泌蛋白。

图2 ShPR10蛋白二级结构预测Fig. 2 Secondary structure prediction of ShPR10 protein

图3 ShPR10蛋白跨膜结构预测Fig. 3 Transmembrane structure prediction of ShPR10 protein

图4 ShPR10蛋白信号肽预测Fig. 4 Signal peptide prediction of ShPR10 protein

氨基酸序列同源比对分析结果（图5）显示，甘蔗ShPR10与玉米ZmPR10、柳枝稷（Panicum virgatum）PvPR10、普通小麦（Triticum aestivum）TaPR10、光稃稻（Oryza glaberrima）OgPR10、短花稻（Oryza brachyantha）ObPR10、多年生黑麦草（Lolium perenne）LpPR10、乌拉尔图小麦（Triti‑cum urartu）TuPR10、硬直黑麦草（Lolium rigidum）LrPR10和野生二粒小麦TdPR10的氨基酸序列具有较高相似度，分别为91.53%、82.01%、76.56%、76.50%、76.17%、75.92%、75.52%、75.13%和72.40%。为进一步分析甘蔗ShPR10蛋白与其他物种PR10蛋白的进化关系，使用MEGA 11.0软件构建系统进化树，结果（图6）表明，甘蔗ShPR10蛋白与玉米ZmPR10的亲缘关系最近。

图5 甘蔗ShPR10与其他物种PR10的氨基酸序列比对Fig. 5 Amino acid sequence alignment between ShPR10 protein from sugarcane and PR10 from other species

图6 甘蔗ShPR10与其他物种PR10蛋白的系统进化树分析Fig. 6 Phylogenetic tree analysis of ShPR10 protein from sugarcane and PR10 proteins from other species

2.3 ShPR10的亚细胞定位

将GFP基因融合在ShPR10基因的5′端，成功构建亚细胞定位载体pBWA（V）HS‑GFP‑ShPR10。将该载体通过农杆菌介导侵染烟草表皮细胞，在激光共聚焦显微镜下观察GFP‑ShPR10融合蛋白的绿色荧光在烟草细胞内的分布情况。结果（图7）显示，绿色荧光主要分布在细胞质和细胞核，表明ShPR10主要定位于细胞质和细胞核。

图7 ShPR10在本氏烟草表皮细胞中的定位Fig. 7 Localization of ShPR10 in N. benthamiana epidermal cells

2.4 ShPR10与SCSMV P1的互作验证

Y2H试验结果显示（图8），所有组合在SD/‑Trp/‑Leu培养基上正常生长，表明所有组合均成功转化酵母菌。转入pGBKT7和pNC‑GADT7‑ShPR10组合、pGBKT7‑P1 和pNC‑GADT7组合的酵母菌与阴性对照组（pGBKT7‑Lam和 pGADT7‑T组合）一样，在SD/‑Trp/‑Leu/‑His/‑Ade/X-α-Gal培养基上不生长，表明pNC‑GADT7‑ShPR10和pGBKT7‑P1质粒无自激活活性。转入pGBKT7‑P1和pNC‑GADT7‑ShPR10组合的酵母菌和阳性对照（pGBKT7‑53和 pGADT7‑T组合）一样在SD/‑Trp/‑Leu/‑His/‑Ade/X-α-Gal培养基上长出蓝色菌落，表明ShPR10在酵母细胞中与P1互作。

图8 Y2H验证ShPR10与SCSMV P1的互作Fig. 8 Verification of the interaction between ShPR10 and SCSMV P1 by Y2H assay

BiFC试验结果显示（图9），含pNC‑BiFC‑Ecn‑ShPR10和pNC‑BiFC‑Enn‑P1质粒的农杆菌共注射烟草，在烟草细胞中产生绿色荧光信号，而阴性对照组（pNC‑BiFC‑Ecn和pNC‑BiFC‑Enn‑P1组合、pNC‑BiFC‑Ecn‑ShPR10和pNC‑BiFC‑Enn组合）无荧光信号。以上结果表明ShPR10和P1在烟草细胞中互作。

