康替唑胺、利奈唑胺对革兰阳性菌的体外抗菌活性及生物被膜抑制机制

曹心怡，沈宗霖，李桂秋，林志伟，郑金鑫，余治健，魏影，4

1 佳木斯大学临床医学院，黑龙江佳木斯 154003；2 华中科技大学协和深圳医院深圳市内源性感染重点实验室；3 华中科技大学协和深圳医院检验医学中心；4 黑龙江省卫生健康管理服务评价中心

2021 中国细菌耐药性监测结果显示，在革兰阳性菌中金黄色葡萄球菌位居分离菌首位，其次为粪肠球菌［1］。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）是金黄色葡萄球菌中常见的多药耐药菌，被称为超级细菌，其毒力比普通金黄色葡萄球菌强且在不同地区之间的克隆型存在差异［2］。金黄色葡萄球菌感染人体可引起菌血症，严重时可能危及生命；粪肠球菌能够引起感染性心内膜炎，长期定居在肠道可增加肝癌发生风险［3-4］。生物被膜指附着于有生命或无生命物体表面被蛋白质、多糖、DNA 等细菌胞外大分子包裹的有组织的细菌群体，对抗生素和宿主免疫防御机制的抗性很强。革兰阳性菌表面蛋白聚集形成生物被膜后可附着于医疗器械表面难以清除，从而通过导尿管、假肢关节等感染人体。康替唑胺、利奈唑胺属于新型恶唑烷酮类抗生素，近年来逐步应用于感染治疗［5］。研究发现，康替唑胺对革兰阳性菌抗菌效果高于一般抗生素，药代动力学及药效学参数显示康替唑胺对多重耐药阳性菌具有抗菌活性［6］。利奈唑胺与常见抗生素连用可增加抗菌活性，例如利奈唑胺与万古霉素联合治疗可有效降低儿童肺部金黄色葡萄球菌感染，且不良反应少［7］。我们在前期研究中对抗生素进行筛选时发现，恶唑烷酮抗生素对革兰阳性菌抗菌活性强并可在亚抑菌浓度下抑制细菌生物被膜形成。因此，2022年9月—2023 年5 月我们进一步研究了康替唑胺、利奈唑胺对常见革兰阳性菌金黄色葡萄球菌、粪肠球菌的体外抗菌活性及对生物被膜的影响，并通过蛋白质组学初步探究其机制，旨在为临床研究提供治疗指导及对抗生素药物的研究提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 主要材料 45 株金黄色葡萄球菌临床菌株、34 株粪肠球菌临床菌株，其中YUSA145 为MRSA、CHS101 为甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌（MSSA），分别来自2015—2018 年华中科技大学协和深圳医院收集的不同住院患者，剔除同一患者不同部位分离的重复菌株。所有菌株均使用Phoenix 100 自动微生物鉴定系统鉴定，并在实验前平板连续传代培养后经基质辅助激光解吸电离/飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）对所有菌株进行重新鉴定。康替唑胺（HY-19915-117216）、利奈唑胺（HY-10394-44240）均购自美国MCE 公司。质量控制菌株金黄色葡萄球菌ATCC29213 和粪肠球菌ATCC29212 均购自ATCC 菌株库。Phoenix-100 全自动细菌鉴定及药敏系统购自美国BD 公司，全自动生物质谱检测系统IVD MALDI Biotyper 购自德国布鲁克公司，全自动生长曲线分析仪购自芬兰Bioscreen公司，Q Exactive Plus 液质联用仪购自美国Thermofisher Scientific 公司，RIPA 裂解液购自上海翌圣生物科技股份有限公司，阳离子调节MH 肉汤（CAMHB）、胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）均购自英国OXOID公司。

1.2 康替唑胺、利奈唑胺对革兰阳性菌的体外抗菌活性观察 采用微量肉汤稀释法。取平台期金黄色葡萄球菌临床菌株及标准株ATCC29213、粪肠球菌临床菌株及标准株ATCC29212，使用TSB 将其调整至600 nm 处光密度值（OD600）=0.1，在96 孔板中分别加入100 µL 浓度梯度的康替唑胺、利奈唑胺及100 µL 经CAMHB 培养基1∶1 000 稀释的菌液，使药物浓度梯度分别为16.000 00、8.000 00、4.000 00，2.000 00、1.000 00、0.500 00、0.250 00、0.125 00、0.062 50、0.031 25 µg/mL。实验中另外设置只加细菌的阳性对照及只加培养基的阴性对照。37 ℃温箱培养20～24 h 后观察结果，若肉眼不见任何细菌沉淀即为该抗生素对应的最小抑菌浓度（MIC）值。MIC 值越小代表药物抗菌活性越好，结果根据美国临床和实验室标准协会指南（CLSI）进行判定。

