基于PI3K/AKT/NF-κB信号通路探讨自拟英黄汤对脓毒症大鼠的保护作用

郭军利,陶愚磊,郑佳丽,梅建强,陈分乔,许文忠

脓毒症是感染引起宿主反应失调,导致危及生命的器官功能损害的一组症候群,病死率很高[1],其往往发生于严重感染、烧伤或创伤,同时也是休克、外科大手术等疾病常见的并发症[2]。脓毒症早期常合并单一器官功能障碍,当炎性反应加重,机体出现炎性反应失控、血管内皮功能障碍、凝血功能障碍、循环代谢障碍,最终导致多器官功能障碍,其中炎性反应、凝血功能障碍、器官损伤贯穿脓毒症整个疾病阶段[3-4]。目前,西医治疗多采用液体复苏、抗感染治疗、血管活性药物治疗、连续血液净化及对症支持治疗等治疗措施,取得了一定的效果[5]。然而,大量使用抗生素会增加细菌的耐药性,增加救治的难度,同时以免疫细胞、炎性介质、凝血系统为治疗靶点的最新研究亦未达到降低脓毒症病死率的预期效果。中医药具有几千年治疗感染性疾病的历史,大量证据表明中医药在治疗脓毒症方面具有很大的优势。

自拟英黄汤是由全国名中医梅建强教授在中医理论基础上结合多年的急危重症临床救治经验创立,且已应用于临床中治疗脓毒症患者,并取得了一定的疗效[6],然而其作用机制尚不明确。多项研究显示,磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)/核因子-κB(NF-κB)信号通路是脓毒症发病机制的关键通路,通过药物干预PI3K/AKT/NF-κB通路被认为是降低脓毒症病死率的关键措施之一[7-8]。因此本研究运用盲肠结扎穿孔法(CLP)建立脓毒症大鼠模型,基于PI3K/AKT/NF-κB信号通路探讨英黄汤对脓毒症大鼠保护作用,为英黄汤更好在临床当中发挥治疗作用提供支持,报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物:健康雄性SD大鼠240只,体质量(150±20)g ,购自北京维通利华实验动物技术有限公司,动物合格证号:SCXK(京)2021-0011。在安静环境下适应性饲养1周,饲养环境温度25℃,湿度50%～60%。本实验经河北中医学院动物伦理委员会批准(DWLL2019004)。

1.1.2 英黄汤药物制备:蒲公英20 g,生大黄9 g,赤芍12 g,白芍12 g,清半夏6 g,茯苓20 g,地榆20 g,当归15 g,青皮15 g,仙鹤草20 g,川芎9 g,水蛭9 g,加入8倍体积水煎煮40 min,浓缩成2 g生药/ml备用。上述中药材饮片经由河北中医学院第一附属医院药学部提供,符合2015版《中国药典》相关规定。

1.1.3 主要试剂与仪器:大鼠白介素6(IL-6,货号:ml102828)、大鼠肿瘤坏死因子α(TNF-α,货号:ml002859)、大鼠白介素1β(IL-1β,货号:ml028514)ELISA试剂盒均购自上海酶联生物科技有限公司。BCA蛋白定量试剂盒(货号:A045-4-2)、丙氨酸氨基转移酶(ALT,货号:C009-1)、天冬氨酸氨基转移酶(AST,货号:C0101-2-1)、血肌酐(SCr,货号:CO11-2-1)、尿素氮(BUN,货号:C013-2-1)试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。总RNA提取试剂盒(货号:DP419)、cDNA反转录试剂盒(货号:KR116-02)、SYBR扩增试剂盒(货号:P205-02)均购自天根生化科技(北京)有限公司。PI3K抗体(货号:bs-10657R)、p-PI3K抗体(货号:bs-6417R)、AKT抗体(货号:bsm-33278M)均购自北京博奥森生物技术有限公司;p-AKT抗体(货号:28731-1-AP)、P65抗体(货号:80979-1-RR)、β-actin(货号:20536-1-AP)均购自Proteintech公司;p-P65抗体(货号:3033S)购自Cell Signaling Technology公司。地塞米松(货号:D8040)购于北京索莱宝科技有限公司。全自动血液分析仪(型号:Sysmex XT-2000iv)、光学显微镜(型号:ECLIPSE E100)均购自Nikon公司;冷冻切片机(型号:CM3050S)购于Leica公司。

