凝血和血小板功能分析仪在检测川崎病患儿不同时期凝血功能中的应用

王笑欢 郭凯 刘倩 牛子健 王孟键 郭婧 马曙轩

国家儿童医学中心首都医科大学附属北京儿童医院 100045

川崎病（kawasaki disease，KD）是一种儿童自限性血管炎，主要见于5岁以下儿童，临床主要表现为皮疹、发热、口唇破裂、结膜炎和颈部淋巴结肿大等症状[1]。研究表明，川崎病患儿存在凝血和抗凝系统功能异常，血液处于高凝状态，导致冠状动脉血栓形成[2]。凝血和血小板功能分析仪（Century clot）是Sonoclot的第三代产品。本研究旨在通过回顾性分析KD患儿凝血和血小板功能分析仪和常规凝血试验检测结果，分析其不同时期凝血状态，并探讨两种检测方法的临床价值，以期为KD患儿诊断、预防或治疗提供循证依据。

材料与方法

1 一般资料

选择我院2022年7月—10月收治的川崎病住院患儿作为研究对象，样本纳入标准：（1）KD的诊断依据第7次世界小儿KD研讨会修订的KD诊断标准[3]，满足以下任意5项表现：持续5 d及以上的发热，双侧眼结膜充血，口唇潮红、皲裂、出血，杨梅舌，多型性红斑皮疹，急性期可见手足肿硬，恢复期指趾端膜状脱皮，颈部非化脓性淋巴结肿大；（2）未接受过相关治疗的川崎病患儿。（3）影像学检查不存在冠状动脉瘤。排除标准：伴其他心血管疾病、自身免疫性疾病、先天性出凝血病及重要脏器损伤的原发性疾病患儿。根据纳入、排除标准，最终共纳入38例KD患儿，40例同期健康对照。对照组中，男26（65%）例，女14（35%）例，年龄3.75（2.64，4.54）岁；实验组患儿中，男23（60.53%）例，女15（39.47%）例，年龄3.25（1.57，5.17）岁，住院天数14（13，16）天。两组患儿的性别、年龄比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。数据采集：患儿初次诊断为KD，第一次Century clot检测及同期常规凝血试验和血小板计数结果纳入最终统计数据集。

2 仪器与试剂

ACL TOP®700全自动凝血分析仪及其配套试剂购自美国Instrumentation Laboratory公司。凝血和血小板功能分析仪及配套试剂购自世纪亿康（天津）医疗科技发展有限公司。

3 实验方法及观察指标

使用EDTA-K2抗凝静脉血2 mL，进行血常规血小板计数（PLT）。Century clot检测严格按照仪器使用说明书进行上杯操作，电脑记录曲线。Century clot主要参数如下：激活凝血时间（activated clotting time，ACT），样本呈现液态的时间，ACT延长，提示凝血因子功能缺失，或存在抗凝药物，ACT缩短，提示凝血因子高凝状态，血栓风险增加；凝血速率（clot rate，CR），单位时间内纤维蛋白原转变为纤维蛋白凝胶的速度，CR值增大，提示纤维蛋白原功能增强，CR值缩小，提示纤维蛋白原功能减低；血小板功能指数（platelet function，PF）反映血小板的综合功能，PF值增大，提示血小板功能增强，PF值减小，提示血小板功能减弱（图1）。CCT项目主要包括APTT、PT、Fg和D-二聚体。

图1 Century clot示意图

4 统计学分析

本研究统计分析使用IBM SPSS Statistics25.0版本软件进行。年龄等连续变量使用观测数、均值±标准差（）、M（P25，P75）进行描述，性别等分类变量使用各个类别频数及其百分比进行描述。性别与年龄之间使用U检验、卡方检验进行比较。不同疾病时期与对照组之间的凝血情况比较采用方差分析、LSD-t检验或Tamhan'sT2检验。两种检测方法评估KD患儿凝血情况的一致性关系行加权Kappa一致性分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 KD患儿急性期、亚急性期和对照组之间凝血情况比较

根据发病天数，川崎病可以分为急性期（10天内）、亚急性期（10～28天），以及恢复期（4周后）。本研究38名KD患儿，22例处于急性期，16例处于亚急性期。对急性期、亚急性期和健康对照组进行方差分析，结果显示，亚急性期与急性期相比，Century clot中反应凝血因子功能的ACT和PLT明显增强（P＜0.05），其余检测指标两期无明显差异；与对照组相比，亚急性期的ACT、急性期和亚急性期的PT和APTT无明显差异，而Century clot中反应纤维蛋白原功能的CR、反应血小板功能的PF、PLT、Fg及D-二聚体，急性期和非急性期均明显增强（P均＜0.05）（表1）（图2）。

表1 KD患儿急性期、亚急性期及健康对照组之间凝血情况比较

图2 KD患儿急性期、亚急性期及健康对照组之间凝血情况比较

2 Century Clot与CCT评估KD儿童凝血功能的一致性分析

为进一步分析CCT、Century Clot和血小板计数在KD儿童凝血功能判定中的一致性，将CCT、Century Clot各指标和血小板计数按各自参考区间划分为低凝、正常、高凝3种凝血状态，进而对Century Clot，CCT各自代表凝血因子、纤维蛋白原功能及血小板计数及功能指标通过加权Kappa检验进行一致性分析。结果显示，ACT与PT和APTT一致性均较差，ACT:PT（Kappa=0.01，P=0.91）；ACT:APTT（Kappa=0.19，P=0.09）；CR与Fg一致性较差（Kappa=0.12，P=0.21）。PF与PLT一致性极差（Kappa=0.01，P=0.91）（表2）。

