右美托咪定预处理对大鼠心肌缺血再灌注损伤的影响及其机制

杨雪儿，吴明潇，张超凡，贾隽文，胡春阳，温立勇，李罡，金莲锦

1 牡丹江医学院第一临床医学院，黑龙江牡丹江 157000；

2 牡丹江医学院附属红旗医院麻醉科；3 牡丹江医学院附属红旗医院骨外科

冠状动脉粥样硬化性心脏病（CAD）是冠状动脉血管发生动脉粥样硬化病变而引起血管腔狭窄、阻塞，造成心肌缺血缺氧或坏死而导致的心脏病，主要病理表现为缺血再灌注引起的心肌损伤。目前，尚无有效的治疗方法来保护心脏免受心肌缺血再灌注损伤（MIRI），因此有必要寻找预防MIRI 的新策略，以改善CAD 患者的临床结局。右美托咪定（Dex）是α2肾上腺素受体激动剂，具有镇静作用；近期研究发现Dex可以通过多种途径缓解包括心脏在内的重要器官缺血再灌注损伤［1］。环磷酸腺苷（cAMP）激活的交换蛋白分子Epac1是cAMP的直接靶向蛋白，通过激活Ras 蛋白家族成员Ras 样小GTP 酶Rap1，促进Rap1上无活性的GDP转换为具有活性的GTP，从而调节细胞相关功能［2］。研究发现，当Epac1信号通路被激活时，大鼠慢性MIRI 加重，并增加了大鼠心肌梗死面积，推测其机制与Epac1/Rap1信号通路的抗氧化作用有关［3］。基于此，本研究于2022年9月—2023 年3 月观察了Dex 预处理对大鼠MIRI 的影响并通过Epac1 拮抗剂ESI09 阻断Epac1/Rap1 信号通路，分析该机制是否与氧化应激反应及Epac1/Rap1信号通路有关，以期为Dex 在CAD 中的临床应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 主要材料 健康成年SD 雄性大鼠32 只，体质量225～265 g，购自牡丹江医学院，实验动物许可证号SCXK（黑）2019-003，符合中国动物护理和使用指南。大鼠均饲养在21～25 ℃鼠舍，相对湿度45%～55%，相同光照下自由饮水、进食。Dex（批号：22022317，四川美达康华康公司），Epac1 拮抗剂ESI09（批号：263707-16-0，美国Selleck 公司），Epac1、Rap1 蛋白（批号：A4149、A0975，美国ABclonal 公司），苏木素—伊红（HE）染色剂（批号：C0107，Beyotime 公司），超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、乳酸脱氢酶（LDH）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）ELISA试剂盒（批号：23-03-01，北京诚林生物公司），HX-300型动物呼吸机（成都泰盟科技有限公司）。

1.2 动物分组及Dex 预处理 SD 大鼠随机分为假手术组、模型组、Dex组、抑制剂组，每组8只，大鼠禁食、禁水24 h。Dex 组在建模前30 min 腹腔注射Dex 25 µg/kg，抑制剂组在建模前30 min 及25 min 时分别给予Epac1拮抗剂ESI09 5 mg/kg［4］及Dex 25 µg/kg，假手术组、模型组在建模前30 min 给予相同剂量的生理盐水。

1.3 MIRI 模型建立 除假手术组外，各组均建立MIRI模型。通过腹腔注射1%戊巴比妥钠50 mg/kg麻醉大鼠，取仰卧位，进行气管插管，使用小动物呼吸机进行机械通气，监测心跳以及心肌缺血开始时的心电图变化。按照参考文献进行建模［5］，在大鼠左侧胸骨约第4肋间打开胸腔，找到心脏和血管，分离心包膜，结扎冠脉左前降支引起心肌缺血，心电图表现为T 波高耸、ST 段明显抬高及左心室尖和前壁变白提示心肌缺血模型制备成功。松开结扎线进行再灌注，持续2 h。心电图显示T 波恢复、ST 段下降50%及左心室尖和前壁变红提示再灌注成功。假手术组胸腔暴露后，心脏仅穿线而不结扎左冠状动脉。

