长春地区疑难血型的血清学检测和序列分析

王涵 王晓宁

吉林大学第一医院输血科，吉林长春 130021

血型检测是输血科日常工作中的重要内容，但由于影响血型定型的因素很多，经常难以准确定型，给输血工作造成不便。分子生物学方法的使用，与血清学检测相辅相成，互相印证。本研究对我院2020年12月—2022年8月的疑难血型进行分析，对疑难血型鉴定提供方法学支持，现将报告结果记录如下。

资料与方法

1 样本

2020年12月—2022年8月，我院遇到的疑难血型样本共289例，年龄2天～89岁。

2 试剂与仪器

抗-A、抗-B、抗-H试剂，ABO标准红细胞（长春博讯生物技术公司），血型检测卡（Diana），Diana卡专用离心机，由北京市斑珀斯技贸有限责任公司提供。人类红细胞ABO血型基因分型试剂盒（荧光PCR法），ABO外显子测序试剂盒，均由江苏中济万泰生物医药有限公司提供。荧光定量PCR仪（Line Gene 9600，杭州博日科技公司），基因分析仪（ABI 3730型，美国AB公司）。

3 方法

3.1 血清学检测

3.1.1 微柱凝胶法

试验操作流程产品说明书标准流程。

3.1.2 试管法

ABO正反定型，吸收放散试验，参照《全国临床检验操作规程》中的ABO血型鉴定，ABO亚型鉴定进行操作。试验结果通过分析抗-A，抗-B反应强度，是否产生不规则抗A或抗B，H抗原是否有异常的增强或减弱，吸收放散试验是否为阳性进行判断。

3.2ABO基因测序

测序工作具体由江苏中济万泰生物医药有限公司负责完成，使用江苏中济万泰生物医药有限公司人类红细胞ABO血型基因分型试剂盒（荧光PCR法）进行检测，严格按照试剂盒说明书进行操作。先配制PCR工作液，按比例加入样本DNA，在反应孔中混匀，封膜后进行PCR扩增和熔解曲线采集，程序选择SYBR GREEN I ，反应体积设定为10 μL。每秒升温0.4℃，每0.5℃采集1次荧光值，采集温度范围60～95℃。

ABO血型基因外显子检测步骤：使用江苏中济万泰生物医药有限公司ABO外显子测序试剂盒进行检测，严格按照试剂盒说明书进行操作。扩增条件：96℃ 2 min，1个循环；96℃ 20 s，68℃ 60 s，5个循环；96℃ 20 s ，65℃ 50 s，72℃ 45 s，10个循环；96℃ 20 s，62℃ 50 s、72℃ 45 s，22个循环；72℃ 延伸2 min，1个循环；4℃保存。使用2.0%琼脂糖凝胶对产物进行电泳，电压100 V，电泳时长30 min，根据产物大小确定目标片段扩增。用Sanger法对PCR产物进行ABO基因E1～7外显子测序，并使用软件Geneious 9对结果进行分析，对比国际输血协会（ISBT）的ABO血型系统等位基因数据表，判断测序结果的基因型以及是否存在新的ABO血型基因多态性位点。

结 果

1 血清学检测

共检测142 747例血型，有289例疑难血型，发生率为0.2%。其疑难原因，见表1。

表1 289例疑难血型原因

2 基因检测结果

基因检测共29例样本，A型8例，B型13例，AB型5例，O型1例，B（A）2例，其中A亚型2例，A1型抗原减弱4例，A1型抗体缺失2例，B亚型7例，B型抗原减弱4例，B型抗体缺失2例，A1B亚型4例，A1B抗原减弱1例，O型抗体缺失1例。血清学结果见表2，基因结果见表3。标本1和标本13两个新突变位点分别为Exon1：1A＞C杂合突变，Exon1：5delC，见图1，图2。两例样本存在第7外显子467C＞T杂合突变，此突变非亚型标志性突变。

图1 标本1新突变点位（Exon1：1A＞C杂合突变）

图2 标本13新突变点位（Exon1：c.5delC）

表2 29例疑难血型血清学反应格局

表3 29例疑难血型基因结果

讨 论

ABO血型系统最初由Karl Landsteiner于1990年提出[14]。ABO血型系统有四种抗原：A、B、A1、AB，根据人类红细胞表面所含有的抗原不同可分为A型、B型、O型、AB型。ABO血型鉴定的影响因素较多，当出现正反定不符，正定型或反定型凝集强度不足，反定型价差相差过大，可视为疑难血型。

血型的血清学检测方法有一定局限性，某些情况下不能判定患者血型，随着血型基因检测方法的发展，可在分子生物学水平对血清学检测加以验证[15]。弥补了血清学方法的局限性，使血型准确率更高。ABO抗原做为基因产物，受复杂分子遗传背景调控[16-17]，ABO基因编码产物为糖基转移酶，其可以引导合成ABO抗原。ABO亚型主要由于糖基转移酶基因的第6、7外显子基因位点发生了突变，通过影响糖基转移酶的活性，可特异性改变抗原表达，产生亚型[18]。根据血清学反应格局A亚型可分为A1、Aint 、A2、A3、Aend、Ax、Am、Ay、Ael、Aw。B亚型可分为B3、Bend、Bx、Bm、By、Bel、Bw[19]。分析应用分子生物学检测的29例样本发现：亚型13例，明显可见B亚型出现概率高于A亚型。其中前15例标本血清学检测结果与基因检测结果相符，且未出现抗A1或抗B亚型抗体。标本1亚型标志性突变点位为第1外显子1A＞C杂合，启动密码子存在变异，对蛋白表达有重要影响，开放阅读框变化。

