肝细胞癌组织中长链非编码RNA HOXA-AS2的表达及其临床意义

陈 霞 张莉莉

肝细胞癌（HCC）是常见的消化系统肿瘤，其具有预后较差、复发率较高、病死率较高的特点[1-2]。HCC 的发生和进展可归因于多种因素，如HBV 感染等[3]。近年来，手术切除和化学治疗已成为治疗HCC 的重要手段，但HCC 的发病率和病死率仍然较高[4]。因此，迫切需要研发更多有效的治疗方法。

长链非编码RNA（lncRNA）的长度超过200个核苷酸，其在包括肿瘤在内的多种疾病的进展过程中发挥重要作用。研究表明，多种lncRNA 在HCC 组织中异常表达，其可被视为诊断HCC 的生物标志物和潜在的治疗靶点[5]。此外，lncRNA 表达失调也被认为与多种生物学过程有关，包括细胞生长、迁移、凋亡和分化。lncRNA HOXA-AS2（下文简称HOXA-AS2）的长度为1 048 bp，其位于HOXA基因簇中HOXA3 基因与HOXA4 基因之间。研究发现，HOXA-AS2 在胃癌、结直肠癌等患者中表达上调[6-7]。Zhang 等[8]的研究发现，HOXA-AS2在HCC 组织和细胞株中表达上调。基于此，本研究分析HCC 组织中HOXA-AS2 的表达水平与患者预后的关系，以期探索预测HCC 患者预后的生物标志物。

1 研究对象与方法

1.1 研究对象

前瞻性选择2017 年5 月至2019 年5 月在南京医科大学附属淮安第一医院进行手术切除治疗的116 例HCC 患者作为研究对象，其中男性70 例，女性46 例；年龄39 ～70 岁，平均年龄为（54.56±13.07）岁；根据Edmondson 分级标准[9]，其中Ⅰ～Ⅱ级55 例，Ⅲ～Ⅳ级61 例；根据TNM分期标准，Ⅰ～Ⅱ期50 例，Ⅲ～Ⅳ期66 例。收集术中的肿瘤组织及癌旁正常组织（距离肿瘤组织边缘＞3 cm）标本，于采集后30 min 内用液氮迅速冷冻，并置于-80 ℃的冰箱中保存。纳入标准：（1）根据《原发性肝癌规范化病理诊断指南（2015 年版）》[10]中的诊断标准，经病理检查确诊为HCC；（2）术前未接受任何治疗；（3）临床资料完整；（4）未合并其他恶性肿瘤。排除标准：（1）合并心、肾等其他重要器官功能不全；（2）合并自身免疫病。本研究经医院医学伦理委员会批准，且所有受试者及家属均签署知情同意书。

1.2 HOXA-AS2 表达水平检测

采用实时荧光定量PCR 法检测组织中HOXAAS2 的表达水平。在无菌环境中将肿瘤组织及癌旁正常组织标本剪碎并研磨，4 000 r/min 离心15 min，取上清液。使用TRIzol 试剂盒提取上清液中的总RNA，并通过紫外分光光度计测定其纯度；使用反转录试剂盒（购自日本TaKaRa 公司）将其反转录为cDNA；之后进行PCR 扩增。反应体系：cDNA产物2 μL，2×SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ 8 μL，上、下游引物各1 μL，50×ROX Reference Dye 0.4 μL，RNase-Free H2O 7.6 μL。反应条件：95 ℃预变性2 min；之后94 ℃ 30 s、59 ℃ 20 s、72 ℃ 40 s，共40 个循环。以GAPDH 作为内参，采用2-△△Ct法计算HOXA-AS2 的相对表达量。引物序列如表1 所示。

表1 引物序列

1.3 临床资料收集和随访

收集所有入组患者的性别、年龄、TNM 分期、Edmondson 分级、肿瘤直径、肿瘤数目、血清甲胎蛋白（AFP）水平、乙型肝炎病史、分化程度及淋巴结转移情况等信息。

采用电话和门诊复查的方式对入组患者进行为期3 年的随访，所有患者于出院1 个月后开始随访，每3 个月随访1 次，随访截止时间为2022 年5月，终点事件为患者死亡。

1.4 统计学方法

应用SPSS 21.0 软件进行统计学分析。符合正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用独立样本t检验。计数资料以例（%）表示，组间比较采用χ2检验。采用Kaplan-Meier 法分析HOXA-AS2 的表达水平与HCC 患者术后生存期的关系。采用Cox 比例风险回归模型分析影响HCC 患者术后生存率的危险因素。P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HCC 组织和癌旁正常组织中HOXA-AS2 的表达水平比较

PCR 法结果显示，HCC 组织中HOXA-AS2 的相对表达量为3.45±0.51，显著高于癌旁正常组织（1.06±0.09），差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.2 HOXA-AS2 的表达水平与HCC 患者临床病理特征的关系