1.4 心肌组织病理学观察 采用HE染色。选取部分心肌组织，在4%多聚甲醛中固定24～72 h，脱水包埋切片，进行HE 染色，封片后用带有照相功能的光学显微镜观察采集图像，每张切片选择2个视野。

1.5 血清心肌损伤及氧化应激指标检测 采用ELISA法。取各组大鼠腹主动脉血5 mL，静置10 min，3 500 r/min离心15 min分离血清，放置于-80 ℃冰箱保存，按照ELISA试剂盒要求检测血清心肌损伤标志物CK-MB、LDH及氧化应激指标MDA、SOD。

1.6 心肌组织Epac1/Rap1 信号通路相关蛋白检测 采用Western blotting法。取各组心肌组织20 mg，参照文献［6］方法加入裂解液裂解研磨提取总蛋白，离心取上清液，测定蛋白浓度，经凝胶电泳分离后，转移至PVDF 膜上，用5%的封闭液室温封闭2 h，加入Epac1、Rap1 及β-action 一抗稀释，4 ℃孵育过夜，第2 天洗膜加入相应二抗稀释，室温下摇床中作用1 h，TBST 洗4 次，每次15 min，ECL 避光显色2 min，置于全自动化学发光图像分析系统进行扫描。以β-action作为内参，以目的条带与对照条带灰度比值作为目的蛋白相对表达量。

1.7 统计学方法 采用SPSS25.0 统计软件。计量资料采用Shapiro-Wilk 方法行正态性检验，符合正态分布且方差齐性的计量资料以-x±s表示，组间比较采用最小显著性差异法（LSD）检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组心肌组织病理学比较 假手术组心肌纤维排列整齐、边缘清晰，未见心肌纤维断裂和细胞间质肿胀；模型组心肌纤维出现断裂，排列紊乱、边界模糊，有明显中性粒细胞浸润，细胞间质肿胀明显；Dex 组与抑制剂组心肌纤维断裂、中性粒细胞浸润减少、间质肿胀均减轻。

2.2 各组血清心肌损伤标志物CK-MB、LDH比较假手术组、模型组、Dex 组、抑制剂组血清CK-MB 分别为（17.95 ± 0.24）、（23.28 ± 0.32）、（20.32 ±0.28）、（19.18 ± 0.33）ng/mL，血清LDH 分别为（31.69 ± 0.27）、（40.11 ± 0.44）、（39.59 ± 0.55）、（38.50 ± 0.60）ng/L；血清CK-MB、LDH 模型组＞Dex组＞抑制剂组＞假手术组（P均＜0.05）。

2.3 各组血清氧化应激指标MDA、SOD 比较 假手术组、模型组、Dex 组、抑制剂组血清MDA 分别为（4.31 ± 0.09）、（5.17 ± 0.07）、（4.73 ± 0.13）、（4.52 ± 0.33）nmol/L，血清SOD 分别为（177.91 ±2.89）、（137.62 ± 2.90）、（156.91 ± 1.55）、（162.04 ±1.78）ng/L；血清MDA 模型组＞Dex 组＞抑制剂组＞假手术组，血清SOD假手术组＞抑制剂组＞Dex组＞模型组（P均＜0.05）。

2.4 各组心肌组织Epac1/Rap1信号通路相关蛋白表达比较 假手术组、模型组、Dex 组、抑制剂组心肌组织Epac1 蛋白表达分别为0.39 ± 0.07、0.89 ±0.06、0.72 ± 0.03、0.54 ± 0.10，心肌组织Rap1蛋白表达分别为0.05 ± 0.03、1.02 ± 0.01、0.83 ± 0.04、0.63 ± 0.05；心肌组织Epac1、Rap1蛋白表达模型组＞Dex组＞抑制剂组＞假手术组（P均＜0.05）。