1.2 分组与造模方法

1.2.1 动物分组:2022年8—12月于河北省中医药科学院附属医院动物实验室进行实验,将240只大鼠按随机数字表法分为假手术组、模型组、地塞米松组、英黄汤低剂量组、英黄汤中剂量组及英黄汤高剂量组。其中模型组、地塞米松组、英黄汤低剂量组、英黄汤中剂量组及英黄汤高剂量组运用CLP法建立脓毒症模型,假手术组大鼠只切开腹壁并缝合,不进行CLP。

1.2.2 脓毒症大鼠模型的建立:运用CLP建立脓毒症大鼠动物模型。术前12 h禁食不禁水,异氟烷气体麻醉后前腹正中备皮,消毒腹部皮肤,于腹部正中做2 cm切口,取出盲肠后,游离肠系膜和盲肠,运用3-0手术缝合线在盲肠末端距离回盲部5 mm处进行结扎,于距结扎处远端阑尾根部两侧肠壁0.8～1.0 cm处,运用注射器针头(20G)做2次贯通穿孔,并挤出少量肠内容物,之后于盲肠贯穿孔中放置3 mm×0.5 mm×30 mm引流条,之后将盲肠放回腹腔,缝合切口。

1.2.3 干预方法:造模后假手术组与模型组灌胃生理盐水2 ml,每12 h灌胃1次。地塞米松组腹腔注射地塞米松1 mg/kg,每日1次。英黄汤低、中、高剂量组分别灌胃英黄汤8.77 g生药/kg、17.53 g生药/kg、35.06 g生药/kg,每12 h灌胃1次,各组均连续给药3 d。英黄汤中剂量为人等效剂量,低剂量是中剂量的1/2,高剂量是中剂量的2倍,动物剂量和人等效剂量均根据体表面积折算[9]。

1.3 观测指标与方法

1.3.1 大鼠生存率统计:每组大鼠分别选出20只进行生存率统计,大鼠在接受CLP后,每天统计各组大鼠存活的数量,连续观察7 d,生存率=存活大鼠数量/20×100%,根据生存率绘制生存曲线。

1.3.2 血清PLT、PT、APTT、TT、Fib检测:造模给药72 h后,大鼠麻醉后固定,剖开腹腔,腹主动脉取血,EDTA-K2抗凝真空采血管收集血液200 μl,轻轻混匀,室温静置15 min,全自动血液分析仪进行血小板计数(PLT);再用枸橼酸钠抗凝真空采血管收集血液200 μl轻轻混匀,使用全自动血凝分析仪测定血浆凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血酶原时间(APTT)、凝血酶时间(TT)、纤维蛋白原(Fib)水平。

1.3.3 支气管肺泡灌洗液(BALF)收集及总蛋白测定、肺组织湿重/干重(W/D)比值测定:造模给药72 h后,将大鼠麻醉后固定,剪开喉咙处皮肤,用镊子分离周围组织,暴露大鼠气管。取1 ml注射器针头,剪掉磨平针尖,在大鼠甲状软骨处插入针尖,丝线结扎固定。将1 ml PBS分2次注射肺内,每次均停留1 min后回收。回收的BALF于4℃,2 500 r/min离心10 min,回收上清液冻存于-80℃备用,使用BCA试剂盒检测BALF总蛋白含量。取右肺组织,称湿重后,置于60℃烘干箱烘干48 h,达到恒重,计算肺W/D比值。

1.3.4 血清ALT、AST、SCr、BUN测定:腹主动脉取血,轻轻混匀,室温静置15 min,使用全自动血液分析仪测定ALT、AST、SCr、BUN水平。

1.3.5 肺、肝、肾组织形态学测定:造模给药72 h后,收集肺、肝、肾组织,清洗后置于4%多聚甲醛固定,脱水后进行石蜡包埋,切片机切成3 μm厚的切片,常规HE染色,中性树胶封片,光学显微镜下显像,观察各组大鼠组织病理改变。