1.3 康替唑胺、利奈唑胺对革兰阳性菌生物被膜的影响观察

1.3.1 康替唑胺、利奈唑胺药物作用浓度筛选 分别取MRSA YUSA145、MSSA CHS101 及粪肠球菌16C51 各100 µL 过夜，使用TSB 培养基1∶100 稀释菌液，分别加入100 µL 康替唑胺及利奈唑胺，使其最终浓度为0、1/8×MIC、1/4×MIC、1/2×MIC 及1×MIC。使用全自动生长曲线分析仪每间隔1 h，连续24 h 测定OD600，代表不同药物浓度下细菌的生长情况。生长曲线结果显示，康替唑胺、利奈唑胺浓度达到1×MIC 时细菌生长被完全抑制，在1/2×MIC 浓度并未对细菌生长产生影响。

1.3.2 康替唑胺、利奈唑胺对革兰阳性菌生物被膜形成的影响观察 采用结晶紫染色。分别取6 株MRSA、MSSA及粪肠球菌各100 µL 过夜，加入用TSBG（2% GLU+TSB）培养基1∶200 稀释菌液，添加终浓度为1/8×MIC、1/4×MIC、1/2×MIC 抗生素，只添加菌液作为对照。37 ℃培养箱中孵育24 h 后，弃去培养基，用无菌水冲洗3 次，干燥后甲醇固定10 min，0.5% 结晶紫染液染色15 min。流水冲洗至无色，室温下晾干。使用酶标仪测定570 nm 处的OD值，OD570值即代表生物被膜量。

1.3.3 康替唑胺、利奈唑胺对革兰阳性菌生物被膜内细菌存活率的影响观察 12 孔板中加入1 mL TSBG 培养基稀释的MSSA CHS101 及粪肠球菌16C51，添加终浓度为1/8×MIC的康替唑胺、利奈唑胺，只添加菌液作为对照。37 ℃培养箱中孵育24 h后，弃去培养基，PBS 洗涤，使用刮刀刮掉黏附在底部的生物被膜并收集，用无菌生理盐水进行梯度稀释后涂板，分别在12、24 h后进行菌落计数。

1.4 康替唑胺、利奈唑胺抑制革兰阳性菌生物被膜的机制分析

1.4.1 康替唑胺、利奈唑胺作用下革兰阳性菌生物被膜差异表达蛋白筛选 取平台期细菌MRSA YUSA145 接种到15 mL TSBG 培养基，康替唑胺组及利奈唑胺组分别予以1/4×MIC 康替唑胺、利奈唑胺处理，对照组加同等体积DMSO，37 ℃静置培养16 h，刮刀收集形成的生物被膜，5 000 r/min 离心5 min。1 mL PBS 水洗3 次，弃去上清后转移至1.5 mL EP管。将添加蛋白酶抑制剂Cocktail的RIPA裂解缓冲液及直径为0.1 mm 的磁珠加入含有细菌菌体的EP管。使用破碎仪裂解菌体，破碎60 s 后中止10 s，重复操作4 次。离心机4 ℃、12 000×g 离心20 min，吸出上清液进行BCA 蛋白浓度测定。收集100 µg 蛋白质加入10 mmol/L DTT 中，放置于70 ℃，经过1 h还原后，暗处加入50 mmol/L碘乙酰胺烷基化15 min。连续3次使用100 µL 0.5 mol/L碳酸氢铵脱盐，使用Amicon 超离心过滤器过滤。总蛋白按照1∶50 加入胰蛋白酶并在37 ℃下消化过夜，冻存在-80 ℃，用LC-MS/MS 三重串联液质联用仪根据离子带电荷状态对三组所含蛋白质进行定性、定量分析［8］。利用Proteome Discoverer 2.4 和Sequest HT 与金黄色葡萄球菌（Strain NCTC 8325/PS 47）的Uniprot 蛋白组比对进行蛋白鉴定和定量。在至少两个技术重复中，与对照组同蛋白表达变化2 倍以上且P＜0.05 可确定为上调和下调的差异表达蛋白。

