基于蛋白指纹图谱的阳澄湖大闸蟹真伪鉴别研究

张雅涵， 张有勇， 袁丹， 徐敏， 曹叶中

（1.苏州市知识产权保护中心，江苏 苏州 215100； 2.苏州市食品检验检测中心，江苏 苏州 215100）

阳澄湖大闸蟹蟹鳌的肌肉组织含有丰富的蛋白，具有品种精良、体大膘肥、青壳白肚、金爪黄毛、肉质膏腻等特点。阳澄湖大闸蟹的鲜味来自于蟹身体内丰富的游离氨基酸，蟹肉中含有较多呈甜味的氨基酸，如丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸等，这些散发着鲜味的游离氨基酸在大闸蟹的肌肉、肝胰脏、性腺等可食部位都有广泛分布，因此大闸蟹吃起来鲜甜美味[1]。阳澄湖属东亚季风气候区，分为西湖、中湖和东湖，湖水域具有水浅、土质硬、光照充足、淤泥少等特点，地理位置靠近海口，是螃蟹徊游繁殖的理想地区。因为阳澄湖养殖水域与其他养殖水域的差异，阳澄湖大闸蟹的氨基酸含量高于其他养殖水域的螃蟹，阳澄湖大闸蟹的蟹膏、蟹黄等可食部位含量也高于非阳澄湖大闸蟹，因此蛋白含量的差异可以作为阳澄湖大闸蟹区别于其他蟹类的指标之一[2-3]。

每到大闸蟹上市前，不法商家常假借“阳澄湖”名义，非法销售其他品种大闸蟹[1-2]。当前假冒阳澄湖大闸蟹的花样繁多，除外地养殖后运至阳澄湖泡上1 个月的方式外，更有不法分子为了追求与阳澄湖大闸蟹品相一致，采用工业草酸浸泡等方式对冒牌品种进行“洗白”[4-5]。此类方式不仅对阳澄湖大闸蟹品牌造成损害，也对当地养殖效益产生相当大的不利影响，且经过工业试剂处理后的大闸蟹对消费者健康产生严重影响。为此，养殖户及当地政府采取了一些品种保护措施，如采用防伪戒指等。然而伪造“防伪戒指”的事件时有发生，消费者已很难通过防伪戒指来辨识阳澄湖大闸蟹的真假。对于普通消费者而言，从体貌形态已很难鉴别阳澄湖大闸蟹的真伪，形形色色的防伪戒指也让阳澄湖大闸蟹的辨识变得更加困难，如何采取更加科学有效的方式来鉴别阳澄湖大闸蟹的真伪，更好地保护当地品牌产业及广大消费者的切身利益成为业内及当地政府亟待解决的难题。

国内外尚无研究大闸蟹蛋白质组学的报道，也未出台大闸蟹蛋白质组学标准检测方法。目前，大闸蟹品种鉴别主要通过感官及经验判断，该方法准确度差，影响因素多，且目前许多不法商家采用后期在阳澄湖当地培养一段时间而将其命名为阳澄湖大闸蟹的方法，使质检人员及消费者难以辨别。用二维凝胶电泳可以对螃蟹肌肉组织蛋白提取液实现蛋白质组学分离分析，但其前期处理复杂，且螃蟹肌肉组织蛋白种类复杂，凝胶电泳的灵敏度及分辨能力较低，因此该方法不足以实现不同品种螃蟹的鉴定。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱( matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDITOF MS) 作为一种高效、精确的分析方法，可以使不易气化、电离的样品分子实现离子化，已经越来越多地被科研人员应用于蛋白质组学分析[6-9]。MALDI-TOF 质谱通过反映与组成有关的分子离子峰，提供了蛋白质分子的相对分子质量数据[10-11]。当前基于MALDI-TOF MS 蛋白质指纹图谱分析的方式已成功应用于临床微生物的物种鉴定，具有鉴定结果准确度高、操作简便、效率高等特点。国内也有很多研究将MALDI-TOF MS应用于肉类品种、风味特点、保存效果等[12-14]，如左惠心等[12]将MALDI-TOF MS 应用于牦牛与黄牛肌肉组织差异蛋白的生物信息分析。融智生物科技有限公司基于MALDI-TOF MS开发出猪肉品质鉴定技术，采用蛋白质组分子指纹图谱并结合深度学习算法实现了对病死猪肉和正常屠宰猪肉的种类鉴定[15-16]。