1.3.6 血清IL-6、IL-1β、TNF-α测定:将收集到的大鼠血液室温静置后离心10 min,转速3 000 r/min,收集血清。按照ELISA试剂盒说明书检测血清炎性因子IL-6、IL-1β、TNF-α指标。

1.3.7 qRT-PCR检测大鼠肺组织IL-6、IL-1β、TNF-α基因水平:造模给药72 h后,取各组大鼠肺组织,提取总RNA,逆转录合成cDNA。以cDNA作为模板,按照试剂盒说明分别加入引物和SuperReal PreMix Plus,反应条件:95℃15 min,95℃20 s,56℃20 s,40循环。使用2-△△CT进行数据定量分析。PCR引物见表1。

表1 IL-6、IL-1β、TNF-α、PCR引物序列

1.3.8 Western-blot检测各组大鼠PI3K/AKT /NF-κB P65信号通路中相关蛋白表达:称取肺组织样品20 mg加入RIPA裂解液,然后12 000 r/min离心10 min后吸取上清至新的EP管中。使用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定得到的细胞上清液中蛋白质含量,确保各样品蛋白质含量一致。各取20 μg样品在密度为10%的分离胶进行电泳。从凝胶中分离的目标蛋白转移到已被甲醇激发的PVDF膜上,使膜在5%脱脂奶粉中室温封闭2 h,之后加入PI3K(1∶1 000)、p-PI3K(1∶1 000)、AKT(1∶5 000)、p-AKT(1∶5 000)、P65(1∶5 000)、p-P65(1∶1 000)、β-actin(1∶1 000)4℃孵育过夜。第2 d使用1′TBST缓冲液洗膜3次,每次10 min。加入相应二抗(1∶8 000),室温孵育2 h。膜用1′TBST洗膜3次,每次5 min。使用增强化学发光法使条带可视化,以β-actin为内参,并通过凝胶成像分析系统成像,使用Image-J软件分析各条带灰度值。

2 结 果

2.1 各组大鼠生存率比较 造模给药7 d后,假手术组大鼠生存率为100%,模型组大鼠生存率为30.0%(6/20),地塞米松组大鼠35.0%(7/20),英黄汤低剂量组生存率为30.0%(6/20),英黄汤中剂量组40.0%(8/20),英黄汤高剂量组生存率为45.0%(9/20)。

2.2 各组大鼠血清PLT、PT、APTT、TT、Fib比较 与假手术组相比,模型组大鼠血清PLT、Fib含量显著减少(P<0.05),PT、APTT、TT时间显著延长(P<0.05);与模型组相比,地塞米松组血清PLT、Fib含量显著增加(P<0.05),PT、APTT、TT时间显著缩短(P<0.05),英黄汤高、中剂量组血清PLT、Fib含量显著增加(P<0.05),PT、APTT显著缩短(P<0.05),英黄汤低剂量组PT、Fib水平差异无统计学意义(P>0.05);英黄汤各剂量组TT差异无统计学意义(P>0.05);与地塞米松组相比,英黄汤中、高剂量组PLT含量显著增加(P<0.05),英黄汤低剂量组PT、APTT显著延长,差异有统计学意义(P<0.05),见表2。

表2 各组大鼠血清PLT、PT、APTT、TT、Fib比较

2.3 各组大鼠BALF中总蛋白及肺组织W/D比值比较 与假手术组相比,模型组大鼠BALF中总蛋白含量显著增加(P<0.05)、W/D比值显著增大(P<0.05);与模型组相比,地塞米松组和英黄汤高、中剂量组BALF中总蛋白显著减少(P<0.05)、W/D比值显著减小(P<0.05),英黄汤低剂量组W/D比值降低(P<0.05);与地塞米松组相比,英黄汤高剂量组BALF中总蛋白含量、W/D比值显著降低(P<0.05),英黄汤低剂量组BALF中总蛋白含量、W/D比值均升高(P<0.05),见表3。

