血清长链非编码RNA CCAT1 对非酒精性脂肪性肝病患者肝纤维化及其程度的诊断价值

谷娟娟 丁 茹 周晓娜 周昌虎

非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）是全球较常见的慢性肝病，其发生和进展与胰岛素抵抗及遗传易感密切相关[1]，其病理特征是除肝脏损伤及乙醇摄入外的因素导致的肝内脂肪过度沉积[2]。研究报道亚洲人群的NAFLD 发病率高达27.4%，且呈逐年升高趋势，严重危害了公共健康[3]。随着NAFLD 患者的病情进展，肝细胞出现损伤甚至坏死，引起肝细胞增殖及纤维结缔组织增生，导致肝纤维化发生，并可进展为肝硬化[4-5]。在西方国家，NAFLD 正成为肝移植最常见的适应证[6]。肝纤维化严重程度与NAFLD 患者的预后密切相关，因此早期诊断肝纤维化对于改善预后尤为重要[7]。长链非编码RNA（lncRNA）是一种相对稳定的遗传物质，其参与调控基因转录等过程。lncRNA 结肠癌相关转录因子1 （CCAT1） 最初被视为促癌因子，其在结肠癌组织中呈高表达[8]。近年来研究发现，lncRNA CCAT1（以下简称为CCAT1）也参与了卵巢癌、肝细胞癌等恶性肿瘤发生和进展的调控过程[9-10]。目前CCAT1 与NAFLD 关系的相关研究较少见，本研究探讨了血清CCAT1 水平对NAFLD 患者肝纤维化及其程度的诊断价值，以期为NAFLD合并肝纤维化患者的诊断及治疗提供参考。

1 研究对象与方法

1.1 研究对象

选择2018 年2 月至2021 年12 月在树兰（杭州）医院住院治疗的256 例NAFLD 患者作为研究对象，男性143 例，女性113 例，年龄33～70 岁，平均年龄为（52.49±10.33）岁。纳入标准：（1）NAFLD 患者的诊断符合《非酒精性脂肪性肝病防治指南（2018 年更新版）》[11]中NAFLD 诊断标准；（2） 经肝脏穿刺活体组织病理检查判断纤维化程度； （3）患者知情同意。排除标准： （1）合并肝硬化、病毒性肝炎等其他肝病；（2）有大量饮酒史（女性＞20 g/d，男性＞30 g/d）； （3）合并严重心、肺、肾功能不全；（4）合并其他脏器纤维化。本研究获得医院医学伦理委员会批准（审批号2018-1-016）。

1.2 方法

1.2.1 实时荧光定量PCR 法检测血清CCAT1 水平 抽取受试者清晨空腹静脉血3 mL，2 500 r/min离心15 min，取血清，使用TRIzol 试剂（购自上海尚宝生物科技有限公司）提取血清中总RNA，按反转录试剂盒（购自上海化邦生物科技有限公司）操作步骤反转录合成cDNA，使用ABI 7500 型实时荧光定量PCR 仪（购自美国ABI 公司）进行检测。反应条件：95 ℃预变性 8 min；之后95 ℃变性30 s，56.5 ℃退火20 s，72.5 ℃延伸15 s，共40 个循环。以GAPDH 为内参，采用2-ΔΔCt法计算目的基因CCAT1 的相对表达量。引物由生工生物工程 （上海）股份有限公司合成，引物序列见表1。

表1 引物序列

1.2.2 肝纤维化程度评估 所有患者均接受肝脏穿刺活体组织病理检查，采用Metavir 评分系统进行肝纤维化评估[12]。F0 期患者无肝纤维化，将其纳入无肝纤维化组（100 例）；F1～F4 期患者存在肝纤维化，将其纳入肝纤维化组（156 例）。F1～F2期患者为轻中度肝纤维化，将其纳入轻中度肝纤维化组（112 例）；F3～F4 期患者为重度肝纤维化，将其纳入重度肝纤维化组（44 例）。