为了解决大闸蟹品种难以鉴定的问题，通过自主建立的方法提取不同大闸蟹蟹螯肌肉组织蛋白，将纯化后的提取液进行MALDI-TOF MS 生物质谱分析以获得其蛋白指纹图谱，并基于大数据及神经网络算法分析指纹图谱，解决大闸蟹品种品质难以鉴定的问题。可为基于MALDI-TOF MS的阳澄湖大闸蟹的溯源性分析提供技术依据，对促进苏州涉水企业品牌健康发展具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以江苏省苏州市人民政府《关于划定苏州阳澄湖大闸蟹原产地域范围的请示》提出的地域范围为准，本试验样本取自江苏省苏州市自然形成的阳澄湖水域。阳澄湖大闸蟹还需满足从苗种放养到成蟹养殖6 个月的养殖期，规格要求：母蟹125 g（2.5 两）以上，公蟹150 g（3 两）以上。阳澄湖大闸蟹样本采集为目录商家提供的阳澄湖大湖范围圈养蟹（大闸蟹栖息的水草放置于阳澄湖湖中，投喂饲料以玉米粒、螺蛳、小鱼等为主）；非阳澄湖大闸蟹为市场购买，连续数月收集非阳澄湖大闸蟹，作为可疑样本数据比对。将待测样本标记并冻存于-80 ℃冰箱备用。

首先，父母应重视家庭教育对个体健康人格培养的作用。家庭环境的质量通常被认为是决定青少年行为的重要因素。弗洛伊德特别强调，一个人的性格是由幼年的经验所决定的，精神分析学派认为家庭教育对人格的影响是潜移默化的，许多学生的问题，主要来自于他所身处的原生家庭，更确切地说，是家庭的问题引发了学生的心理或行为障碍。

2.2.4分类模型建立及验证 采集2 批样本进行测试，第1 批次采集样本数226 只，其中阳澄湖大闸蟹180 只，非阳澄湖大闸蟹46 只；第2 批次采集样本129只，其中阳澄湖大闸蟹51只，非阳澄湖大闸蟹78 只。将2 个批次355 只样本中选择阳澄湖和非阳澄湖大闸蟹各90 只作为测试集，利用支持向量机（SVM）建立鉴别模型并进行非线性预测（图8），红色为阳澄湖大闸蟹分布情况，蓝色为非阳澄湖大闸蟹分布情况，以全部样本为验证集对模型进行验证，鉴别准确率为69%，说明蛋白指纹图谱可以用于阳澄湖大闸蟹真伪鉴别。

1.2 试验方法

2.2.3阳澄湖大闸蟹及非阳澄湖大闸蟹蛋白图谱

于EP管内充分研磨，加1 mL 0.1% TFA，涡旋混匀后，超声处理10 min，除去提取液中脂类、组织碎片等杂质。基于MALDI-TOF MS的蟹鳌肌肉组织蛋白质谱分析条件探索：采用梯度稀释的方法获得适合MALDI-TOF MS 分析的最佳蛋白含量，选择0.1% TFA 进行蛋白提取（取20 µL 上清液，加180 µL 0.1% TFA，涡旋混匀），SA(芥子酸)作为基质液，优化MALDI-TOF MS仪器参数，以获得宽谱范围内最佳质谱图。MALDI-TOF MS 图谱采集数据过程：取2 µL 样品稀释液，加18 µL SA 基质混匀，滴加2 µL 于靶点正中，按照样品液与基质液1∶9 比例混匀，在质谱仪靶板正中点样滴加2 µL待测样本，低温静置待干燥后进行仪器分析。质谱检测m/z（质荷比，mass-to-charge ratio）范围为2 000~60 000，分析确定聚焦范围、激光能量等相关质谱分析参数进行扫描和采集数据。