表3 各组大鼠BALF中总蛋白及肺组织W/D比值比较

2.4 各组大鼠血清ALT、AST、SCr、BUN比较 与假手术组相比,模型组大鼠ALT、AST、SCr、BUN含量显著增加(P<0.05);与模型组相比,地塞米松组及英黄汤中、高剂量组ALT、AST、SCr、BUN含量均显著降低,英黄汤低剂量组SCr水平降低(P<0.05);与地塞米松组相比,英黄汤高剂量组ALT、BUN含量均降低(P<0.05),英黄汤低剂量组SCr升高(P<0.05),见表4。

表4 各组大鼠血清ALT、AST、SCr、BUN比较

2.5 各组大鼠肺、肝、肾组织病理结构比较 肺组织HE染色结果表明,模型组大鼠肺组织肺泡壁增厚,毛细血管扩张，肺间质充血伴有细胞浸润;与模型组相比,地塞米松组、英黄汤各剂量组炎性细胞减少,肺泡组织结构趋于完整,病理损伤减轻。肝组织HE染色结果表明，模型组大鼠肝细胞排列散乱,肝索紊乱,肝细胞出现坏死,同时可观察到明显的炎性细胞浸润;与模型组相比,地塞米松组、英黄汤各剂量组大鼠肝细胞排列较整齐,肝组织中炎性细胞浸润均有所缓解。肾组织HE染色结果表明,模型组大鼠肾小球基底膜增生,肾间质炎性细胞浸润明显;与模型组相比,地塞米松组、英黄汤各剂量组肾脏组织炎性反应程度明显减轻,见图1。

图1 各组大鼠肺、肝、肾组织病理结构比较(HE染色,×200)

2.6 各组大鼠血清IL-6、IL-1β、TNF-α比较 与假手术组相比,模型组大鼠血清中IL-6、IL-1β、TNF-α含量均显著升高(P<0.05);与模型组相比,地塞米松组、英黄汤各剂量组IL-6、TNF-α含量及英黄汤中、高剂量组IL-1β含量均降低(P<0.05);与地塞米松组相比,英黄汤低、中剂量组IL-6表达及低剂量组IL-1β表达均升高(P<0.05),见表5。

表5 各组大鼠血清IL-6、IL-1β、TNF-α比较

2.7 各组大鼠肺组织IL-6、IL-1β、TNF-α基因表达水平比较 与假手术组相比,模型组大鼠肺组织中IL-6、IL-1β、TNF-α基因表达显著增高(P<0.05);与模型组相比,地塞米松组、英黄汤各剂量组IL-6、IL-1β、TNF-α基因表达显著降低(P<0.05);与地塞米松组相比,英黄汤各剂量组IL-6、IL-1β、TNF-α基因表达差异无统计学意义(P>0.05),见图2。

注:与假手术组相比,aP<0.05;与模型组相比,bP<0.05。

2.8 各组大鼠PI3K/AKT/NF-κBP65信号通路中相关蛋白表达的比较 Western-blot结果表明,与假手术相比,模型组p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-P65/P65比值显著上调(P<0.01);与模型组相比,地塞米松组及英黄汤中、高剂量组p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-P65/P65比值均降低(P<0.05),英黄汤低剂量组p-PI3K/PI3K、p-P65/P65比值均降低(P<0.05);与地塞米松组相比,英黄汤各剂量组p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-P65/P65比值差异无统计学意义(P>0.05),见表6、图3。

注:A.假手术组;B.模型组;C.地塞米松组;D英黄汤低剂量组;E.英黄汤中剂量组;F.英黄汤高剂量组。

表6 各组大鼠PI3K/AKT/NF-κBP65信号通路中相关蛋白表达的比较

3 讨 论

根据脓毒症相关症状,可将其归属于中医学“伤寒”“温病”范畴[10]。多数医家认为机体正气不足,引起毒邪内侵,导致毒热、瘀血内生,腑气不通、脉络瘀滞而发生本病[11]。脓毒症期机体多表现出毒热内蕴,而通里攻下法是快速排出毒热的有效方法[12]。同时毒热久蕴,搏血为瘀,瘀阻脉络,一方面血脉瘀滞,导致毒热难祛,另一方面血脉瘀滞,药物难以快速直达病灶[13]。梅建强教授结合多年的临床经验,以通腹泄热、活血解毒为大法,创立中药“英黄汤”,方中大黄荡涤胃肠毒热积滞,给邪出路,同时走血分破瘀血;蒲公英既能清解火热毒邪,又善泄降滞气,与大黄相伍解毒之力更强,二者共为君药;青皮善走窜行气,水蛭活血逐瘀,归芍合川芎活血和血,仙鹤草通络补虚,地榆凉血解毒,共为臣药;茯苓健脾和胃,固护正气;清半夏清热祛痰、降逆,共为佐使之品。