1.2.3 临床资料收集 收集患者的临床资料，包括肝功能指标ALT、AST、GGT、总胆固醇（TC）、总胆红素（TBil），肝纤维化指标——Ⅲ型前胶原（PCⅢ）、Ⅳ型胶原（CⅣ）、层粘连蛋白（LN）、透明质酸（HA），以及年龄、性别、身高、体重、既往病史，并计算BMI。实验室检查指标均由树兰 （杭州）医院检验科检测。

1.3 统计学分析

应用SPSS 25.0 软件对数据进行统计学分析。计数资料以例（%）表示，组间比较采用χ2检验；计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用独立样本t检验。血清CCAT1 与肝纤维化指标的相关性采用Pearson 法分析。采用ROC 曲线分析血清CCAT1 对NAFLD 患者肝纤维化及其程度的诊断效能。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肝纤维化组与无肝纤维化组的临床资料及血清CCAT1 水平比较

肝纤维化组的ALT、AST、GGT、PCⅢ、CⅣ、LN、HA 和CCAT1 水平均显著高于无肝纤维化组，差异均有统计学意义（P均＜0.05）。2 组的年龄、性别、BMI、糖尿病患者占比、高血压患者占比、肝病家族史患者占比、TBil 水平和TC 水平差异均无统计学意义（P均＞0.05）。见表2。

表2 无肝纤维化组与肝纤维化组的临床资料及CCAT1 水平比较

2.2 轻中度肝纤维化组与重度肝纤维化组的临床资料及血清CCAT1 水平比较

重度肝纤维化组的ALT、AST、GGT、PCⅢ、CⅣ、LN、HA 和CCAT1 水平均显著高于轻中度肝纤维化组，差异均有统计学意义（P均＜0.05）。2组的年龄、性别、BMI、糖尿病患者占比、高血压患者占比、肝病家族史患者占比、TBil 水平和TC水平差异均无统计学意义（P均＞0.05）。见表3。

表3 轻中度肝纤维化组与重度肝纤维化组的临床资料及CCAT1 水平比较

2.3 NAFLD 合并肝纤维化患者的血清CCAT1 与肝纤维化指标的相关性分析

Pearson 相关性分析结果显示，NAFLD 合并肝纤维化患者的血清CCAT1 水平与肝纤维化指标血清PCⅢ、CⅣ、LN 水平均呈正相关（P均＜0.05）。见表4。

表4 血清CCAT1 与肝纤维化指标的相关性分析

2.4 NAFLD 患者的血清CCAT1 对肝纤维化的诊断效能

以有无肝纤维化为状态变量（无肝纤维化＝0，肝纤维化＝1），以血清CCAT1 水平为检验变量，绘制ROC 曲线，分析结果显示NAFLD 患者的血清CCAT1 诊断肝纤维化的AUC 为0.742（（95%CI：0.684～0.795），最佳截断值为1.37，敏感度和特异度分别为55.57%和83.00%。见图1。

2.5 NAFLD 合并肝纤维化患者的血清CCAT1 对肝纤维化程度的诊断效能

以肝纤维化程度为状态变量（轻中度肝纤维化＝0，重度肝纤维化＝1），以血清CCAT1 水平为检验变量，绘制ROC 曲线，分析结果显示NAFLD合并肝纤维化患者的血清CCAT1 诊断重度肝纤维化的AUC 为0.795（95%CI：0.723～0.855），最佳截断值为1.43，敏感度和特异度分别为84.09%和63.39%。见图2。