2.2.2阳澄湖大闸蟹及非阳澄湖大闸蟹蛋白图谱m/z 聚焦范围确定 通过分析不同品种大闸蟹MALDI-TOF MS 谱图规律发现，阳澄湖大闸蟹蟹鳌肌肉组织在m/z 2 000~24 000 区间质谱峰更丰富，表明该品种大闸蟹蟹鳌肌肉组织中的多肽的种类分布更丰富；在m/z 小于10 000 范围内，阳澄湖蟹与非阳澄湖蟹蛋白的种类和蛋白图谱强度出峰强度高（图5）。蛋白谱图显示，阳澄湖大闸蟹在m/z 2 000~10 000之间出峰强度高，说明蛋白在低m/z区聚集。此外，在m/z大于24 000时，不同品种大闸蟹蟹鳌肌肉组织蛋白指纹图谱分布情况及不同蛋白相对丰度差异明显。综合分析发现，阳澄湖大闸蟹蟹鳌肌肉组织与非阳澄湖大闸蟹之间在多肽区域差异较为显著，故针对质谱图中m/z 2 000~24 000 区间进行深入分析，并结合Chem Pattern 化学计量学软件对大闸蟹MALDI-TOF MS 蛋白质指纹图谱进行统计分析，探索阳澄湖大闸蟹与其他品种、其他生长环境的蟹类肌肉组织蛋白在质谱图上差异。质谱分析发现，在 m/z 2 000～10 000 范围内出峰较多（图6A和C），说明蟹肉组织中多肽类物质种类丰富，而当m/z＞10 000 时出峰相对较少（图6B和D），故选择m/z=2 000～10 000 区间进一步分析不同来源湖蟹间指纹图谱差异。

聚焦激光能量确定 激光强度可以影响质谱峰的强度以及分辨率，能量越高，峰强度越高，但相应的分辨率会下降。利用MALDI-TOF MS技术的高灵敏度、高分辨率、宽检测范围的特点，在全m/z范围内对阳澄湖养殖区域的大闸蟹蟹组织进行蛋白质组学的检测。分析发现，在激光强度9 µJ 条件下，将阳澄湖养殖区域内的大闸蟹与非阳澄湖大闸蟹进行比对，图谱的信号强度较高、出峰较多且分辨率（resolution，R)较高，便于分析，结果如图7 所示。表明激光能量为9 µJ 时质谱图出峰强度及分辨率较好，因此选择该激光能量作为下一步数据模型分析的采集参数。

图1 蟹鳌肌肉组织Fig. 1 Tissue of the claw muscle

1.2.3MALDI-TOF MS 数据的采集 为获得最佳质谱效果图，质谱检测m/z 范围为2 000~60 000，设定m/z 10 000，选用脉冲能量9 µJ 作为激光强度进行扫描并采集数据[17]。结合机器学习算法对不同生活环境的大闸蟹组织蛋白指纹图谱进行深度分析。

1.2.4数据处理方法 通过Chem Pattern 化学计量学软件对大闸蟹MALDI-TOF MS蛋白质指纹图谱进行统计分析；通过支持向量机（support vector machine，SVM）进行非线性预测；将数据导入SPSS分析软件进行分析，利用配对样本t检验，检验阳澄湖大闸蟹与非阳澄湖大闸蟹之间的蛋白质含量是否具有显著性的统计学差异。

2 结果与分析

2.1 阳澄湖与非阳澄湖大闸蟹的外观差异

阳澄湖大闸蟹（图2）背部洁净且富有光泽的青灰色、呈半透明；蟹腹部洁白如玉不沾泥；蟹爪尖上有烟丝般的金黄色须毛；其中雄蟹绒毛细密而柔软、不带泥土屑，两螯8 条腿上有1 层金黄色的绒毛，长达3~4 cm。虽然各类大闸蟹外观相似，但是相较于其他湖蟹，阳澄湖大闸蟹的蛋白质、脂肪、维生素等营养元素的含量极高，蟹肉中还含有丰富的氨基酸，其中丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸、脯氨酸等呈甜味的氨基酸[1]，让阳澄湖大闸蟹肉质鲜嫩清甜，在口感、味道等方面明显不同于非阳澄湖大闸蟹。