本研究中,通过CLP方法构建的脓毒症大鼠生存率与真实世界数据相符,且与相关文献报道一致[14],英黄汤可以有效改善脓毒症大鼠生存率。凝血功能障碍是脓毒症病情进展和多器官功能障碍发生的重要因素[15]。CLP造模72 h后,模型组大鼠血清中PLT含量显著降低,PT、APTT、TT时间明显延长,Fib大量消耗;与模型组相比,英黄汤各剂量组大鼠血清中PLT含量显著增加,PT、APTT时间明显缩短,Fib含量增加,表明英黄汤能够改善脓毒症大鼠凝血功能。CLP造模72 h后,模型组大鼠肺组织BALF中蛋白含量显著增加,W/D比值明显增高, ALT、AST、SCr、BUN水平明显增高,肺、肝、肾组织出现明显损伤,经英黄汤干预,英黄汤各剂量组大鼠BALF中蛋白含量显著减少、W/D比值明显减小,ALT、AST、SCr、BUN水平明显降低、肺、肝、肾组织损伤明显减轻,表明英黄汤对脓毒症大鼠肺肝肾组织具有明显的保护作用。炎性因子是导致组织出现损伤的重要因素,过度活化的炎性反应也是脓毒症病情进展的重要原因[16-19]。脓毒症早期IL-6、TNF-α、IL-1β等炎性因子大量分泌,既可以早期诊断脓毒症,对于脓毒症预后也起到关键的作用[20-22]。造模给药72 h后,模型组大鼠血清中IL-6、IL-1β、TNF-α水平显著升高,肺组织中IL-6、IL-1β、TNF-α基因表达显著增多,而经英黄汤干预,英黄汤各剂量组大鼠血清中IL-6、IL-1β、TNF-α水平显著降低,肺组织中IL-6、IL-1β、TNF-α基因表达显著减少,表明英黄汤能够显著减轻炎性反应,抑制炎性因子表达。

研究发现,PI3K/AKT通路是一条重要的信号传导通路,参与大多数的炎性反应过程,AKT是PI3K的下游受体,在细胞增殖、分化、凋亡、迁移和转录等多种细胞过程中发挥着重要作用[23]。NF-κB家族成员众多,其中发挥转录激活作用的是p65,因此p65又被视为该通路活化的标志[24]。 研究发现NF-κB 属于炎性反应的中心介质,脓毒症发生时,促进炎性因子释放的同时,加重微血栓的形成,对于脓毒症病情的发生及进展起到重要的作用[25]。造模给药72 h后,模型组肺组织中PI3K/AKT/NF-κB P65蛋白水平较假手术组显著增高,提示PI3K/AKT/NF-κB P65信号通路在炎性因子的刺激下,显著激活;英黄汤各组大鼠肺组织中PI3K/AKT/NF-κB P65蛋白水平较模型组显著下降。由此认为,英黄汤能够抑制PI3K/AKT/NF-κB P65信号通路活化,减轻脓毒症大鼠急性肺损伤,修复肺功能。

综上所述,英黄汤可以改善CLP大鼠凝血功能障碍,保护肺、肝、肾功能,降低炎性反应水平,这些变化可能与抑制PI3K/AKT /NF-κB信号通路活化有关。

利益冲突：所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明

郭军利:设计研究方案,实施研究过程,分析实验数据,搜集整理资料,论文撰写;陶愚磊、郑佳丽:参与实验过程,分析实验数据,搜集整理资料;梅建强、陈分乔:提出研究思路,指导实施研究;许文忠:提出研究思路,指导实施研究,论文审核