图9 BiFC验证ShPR10与SCSMV P1的互作Fig. 9 Verification of the interaction between ShPR10 and SCSMV P1 by BiFC assay

2.5 ShPR10对SCSMV P1沉默抑制子活性的影响

为了分析ShPR10对P1沉默抑制子活性的影响，将携带pCam3304‑35S‑GFP、pNC‑Cam33FN‑P1和pNC‑Cam33HN‑ShPR10质粒的3种农杆菌混合后共注射本氏烟草叶片，以携带pCam3304‑35S‑GFP、pNC‑Cam33FN‑P1和pNC‑Cam33HN空质粒的3种农杆菌共注射为对照，注射4 d后在紫外灯下观察GFP荧光强度。结果显示，对照组注射区域表现出很强的GFP荧光（图10‑A，右下），证明P1具有沉默抑制子活性，而pCam3304‑35S‑GFP、pNC‑Cam33FN‑P1和pNC‑Cam33HN‑ShPR10共注射区域的GFP荧光强度明显减弱（图10‑A，左下），表明ShPR10削弱了P1的沉默抑制子活性。此外，为了说明ShPR10本身不具有沉默抑制子活性，将携带pCam3304‑35S‑GFP、pNC‑Cam33HN‑ShPR10和pNC‑Cam33FN空质粒的3种农杆菌共注射烟草叶片，结果观察到非常微弱的GFP荧光（图10‑A，上中），说明ShPR10不具有沉默抑制子活性。

图10 ShPR10对SCSMV P1沉默抑制子活性的影响Fig. 10 Effect of ShPR10 on the activity of SCSMV P1 silencing suppressor

Western blot检测注射区域的蛋白水平（图10‑B）显示，pCam3304‑35S‑GFP、pNC‑Cam33FN‑P1和pNC‑Cam33HN‑ShPR10共注射区域的GFP蛋白水平低于对照组，这与图10‑A中该区域的GFP荧光强度弱于对照组的结果相一致。Flag抗体检测P1蛋白水平，结果显示该区域中P1的蛋白水平与对照组相比无明显差异。HA抗体检测ShPR10蛋白水平，结果显示该区域ShPR10正常表达。以上结果说明，ShPR10的表达削弱了P1的沉默抑制子活性，但对P1蛋白的含量无明显影响。

3 讨论

3.1 ShPR10具有PR10的基本特征和P‑loop基序

PR10蛋白具有分子量在17-22 kD、等电点呈酸性、不含信号肽、定位于胞内等特征［3,20］。本研究克隆获得的甘蔗ShPR10基因，其编码蛋白分子量为21.17 kD，等电点为4.77，无信号肽，定位于细胞质和细胞核，符合PR10的基本特征。大部分PR10蛋白含有一个以“GxGGxG”为序列特征的P‑loop基序，该基序与核酸酶活性密切相关［1］。从草莓（Fragaria ananassa）［21］、辣椒［4］、葡萄（Vitis vini‑fera L.）［22］、玉米［23］、花生（Arachis hypogaea L.）［24］、牛茄子（Solanum surattense）［25］、麻风树（Jatropha curcas）［26］和可可树（Theobroma cacao）［27］中分离到的PR10蛋白都具有一个P‑loop基序，体外实验也都证实这些PR10蛋白具有核酸酶活性。PR10的核酸酶活性对于植物抵御病原微生物入侵至关重要。辣椒CaPR10具有核酸酶活性，能对入侵的病毒RNA进行切割，从而起到抗病毒的作用［4］。可可树利用其编码蛋白TcPR10的核酸酶活性降解可可丛枝病菌（Moniliophthora perniciosa）的RNA，从而发挥抗菌作用［27］。花生AhPR10具有核酸酶活性，能抑制尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）和立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）的生长，将AhPR10的第54位氨基酸由赖氨酸突变成天冬酰胺后，AhPR10的核酸酶活性和抗菌作用均消失，表明AhPR10的核酸酶活性对其抗菌作用至关重要［24］。本研究从甘蔗中克隆获得的ShPR10基因，其编码蛋白含有一个P‑loop基序，推测该蛋白具有核酸酶活性，可能在甘蔗抵抗病原微生物入侵过程中发挥作用。