图2 NAFLD 合并肝纤维化患者的血清CCAT1 诊断重度肝纤维化的ROC 曲线

3 讨论

NAFLD 患者的肝脏组织病理特征是肝细胞内脂肪过度沉积，多数患者无过量饮酒史，是代谢综合征的肝脏表现[13]。中国的NAFLD 发病率呈逐年升高趋势，是中国慢性肝病的常见类型[14]。脂肪在肝脏过度堆积可能会促进肝纤维化的发生和进展，部分NAFLD 患者会合并不同程度的肝纤维化。研究发现肝纤维化的发生会使NAFLD 患者死亡风险增高[15]，因此早期诊断肝纤维化及其程度对于提高NAFLD 患者的生存率尤为重要。目前肝脏活体组织病理检查仍被视为评估肝纤维化及其程度的金标准，但因其为有创性检查且费用较高，加之其易受医生主观因素影响，因此其作为早期诊断肝纤维化及其程度的方法应用受到了限制[16]。血清学指标取材较方便，检测速度较快，为肝纤维化无创性诊断提供了新的方法。

lncRNA 是目前被研究得较为广泛的血清学标志物。近年来研究发现，功能性lncRNA 有潜力作为生物标志物。CCAT1 最早在结肠癌组织中被发现，其在多种恶性肿瘤中起着促癌作用。魏旭静等[17]的研究发现，沉默CCAT1 表达可抑制子宫内膜癌细胞增殖。Cai 等[18]的研究发现，CCAT1 可通过调节miR-490-3p/FRAT1 信号通路促进前列腺癌细胞增殖和迁移。李兰花[19]的研究发现，HBV 相关肝细胞癌患者的血清外泌体CCAT1 表达水平显著高于对照组。目前CCAT1 与肝纤维化关系的相关研究报道较少。

研究发现不同lncRNA 在肝纤维化进程中的作用不同，一部分lncRNA 起着促进作用，而另一部分lncRNA 则起着抑制作用，还有少数lncRNA 发挥着双重作用[20]。本研究结果显示，在NAFLD 患者中，肝纤维化组的血清CCAT1 水平显著高于无肝纤维化组，肝功能指标ALT、AST、GGT 和肝纤维化指标PCⅢ、CⅣ、LN、HA 水平也均显著高于无肝纤维化组，这提示CCAT1 可能参与调控NAFLD 患者肝纤维化的发生。ROC 曲线分析结果显示，NAFLD 患者的血清CCAT1 诊断肝纤维化的AUC 为0.742，敏感度和特异度分别为55.57%和83.00%，当血清CCAT1＞1.37 时，提示NAFLD 患者发生肝纤维化的可能性较大；Lu 等[21]的研究发现CCAT1 水平与急性肾损伤小鼠肾纤维化有关，这与本研究结果相似。此外，本研究还发现，重度肝纤维化组的ALT、AST、GGT、PCⅢ、CⅣ、LN、HA 和CCAT1 水平均显著高于轻中度肝纤维化组，Pearson 相关性分析结果显示NAFLD 合并肝纤维化患者的血清CCAT1 水平与肝纤维化指标血清PCⅢ、CⅣ、LN 水平均呈正相关，上述结果提示CCAT1 可能参与调控NAFLD 患者肝纤维化的进展。ROC 曲线分析结果显示，NAFLD 合并肝纤维化患者的血清CCAT1 诊断重度肝纤维化的AUC 为0.795，敏感度和特异度分别为84.09%和63.39%，当血清CCAT1 水平＞1.43 时，提示NAFLD 患者合并重度肝纤维化的风险增高。Huang 等[22]的研究结果显示，CCAT1 在油酸诱导的HepG2 细胞及L02 细胞中表达显著上调，而沉默CCAT1 表达可抑制细胞中脂滴形成，CCAT1 在NAFLD 临床样本中的表达也显著上调，这与本研究结果一致，提示CCAT1 可能通过促进肝细胞内脂肪沉积促进肝纤维化的发生和进展。

综上所述，NAFLD 患者中，有肝纤维化患者的血清CCAT1 水平高于无肝纤维化患者，且血清CCAT1 水平随肝纤维化程度的加重而升高。血清CCAT1 对于NAFLD 患者肝纤维化及其程度的早期诊断具有一定价值。