1.4.2 差异表达蛋白的功能分析 将差异表达蛋白上传到OMICSBEAN 数据库（http：//www. omicsbean.com）进行基因本体（GO）功能注释及京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路分析。利用STING对蛋白质相互作用网络（PPI）进行分析，观察蛋白之间的相互作用关系。

1.5 统计学方法 采用SPSS23.0 统计软件及GraphPad Prism（8.0.2）绘图软件。计量资料采用K-S 检验进行正态性分析，符合正态分布的资料以-x±s表示，组间比较行独立样本t检验，计数资料以n（%）表示，组间比较行χ2检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 康替唑胺、利奈唑胺对革兰阳性菌的体外抗菌活性 康替唑胺对金黄色葡萄球菌的MIC 主要为1、2、4 µg/mL，对粪肠球菌的MIC主要为2、4 µg/mL。利奈唑胺对金黄色葡萄球菌的MIC主要为2、4 µg/mL，对粪肠球菌的MIC 主要为1、2、4 µg/mL。康替唑胺及利奈唑胺对两种革兰阳性菌抗菌活性主要集中在2 µg/mL，均≤4 µg/mL，提示抗菌活性较好。

2.2 康替唑胺、利奈唑胺对革兰阳性菌生物被膜的影响 生长曲线结果显示，康替唑胺、利奈唑胺在MIC 下完全抑制细菌生长，1/2 MIC 以下未对细菌生长造成任何影响。见OSID 码图1。在亚抑菌浓度下康替唑胺、利奈唑胺均导致MRSA YUSA145、MSSA CHS101 及粪肠球菌生物被膜含量下降（P均＜0.05），并且1/2×MIC 浓度时抑制生物被膜效果最显著，随着药物浓度降低抑制效果逐渐减弱。见OSID 码图2。1/8×MIC 浓度下康替唑胺、利奈唑胺处理降低了MSSA 及粪肠球菌生物被膜内细菌存活率（P均＜0.05），药物作用12、24 h时细菌生物被膜内细菌存活率没有统计学差异。见OSID码图3。

2.3 康替唑胺、利奈唑胺抑制革兰阳性菌生物被膜形成的机制 康替唑胺作用下革兰阳性菌生物被膜差异表达蛋白共有290个，其中165个表达上调、125个表达下调；利奈唑胺作用下革兰阳性菌生物被膜差异表达蛋白共有222个，其中120个表达上调、102个表达下调；差异蛋白主要涉及上调蛋白质生物合成相关蛋白rpmJ、rplE 等；下调表面蛋白SasG、群体感应蛋白luxS、丙氨酸脱氢酶1（ald1）、D-丙氨酸氨基转移酶等。GO注释分析显示，康替唑胺作用下差异表达蛋白主要与丙酮酸代谢过程、氨基酸代谢等过程相关；利奈唑胺作用下差异表达蛋白主要涉及嘧啶代谢过程、嘌呤代谢、氨基酸代谢等过程。KEGG 分析显示，康替唑胺作用下差异表达蛋白主要涉及萘降解、嘧啶代谢、糖酵解、核糖体切除修复等过程；利奈唑胺作用下差异表达蛋白主要涉及氨基酸降解、脂肪酸降解、嘌呤代谢、戊糖和葡萄糖磷酸盐转化过程。PPI 网络分析显示，两种抗生素作用下的差异表达蛋白主要与核糖体相关。见OSID码图4、5。

3 讨论

细菌的群体感应系统及外界环境改变均与生物被膜形成相关。细菌生物被膜的存在给医疗造成了极大危害，细胞外聚集物质促进细菌生物被膜形成，而生物被膜阻止细菌被中性粒细胞吞噬，导致临床治疗失败［9］。抗生素的出现使得生物感染率大大降低，对人类的生存有着巨大帮助，但是长期使用抗生素易引起细菌耐药，因此新型抗生素的研发尤为重要［10］。传统抗生素抑制生物被膜形成的效果不佳，恶唑烷酮是新型抑制细菌蛋白质合成的抗生素，康替唑胺、利奈唑胺作为新型恶唑烷酮抗生素，逐渐被引入临床治疗皮肤和软组织感染。研究表明，当MIC≤2 mg/L 时，每天给予脓毒血症患者600 mg 利奈唑胺可以在肺泡灌洗液中达到最佳治疗效果［11］。