3.2 ShPR10定位在细胞质和细胞核

PR10蛋白家族成员众多，在亚细胞水平的分布也多种多样［3］。例如，辣椒［28］、玉米［23］和大豆（Glycine max）［29］编码的PR10蛋白定位在细胞质中；杨树（Populus simonii×P. nigra）［30］和刚毛柽柳（Tamarix hispida）［31］编码的PR10蛋白定位在细胞核上；人参（Panax ginseng C. A. Meyer）编码的PgPR10‑1蛋白在细胞质和细胞核中均有分布［32］；葡萄编码的VpPR10.2蛋白主要分布在细胞壁、细胞质和叶绿体，在细胞核中也有少量分布［22］；花旗松（Pseudotsuga menziesii）编码的DF‑PR10蛋白定位在细胞壁和细胞质中［33］；罂粟（Papaver somniferum）编码的PR10蛋白Ps‑NCS2定位在内质网上［34］。本研究对甘蔗ShPR10蛋白进行亚细胞定位分析，结果显示ShPR10定位在细胞质和细胞核中，与人参PgPR10‑1蛋白的亚细胞定位相同。蛋白的功能与其所在的亚细胞位置密切相关，相同亚细胞定位的PR10蛋白可能行使相似的生物学功能。人参PgPR10‑1蛋白能增强植株对假单胞菌（Pseudomonas syringae）、尖孢镰刀菌和贵腐霉菌（Botrytis cinerea）的抗性［32］，由此推测甘蔗ShPR10蛋白可能也具有抗菌活性。

3.3 ShPR10与SCSMV P1互作并削弱P1的沉默抑制活性

RNA沉默是植物抵抗病毒侵染的重要机制［35］。为了对抗这一机制，病毒进化出RNA沉默抑制子来干扰植物的RNA沉默［36］。而植物又可通过其编码蛋白与病毒RNA沉默抑制子相互作用，削弱抑制子的沉默抑制活性，进而增强植株对病毒的抗性［19,37-38］。例如，玉米编码的紫黄质脱环氧化酶ZmVDE与甘蔗花叶病毒（Sugarcane mosaic virus,SCMV）编码的HC‑Pro抑制子互作并削弱HC‑Pro的抑制子活性，从而减少SCMV在植物体内的积累［19］；烟草编码的钙调素样蛋白rgs‑CaM与多种病毒编码的RNA沉默抑制子的dsRNA结合区域结合，并通过自噬样蛋白降解途径降解RNA沉默抑制子，从而削弱RNA沉默抑制子的活性，增强寄主对病毒的抗性［37］；甜橙（Citrus sinensis）编码的脱水素蛋白CtCOR15与柑橘衰退病毒（Citrus tristeza virus,CTV）编码的p20抑制子互作，CtCOR15蛋白的表达削弱了p20的沉默抑制活性［38］。本课题组前期以SCSMV编码的RNA沉默抑制子P1为诱饵，从甘蔗cDNA文库中筛选获得一个与P1互作的甘蔗ShPR10蛋白［15］。本研究利用Y2H和BiFC技术进一步证实了P1和ShPR10的互作关系。此外，本研究还分析了ShPR10对P1沉默抑制活性的影响，结果显示ShPR10的表达削弱了P1的沉默抑制活性，但对P1蛋白的含量无明显影响，表明ShPR10不是通过改变P1蛋白的含量来影响P1的沉默抑制活性。RNA沉默抑制子可以通过结合siRNA、dsRNA和RNA沉默通路上的关键蛋白来发挥其抑制作用，ShPR10与P1的互作可能阻碍了P1与siRNA、dsRNA和RNA沉默通路蛋白的结合，从而削弱P1的沉默抑制活性［39］。