2) RuntimeService：提供启动流程、查询流程实例和设置获取流程实例变量等功能。此外,提供对流程部署、流程定义和流程实例的存取服务。

图2 不同大闸蟹的外观Fig. 2 Appearance of different hairy crabs

三维解剖图和冠状位图像（图3）显示，相较于非阳澄湖大闸蟹，阳澄湖大闸蟹蟹鳌组织更多，尤其是两螯8 腿部分，且蟹黄更加饱满。阳澄湖大闸蟹与其他湖蟹存在明显差别，非阳澄湖的蟹黄体积明显小于阳澄湖大闸蟹，主要是因为阳澄湖大闸蟹洄游生殖的习性与众不同。阳澄湖作为距离入海口较近的湖泊之一，由于出水港口较多，湖水活性好，水体整体澄清，透明度高，使得阳澄湖大闸蟹具有清背、白肚、金爪、黄毛的特征。阳澄湖周边环境全部是生态绿地，工业污染少，水体清澄透明，是苏州的饮用水源地，湖水质量有保障；阳澄湖湖底淤泥少且沙质土壤坚硬，平坦的湖底为大闸蟹提供了广阔的爬行空间，充足的运动量使得大闸蟹肉质紧致结实，蟹两螯8 腿肉感强，强劲有力。阳澄湖大闸蟹的步足力量大，能在呈45°角倾斜的光滑玻璃上站立与爬行，而非阳澄湖的多数湖水呈弱酸性，对蟹壳具有一定的腐蚀性，在此环境中长大的蟹需要厚实且坚硬的蟹壳来抵挡湖水的侵蚀，蟹肉缺少甘甜的味道。

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设计了桥梁高速施工中大跨径连续施工技术，首先通过正向分析法，对大跨径桥梁进行正向分析，对桥梁评价指标进行实时获取。然后建立桥梁高速施工控制策略并进行控制计算，明确控制参数结果。最后实行施工监测，保证施工数据和理论数据相一致，实现桥梁大跨径连续高速施工。实验证明，设计的大跨径连续施工技术施工精确度和施工效率更高，具有推广价值。

图3 不同大闸蟹三维解剖图与冠状位图像Fig. 3 3D anatomy and coronal image of different hairy crabs

2.2 蟹蛋白质谱分析鉴定不同大闸蟹品种

2.2.1大闸蟹蛋白图谱特征分析 将纯化后的样品液进行MALDI-TOF MS生物质谱分析以获得其分子指纹图谱，分别采集蟹鳌组织关键取样点，比较各组不同来源蛋白质谱中差异性蛋白质的表达，呈现在质谱图中即数十个甚至上百个不同强度的质谱峰（图4）。同一物种在不同环境中表型会存在显著差异，其核心在于外界环境对物种的生存及代谢产生影响。试验结果显示，不同品种大闸蟹蟹鳌肌肉组织均存在比较丰富的多肽及蛋白质种类。比对不同品种大闸蟹蟹鳌肌肉组织质谱图发现，由于生长环境不同，阳澄湖大闸蟹蟹鳌肌肉组织蛋白指纹图谱相较于非阳澄湖大闸蟹存在显著性差异。

图4 MALDI-TOF MS采集的不同大闸蟹质谱Fig. 4 Mass spectra of different hairy crabs collected by MALDI-TOF MS

1.2.2蟹鳌肌肉组织蛋白质的提取取新鲜的蟹鳌肌肉组织(A、B、C、D，图1），样本混合后进行研磨，准确称取250 mg 研磨好的样品，加入1.0 mL 0.1% TFA，超声提取20 min；12 000 r·min-1离心10 min；吸取上清液20 µL于新EP管，加入180 µL 0.1% TFA，涡旋混匀；取2.0 µL 样品稀释液，加入18 µL SA基质液，涡旋混匀，取2.0 µL点样。样点自然干燥后，于2 h内进行MALDI-TOF MS测定。

图5 不同大闸蟹MALDI-TOF MS质谱差异对比Fig. 5 Comparison of mass spectra differences of different hairy crabs collected by MALDI-TOF MS

图6 不同m/z条件下大闸蟹质谱对比Fig. 6 Comparison of mass spectra of hairy crabs under different m/z

1.2.1大闸蟹蛋白质提取方法 称取蟹肉250 mg

从上表中可以看出，手机基站定位精度较低，且对其他定位方式的影响较小(比较GPS和GPS+手机基站，WIFI和WIFI+手机基站，GPS+WIFI和GPS+WIFI+手机基站)，WIFI+GPS定位精度较高。同时，一个显而易见的结果是，WIFI定位和手机基站定位无法定位出海拔高度，因为这两者本身给出的位置是平面性的，如需要确定位置海拔高度需卫星定位。