本研究结果显示，恶唑烷酮类抗生素康替唑胺、利奈唑胺对常见革兰阳性菌金黄色葡萄球菌、粪肠球菌具有广谱抗菌活性，MIC≤4 µg/mL，即使对MRSA 多重耐药菌也显示出良好的抗菌活性。结晶紫染色结果显示，无论粪肠球菌还是MSSA，甚至MRSA，在亚抑菌浓度下两种抗生素均可导致细菌生物被膜含量下降，并且在1/2×MIC 时抑制生物被膜效果最显著，随着浓度降低抑制效果逐渐减弱，存在剂量依赖性，提示康替唑胺、利奈唑胺能够以剂量依赖的方式抑制革兰阳性菌生物被膜的形成。我们进一步选择MSSA CHS101 及粪肠球菌16C51，观察在康替唑胺、利奈唑胺1/8×MIC 浓度分别处理细菌12、24 h 后的生物被膜内细菌存活率，发现康替唑胺、利奈唑胺处理降低了MSSA CHS101 及粪肠球菌16C51 生物被膜内细菌存活率，但药物作用12、24 h时细菌生物被膜内细菌存活率没有统计学差异。这可能是因为两种抗生素仅仅在初期发挥抑制生物被膜作用，生物被膜形成能力较强的金黄色葡萄球菌、粪肠球菌经过12 h就已经形成了成熟的生物被膜。

为了分析康替唑胺、利奈唑胺抑制金黄色葡萄球菌生物被膜的作用机制，我们采用定量蛋白质组学分析1/4×MIC 康替唑胺、利奈唑胺作用下金黄色葡萄球菌生物被膜蛋白质变化。经过分析发现，康替唑胺组共有290 个差异表达蛋白；利奈唑胺组共有222 个差异表达蛋白，主要涉及上调rpmJ、rplE 等蛋白质生物合成相关蛋白，下调SasG、luxS、ald1、D-丙氨酸氨基转移酶等蛋白。康替唑胺、利奈唑胺处理后均降低sasG、群体感应系统luxS、ald1及D-丙氨酸氨基转移酶表达。生物被膜形成的第一过程是黏附，研究表明，表面蛋白SasG 不断聚集能够增加黏附细胞数量，从而促进生物被膜形成。携带SasG可促进细菌与鳞状鼻上皮细胞结合，从而促进细菌鼻腔定植［12］。ROCHE 等［13］研究显示，感染金黄色葡萄球菌患者血清SasG 蛋白抗体水平比未感染人群高。群体感应系统是微生物的通信系统，可因细菌群体密度改变而导致生理和代谢活动改变［14］。LuxS能够通过抑制金黄色葡萄球菌中转录因子Rbf 及细菌多糖细胞间黏附抑制细菌生物被膜的形成［15-16］。肽聚糖存在于革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的细胞壁中，ald1 为肽聚糖层的重要成分。药物压力下降低ald1，可能在细胞壁的合成中发挥作用。丙氨酸氨基转移酶是一种参与蛋白质代谢的酶，D-丙氨酸氨基转移酶能够通过催化α-酮酸，在维持细胞壁稳定性中发挥作用［17］。此外，康替唑胺、利奈唑胺处理金黄色葡萄球菌上调了rpmJ、rplE 等蛋白质生物合成相关蛋白，推测其原因为细菌处于应激状态时为了应对外界环境的变化，从而加速核糖体合成，因而蛋白质合成增加［18］。GO注释分析显示，两种药物的差异表达蛋白均与氨基酸代谢过程有关。细菌的生命活动、生物被膜形成离不开氨基酸代谢过程，当外界环境发生变化时，氨基酸代谢过程快速对此做出应答［19］。由上可见，康替唑胺及利奈唑胺可能通过抑制初级代谢相关过程、生物被膜形成相关基因及群体感应系统抑制细菌生物被膜形成，但是作用的具体靶点还需进一步探究。

综上所述，恶唑烷酮类抗生素康替唑胺、利奈唑胺对常见革兰阳性菌金黄色葡萄球菌、粪肠球菌表现出广谱抗菌活性，在亚抑菌浓度下可有效降低细菌生物被膜形成且减少已形成生物被膜中的细菌。通过生物被膜蛋白质组学分析显示，两种抗生素均对群体感性系统、氨基酸代谢及核糖体等代谢途径产生影响。通过对康替唑胺、利奈唑胺抗菌活性及生物被膜抑制作用的研究，可为临床抗生素的选择提供指导，对清除顽固生物被膜从而减少临床感染具有重要意义。