表2 Century clot与CCT及血常规PLT的一致性分析

讨 论

KD是一种主要发生于大小动脉的全身性血管炎，好发于5岁以下儿童[4]。川崎病的具体形成机制尚未完全明确，有研究表明川崎病患儿急性期血液处于高凝状态，同时存在炎性介导的血管内皮损伤、血小板异常激活、纤维蛋白异常溶解等状态[5-6]。单纯依靠临床表现不利于不典型KD的早期诊断与治疗，因此寻找适合临床诊疗该病的实验室新指标尤为重要。

据统计，0～5岁儿童中，川崎病患病率约100/10万～120/10万，且男童患病率略高于女童，本研究与国内大数据调查结果一致[7]。临床上一般采用常规凝血实验联合血小板计数对患者凝血功能进行分析，但传统凝血检测是以血浆为基础，不能反映出血小板和以血小板激活的凝血酶的作用和影响，PLT计数无法反映血小板功能。凝血和Century clot是Sonoclot的第三代产品，以图像形式全貌的反映了从止血开始到血凝块形成的动力学、纤维蛋白与血小板之间相互作用的机体凝血过程，可快速评估凝血和血小板功能，判断出血和血栓风险[8]。根据发病天数，川崎病可以分为急性期（10天内）、亚急性期（10～28天），以及恢复期（4周后），大部分患儿都在急性期入院，本研究中患儿处于急性期或亚急性期，并均在亚急性期间出院[9]。本研究发现，与对照组相比，亚急性期的ACT、急性期和亚急性期的PT、APTT无明显差异，这与CHEN等[10]的研究发现一致，甚至急性期ACT的平均时长还高于对照组和亚急性期。SAKURAI等[11]的研究中也发现在急性期PT、APTT比对照组延长。而反应纤维蛋白原功能的CR、Fg、反应血小板功能的PF和PLT及D-二聚体，急性期和亚急性期均增强。血小板能在血管损伤暴露出内皮下组织后被激活，与vWF、纤维蛋白形成白色血栓发挥止血的作用[12-13]。D-二聚体是人体在发生纤溶反应阶段针对交联纤维蛋白所产生的降解物质，可作为体内高凝状态的可靠指标[14]。综上推测，凝血因子在促进川崎病患儿高凝状态中发挥作用较小，并且提示川崎病患儿高凝状态更多是因为炎症状态导致的血管通透性升高，大量被激活的血小板释放入血液，与纤维蛋白一起形成血栓，并继发纤溶亢进，这与国外研究结果一致[15]。PLT亚急性期比急性期明显增多，但PF在两期之间无明显差异，推测川崎病患儿在相关治疗中，虽然血小板功能和炎症得到一定控制，但持续存在的血管内皮损伤，促进 PLT释放，数量明显增加[16]，更加说明两种检测方法结合起来对诊断疾病的发展更为准确。

为评估两方法在KD患儿凝血功能检测中的应用价值，本研究进一步分析了Century clot与CCT检测KMS患儿凝血功能结果的一致性。Landis和Koch将Kappa系数的大小划分了6个区段，分别代表一致性的强弱程度[17]，Kappa＜0，代表一致性极差；0.0～0.2，表示微弱；0.21～0.40，表示弱；0.41～0.60，表示中度；0.61～0.80，表示高度；0.81～1，极强。本研究结果显示，代表凝血因子指标ACT值与PT、APTT一致性较差，这说明在反映凝血因子上两种监测相似性较差[18]。CR值是纤维蛋白聚合速率，主要反应纤维蛋白多聚体生成的功能，本研究显示Fg与CR值一致性差。PF值为血小板功能，可反映血小板的粘附、聚集、释放、促凝、收缩的综合功能，与PLT一致性也较弱。

Century clot与CCT在KD儿童凝血功能检测中一致性都比较弱，原因可能跟两种方法的检测原理不同有关。由于本研究是回顾性分析，例数偏少也可能是造成两者差异的原因。传统凝血检测和Century clot各有优劣，传统凝血检测是以血浆为基础，而凝血功能和血小板功能动态监测分析系统以全血为基础，可以检测凝血因子，血小板和其他细胞或血浆因子在血块形成时的相互作用，是基于细胞学基础原理进行的凝血检测，CR值和PF值，特异性更强，精确度更高[8]。有研究发现，凝血和血小板功能分析仪可清晰呈现心内科患者使用阿司匹林后的血小板汇集增多现象以及血栓形成趋势，这是因为不同于常规凝血单一检测方法，Century clot采用粘弹制的方式对样本进行动态的检验，可以检测一系列凝血问题，例如凝血因子是否缺乏，抗凝药物效果等[8]。另有研究发现，凝血和血小板功能分析仪可用于输血指导，提高输血质量及预后评估[19]。但Century clot关于纤溶亢进这方面的参数正在研发中，在参数没有上市之前，要根据曲线回落后的粘度值，跟基线的粘度值进行比较。所以需结合凝血四项中的D-二聚体，共同判断川崎病患儿的纤溶情况。总之，两种检测方法不能相互取代，探究将Century clot和凝血四项二者结合起来，尤其是通过血小板功能及数量、D-二聚体联合检测，为KD的不同时期凝血状况及治疗给出准确的描述，在一定程度上预测川崎病患儿冠脉损伤情况，为临床诊断及治疗提供有效的实验室数据支持。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突