3 讨论

缺血性心脏病是因冠状动脉狭窄、供血不足而引起的心脏功能障碍及器质性病变，在病理条件下，组织中常发生缺血再灌注损伤。缺血性损伤主要由厌氧性细胞死亡和再灌注引起，导致广泛的氧化应激反应，这些反应能够增加组织损伤，甚至损害整个机体。此外，缺血再灌注损伤还可以在心血管疾病的治疗过程中加重原始疾病。因此，寻找预防和改善MIRI的方法并了解其相关机制，对减少患者并发症发生率及病死率，改善患者的预后和生活质量具有重要意义。目前临床中治疗缺血性心脏病最有效的方式是恢复的心肌血液供应从而实现再灌注，常用的方法包括溶栓治疗［7］、动脉搭桥手术［8］、经皮腔内冠状动脉成形术［9］等，但仍有许多患者在治疗后因MIRI导致预后不良［10］。因此，有必要在恢复心肌血液供应的同时探索能够减轻缺血再灌注损伤的方法，以提高缺血性心脏病治疗的有效性［11］。本研究通过构建大鼠MIRI 模型并给予Dex 预处理发现，与Dex 组比较，模型组的心肌组织出现明显的病理损伤，同时血清心肌损伤标志物CK-MB、LDH 的水平升高，提示Dex 腹腔注射预处理能够减轻缺血再灌注引起的心肌组织损伤。

Dex 具有镇静、镇痛、抗交感神经系统活性、心血管稳定性、减少术后谵妄等作用，且没有剂量依赖性，不会产生呼吸抑制，因此广泛应用于临床麻醉［12］。ZHANG 等［13］研究显示，Dex 能够通过抗氧化应激、抗炎、抗凋亡等机制发挥器官保护作用。本研究结果显示，与假手术组比较，模型组氧化应激指标MDA 水平升高，SOD 水平降低。在给予Dex 预处理后，MDA 水平有所降低，SOD 水平升高，提示Dex 可降低心肌缺血再灌注的氧化应激程度，从而减轻心肌损伤。临床研究表明，Dex 的交感神经溶解活性能够通过降低代谢和预防心动过速来降低心肌耗氧量，在心脏手术过程中可降低患者血流动力学异常的风险［14］，同时使接受非心脏手术的心脏病患者受益，减少患者术后并发症发生率［15］。此外，Dex 在脑、肺脏、肝脏及胃肠道等器官中也可起到保护作用，但具体作用机制尚不明确。

Epac1/Rap1 是cAMP 信号通路中的关键途径，Epac 存在Epac1、Epac2 两种亚型，两者的表达谱因其组织类型和发育阶段不同而有所不同。例如，Epac1 主要在心脏、肾脏、血管、脂肪组织、中枢神经组织和子宫中发现，而Epac2 在中枢神经、胰腺和肾上腺中大量表达［16-17］。研究发现，Epac1/Rap1 通路与炎症和氧化应激调节有关，同时Epac1/Rap1信号通路在MIRI中发挥作用，被认为是心血管疾病的潜在治疗靶点［18］。当心肌缺血再灌注发生时，cAMP激活交换蛋白Epac1 及其下游的Rap1，导致氧化应激反应的发生，从而加重心肌损伤［19］。基于此，本课题组提出一种假设，即Dex 可能通过调节Epac1/Rap1 通路减轻氧化应激反应来发挥心肌保护作用。本研究在MIRI 大鼠模型中发现，大鼠心肌组织中Epac1、Rap1 蛋白的表达升高；给予Dex 预处理的大鼠心肌组织中的Epac1、Rap1 蛋白表达较模型组减少；而给予Dex 联合Epac1 特异性抑制剂ESI09 处理后，大鼠心肌组织中Epac1、Rap1蛋白表达进一步减少，心肌损伤减轻，氧化应激反应得到改善。这提示Dex 可能通过抑制Epac1/Rap1 信号通路的激活减轻氧化应激反应，这为Dex 抑制MIRI 提供了进一步的证据。

综上所述，Dex 预处理对大鼠MIRI 具有抑制作用，其机制可能与激活Epac1/Rap1信号通路减轻心肌组织氧化应激有关。然而我们的研究尚有一些局限性，我们没有探索Epac1 在MIRI 过程中的具体调控机制，需要进一步的研究来确定Dex 通过影响Epac1所发挥的治疗潜力。