试剂包括购自融智生物科技(青岛)有限公司的三氟乙酸(trifluoroacetic acid，TFA)、芥子酸(sinapic acid， SA)基质液、0.01 mol·L-1的磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline，PBS， pH 7.4)、α-氰基-4-羟基肉桂酸(a-cyano-4-hydroxycinnamic acid，CHCA)，动物组织蛋白裂解液(赛默飞)等。

图8 支持向量机结果Fig. 8 Result of SVM

2.2.5统计分析 由表1 可知，阳澄湖大闸蟹的蛋白质m/z 平均值为10 621.27，非阳澄湖大闸蟹的蛋白质m/z 平均值为10 381.76，表明在阳澄湖大闸蟹蛋白质含量多于非阳澄湖大闸蟹，所以认为阳澄湖大闸蟹的品质更好。

第十届全国人大副委员长、原化工部部长顾秀莲，第十一届全国政协常委、第十届上海市政协主席蒋以任，上海市政府副秘书长、市国资委党委书记、主任宋依佳，中国石油和化学工业联合会副会长傅向升等出席座谈会并讲话；上海市交通委党组书记、主任谢峰，上海市应急管理局党组书记、局长马坚泓，上海市化学工业区管理委员会党委书记、主任马静出席座谈会；集团党委书记、董事长刘训峰作主题报告，总裁王霞主持。

表1 样本统计Table 1 Sample statistics

根据不同强度的质谱图，选取了m/z（2 000~10 000）中一共33 组数据进行配对样本t检验（表2），根据蟹鳌肌肉组织蛋白定性定量检测数据，阳澄湖大闸蟹的肌肉组织蛋白高于非阳澄湖大闸蟹，2 组螃蟹之间的显著性P值为0.000，显著性P值小于0.05，认为2 个螃蟹品种之间的蟹鳌肌肉组织蛋白的差异具有统计学意义。

表2 样本检验Table 2 Test of samples

3 讨 论

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)作为一种高效、精确的分析方法，可以使不易气化、电离的样品分子实现离子化。MALDI-TOF MS 质谱通过反映与组成有关的分子离子峰，提供了蛋白质分子的相对分子质量数据。

蟹螯肌肉组织蛋白种类丰富，呈现在质谱图中即数十个甚至上百个不同强度的质谱峰。将待测样本的指纹图谱与数据库进行对比，对样本的表达蛋白列表和每个蛋白表达量大小的综合积分进行计算分析，判断蛋白组图谱是否存在异常，从而实现螃蟹相似度评估。利用宽谱高分辨基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱在宽m/z 范围（1 000~300 000)内采用软电离方式进行蛋白组学的检测，选择合适的前处理方式且不引入降低离子化效率的化合物，使得没有或极少产生离子碎片，便于后期数据解析。 在一定范围内（m/z 2 000~50 000）可以明显识别阳澄湖大闸蟹与非阳澄湖大闸蟹在质谱图上的差异。m/z<10 000 范围内均有明显差异，扫描结果显示该区域出峰强度较高且分标率较高，可以作为区分阳澄湖大闸蟹与其他类别湖蟹的质谱分辨区。动物组织蛋白提取、MALDI-TOF MS 质谱蛋白质组学分析等技术手段在各领域都已比较成熟，技术风险较小。本研究结合这2 种技术运用到物种鉴定上，总体上风险可控，成功率较大；所用的化学试剂和药品都比较常见，试验方法简便易行。利用其高灵敏度、高分辨率、宽检测范围的特点实现大闸蟹品质的鉴定方案具有极高的可行性。

因此分析组织蛋白MALDI-TOF MS 谱图规律，建立不同品类螃蟹蛋白质分子指纹图谱数据库，探索本地阳澄湖大闸蟹与其他品种、其他生长环境的蟹类肌肉组织蛋白在质谱图上差异，并配合机器深度学习算法对数据库进行深度分析。该方法具有准确可靠、操作便捷快速、推广成本可控、高通量靶向监测和高通量非靶向筛查的特点，可用于鉴别阳澄湖大闸蟹真伪。