以HOXA-AS2 相对表达量的中位数（3.06）为临界值，将HCC 患者分为HOXA-AS2 高表达（＞3.06）组和HOXA-AS2 低表达（≤3.06）组，结果显示与HOXA-AS2 低表达组相比，HOXA-AS2高表达组中Edmondson 分级为Ⅲ～Ⅳ级者、TNM分期为Ⅲ～Ⅳ期者、有乙型肝炎病史者、中低分化者、有淋巴结转移者的占比较高，差异均有统计学意义（P均＜0.05）。2 组的年龄、性别、肿瘤直径、肿瘤数目及血清AFP 水平差异均无统计学意义（P均＞0.05）。见表2。

表2 HOXA-AS2 的表达水平与HCC 患者临床病理特征的关系/例（%）

2.3 HOXA-AS2 的表达水平与HCC 患者预后的关系

随访结果显示，HOXA-AS2 高表达组术后3 年存活24 例，生存率为38.10%；HOXA-AS2 低表达组术后3 年存活37 例，生存率为69.81%。HOXAAS2 高表达组术后3 年生存率显著低于HOXA-AS2低表达组，差异有统计学意义（log-rankχ2=10.764，P＜0. 001）。见图1。

图1 HOXA-AS2 的表达水平与HCC 患者生存情况的关系

2.4 影响HCC 患者术后生存的相关因素

将116 例HCC 患者的预后生存情况作为因变量，将患者的年龄、性别、Edmondson 分级、TNM分期、肿瘤直径、肿瘤数目、乙型肝炎病史、分化程度、淋巴结转移、血清AFP 及HOXA-AS2 作为自变量，纳入单因素Cox 回归分析，结果显示Edmondson 分级、TNM 分期、乙型肝炎病史、分化程度、淋巴结转移及HOXA-AS2 均与患者的预后生存率有关（P均＜0.05）。将116 例HCC 患者的预后生存情况作为因变量，将单因素分析中P＜0.05 的项目作为自变量，纳入多因素Cox 回归分析，结果显示Edmondson 分级、TNM 分期、分化程度、淋巴结转移及HOXA-AS2 均是影响HCC 患者术后生存率的独立危险因素（P均＜0.05）。见表3。

表3 影响HCC 患者术后生存率的单因素和多因素Cox 比例风险回归模型分析

3 讨论

HCC 是一种常见的恶性肿瘤，也是一个全球范围内重要的公共卫生问题，其具有较高的复发率和病死率[11-12]。目前HCC 的诊断、治疗及预后情况仍不令人满意。因此，寻找有效的预后生物标志物具有重要意义。Xu 等[13]的研究发现，晚期HCC 患者的肿瘤细胞中lncRNA SHRG 高表达，而敲减SHRG基因会抑制HCC 细胞的增殖和迁移能力。Zhu 等[14]的研究表明，lncRNA BRM 的表达水平与HCC 患者的病情严重程度相关。另有研究发现，lncRNA Sox4 可以调节信号转导与转录激活因子3（STAT3）的表达水平，其对于HCC 细胞的自我更新及HCC的发生和进展具有重要意义[15]。因此，lncRNA 与HCC 的发生、转移和预后不良有关，且部分lncRNA 已成为HCC 治疗的关键靶点。

研究表明，HOXA-AS2 可通过调节miR-216a-5p 的表达参与非小细胞肺癌的发生和进展[16]。Wang 等[17]的研究发现，HOXA-AS2 可作为miR-520c-3p 的竞争性内源RNA（ceRNA），促进骨肉瘤细胞的迁移和侵袭。Zhang 等[8]指出，HOXA-AS2可通过miR-520c-3p/GPC3 信号通路，促进HCC 细胞增殖并诱导上皮-间充质转化。目前有关HOXAAS2 对HCC 患者预后影响的报道较少。本研究结果显示，HCC 组织中HOXA-AS2 的相对表达量显著高于癌旁正常组织，这提示HOXA-AS2 参与了HCC 的发生过程。此外，本研究发现，HOXA-AS2高表达组中Edmondson 分级为Ⅲ～Ⅳ级者、TNM分期为Ⅲ～Ⅳ期者、有乙型肝炎病史者、中低分化者、有淋巴结转移者的占比均显著高于HOXA-AS2低表达组，这提示HOXA-AS2 参与了HCC 的进展过程，但其具体的病理、生理学机制仍需今后开展基础研究以进一步明确。

本研究的随访结果显示，HOXA-AS2 高表达组术后3 年生存率显著低于HOXA-AS2 低表达组，这提示HOXA-AS2 的表达水平与HCC 患者的预后相关。为避免混杂因素的影响，本研究通过Cox 比例风险回归模型分析影响HCC 患者预后的相关因素，结果显示Edmondson 分级、TNM 分期、分化程度、淋巴结转移均是影响HCC 患者术后生存率的独立危险因素，这与既往的研究结果相符[18]。此外，本研究还发现HOXA-AS2 同样是影响HCC 患者术后生存率的独立危险因素，这对于预防疾病复发具有一定的意义。

综上所述，HOXA-AS2 在HCC 组织中表达上调，且其对于患者的预后预测具有较高价值，其表达水平越高，提示患者的预后生存率越低。本研究存在一定的不足，如本研究为单中心研究，样本量偏少，结果存在一定的局限性。今后需开展多中心、大样本量的研究，以进一步验证本文结论。