标本2c.838C＞T突变，使Leu280Phe发生改变，与此前SUN等[1]报导的结果一致。

标本3及标本8为Bw31，发生了1个错意突变664G＞A，导致222位氨基酸由缬氨酸转变成甲硫氨酸。氨基酸改变可导致蛋白质构象改变，从而影响酶的活性和抗原的表达，此为ABO抗原表达减弱的主要原因[2]。

标本4亚型标志性突变点位为c.646T＞A，此突变引起第216为氨基酸苯丙氨酸被异亮氨酸替换，使GTB酶活性特异性改变，与李育等[3]报导一致，报道中反定存在亚型抗体，血清学表型与标本4不一致。

标本5标志性突变为255C＞T，此突变与高健等[4]报导的结果一致，且B抗原血清学凝集强度相似。

标本6存在905A＞G碱基突变，林凤秋等[5]报导中，3例905A＞G突变B亚型样本，反定均产生弱凝集抗B，而标本6反定无抗B，提示相同突变的亚型，血清学表型会有所不同。此突变导致B糖基转移酶302位氨基酸天门冬氨酸替换成甘氨酸。天门冬氨酸在在保持蛋白质稳定性方面有重要作用，替换为甘氨酸后，打破了电荷平衡，使酶催化性弱化，导致了B抗原表达减弱[20]。

标本7和标本9均发生在第7外显子c.721C＞T，符合Bw03的遗传序列，此突变引起的第241位氨基酸精氨酸被色氨酸替换，氨基酸替换造成了α-1，3-D-半乳糖基转移酶活性部分丧失，使D半乳糖及前体H物质的连接发生部分缺失，如此变异发生在A等位基因上，导致弱A表现型，在B等位基因上，导致弱B表现型，241氨基酸处于酶活性区域，对催化糖基转移酶功能至关重要[6]。

标本14，c.1055G＞A导致352位氨基酸由原来的精氨酸突变替换为谷氨酰胺，B基因编码的氨基酸改变，导致B抗原表达的减弱。以上变异可能导致B抗原表达减弱[9]。

标本12与袁雯靖等[8]报导的Bw37进行对比，其发现的Bw37反定存在抗B亚型抗体，而标本12反定无抗B抗体，经测序发现多肽p.R176G、P.G235S、p.G268A变异，B抗原弱。

标本15c.278C＞T碱基突变使多肽链93位氨基酸由脯氨酸变为亮氨酸，从而导致GTB功能异常，刘昕等[10]在报导中对此突变形成亚型的机制进行了研究，三维建模后发现，93位的氨基酸Pro被Leu替代后，酶中心结构未发生改变，但与之相连氢键发生变化，原本与之相连的两个氢键断开，与其相连的522位水分子也断开，氨基酸残基与水分子介导产生的氢键，在稳定蛋白质结构有重要作用，因蛋白质稳定性改变，使酶活性异常，出现血清学抗原减弱的表现。

标本21血清学表现为B亚型，基因回报B型，其在外显子E1-7未发现突变基因，而在内含子1上存在5873C＞T点突变，此突变可能造成弱B抗原表型，此与方小敏等[12]报导的结果一致，有研究标明，内含子1存在类似增强子的特异性调控元件，可调控红细胞ABO基因表达[21]。

标本23无外显子突变，仅有内含子2突变，此突变可能与B抗原减弱有关。标本16第6号外显子第261位碱基的鸟嘌呤缺失，导致移码突变，提前产生一个终点密码子，使翻译过程产生缺乏酶催化中心短肽链，喻琼等[11]报道含有261delG的等位基因表达出弱A抗原。

标本17，18，22，24为血液病患者，血清学反应格局符合A3，Am，Bm，A3B3型，基因检测结果为普通血型，因此抗原减弱受恶性血液病影响[13]。

目前，国内外报道的B（A）亚型共有6种，我国以B（A）02和B（A）04亚型为主[22]。基因检测结果中B（A）04共有两例，标本10、标本11，B（A）亚型相对罕见，其血清学检测结果表现为正定“弱A强B”，血浆中存在抗A抗体。均为第7外显子640A＞G单碱基突变使其编码蛋白214位Met被Val取代[7]。

标本26、27存在外显子变异，通过基因测序确定其为ABO*A1.02/ABO*A1.02，A102等位基因与A101等位基因只是在第467位发生碱基替换C＞G，两者翻译糖基转移酶活力无明显差异[23]，因此A抗原不减弱，而低蛋白血症会导致抗体缺失，标本25为O型缺失抗B抗体，此原因未知。

可见，c.838C＞T，664G＞A，646T＞A，255C＞T，905A＞G，721C＞T，1055G＞A，278C＞T，5873C＞T以上突变均可导致血清学抗原减弱，同时，突变点位相同的样本，血清学表型也可能不同，在特殊血型标本中，单纯的使用血清学方法鉴定，存在一定的局限性。也存在血清学表型和分子生物学结果不符的情况，应用分子生物学方法进行基因测序可以排除一些不利因素干扰。但目前并不能完全取代血清学检测，应用血清学和分子生物学相结合的方法能提高血型鉴定的准确性，保证输血安全。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突