107份小麦育种亲本重要农艺性状基因的KASP检测

宋晓朋, 孔子明

(1.驻马店市农业科学院, 河南 驻马店 463000; 2.遂平县农业农村局, 河南 遂平 463100)

小麦是最重要的粮食作物之一,选育和推广高产、多抗、高效的小麦品种对保障国家粮食安全具有重要作用。传统的经验育种主要对小麦主要目标性状进行选择,以达到聚合目标性状优异等位基因[1],进而选育出符合育种目标的品种,这种育种方式是当前小麦品种选育的主要手段,但这种育种手段易受到育种家的经验和环境条件的影响,新品种的选育效率较低、育种周期长[2]。近年来,随着分子生物学技术的发展,小麦分子标记辅助育种越来越受到育种家的重视[3]。功能标记是依据与表型性状相关的功能基因的等位变异开发的分子标记,是小麦分子标记辅助育种的理想标记[4]。Liu等[5]对小麦农艺性状、抗逆性等的功能标记进行了总结,为小麦分子标记辅助选择与常规育种结合提供了途径。

竞争性等位基因特异性PCR(Kompetitive Allel-Specific PCR,KASP)是一种利用荧光检测技术对基因组中特定位点进行双等位基因监测的基因分型技术,已经用于小麦种质资源的鉴定[6]。Rasheed等[7]对70个与小麦性状相关KASP标记进行了验证,分子标记检测效率得到了极大提高,为分子标记辅助育种和种质资源的鉴定提供参考。张维军等[8]利用粒重基因相关的KASP标记对宁夏灌区小麦种质的粒重进行检测,筛选出聚合多个基因的优异单位型的种质;权有娟等[9]通过KASP标记对青海和西藏小麦种质的光周期基因进行检测,发现光周期不敏感型在小麦品种中占主导地位;王志伟等[10]利用株高和粒重相关的KASP标记对云南小麦种质进行筛选,鉴定含有目标基因的优异种质;张颖君等[11]对336份小麦种质材料的抗赤霉病基因进行KASP标记监测,发掘携带Fhb1基因的材料,为黄淮冬麦区抗赤霉病育种提供参考。前期课题组保存了一批农艺性状较好的核心育种材料,但对这些品种携带的重要性状的功能基因还不清楚,为提高育成品系中优异等位基因的比例,本研究利用与小麦重要性状相关的KASP标记对育种亲本进行检测,明确育种材料中相关功能基因的单倍型的比例,为进一步利用材料和分子标记辅助选择育种提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

参试的107份小麦品种(系)为本课题组收集保存的小麦育种亲本,其中陕西育成的品种(系)71份,其他地方(河南、山东、河北、江苏)育成的品种(系)为36份,参试品种(系)的信息详见表1。

表1 供试材料名称及来源

1.2 KASP标记检测

参试材料于三叶期进行采样,采用CTAB法提取叶片DNA[12],DNA质量控制通过Nanodrop One检测完成。相关性状功能基因包括2个株高相关基因(Rht-B1、Rht-D2),3个光周期基因(Ppd-A1、Ppd-B1和Ppd-D1),4个春化基因(Vrn-A1、Vrn-B1、Vrn-D1、VRN-B3),3个早熟基因(TaELF3-B1、TaElf3-D1、TaMOT1-D1),1BL/1RS易位系,12个籽粒性状相关基因(TaCwi-A1、TaCKX-D1、TaGASR7-A1、TaSus1-7A、TaSus1-7B、TaSus2-2A、TaSus2-2B、TaGS-D1、TaGS5-A1、TaGW2-6A、TaGW2-6B、TaTGW6-4A),4个穗发芽抗性相关基因(TaPHS1、TaMFT-A1、Vp-B1、TaSdr-B1),7个抗旱相关基因(CWI-4A、CWI-5D、TaMoc-A1、TaSST-A2、TaSST-D1、Dreb-B1、1-feh-w3),14个抗病虫基因(Fhb1、Cre8、Rlnn1、Pch1、Sr2、Sr36、Lr9、Lr14a、Lr21、Lr34、Lr47、Lr67、Sbm1、Tsn1)。KASP标记检测程序参考Rasheed等[7]设计的流程,标记检测由西北农林科技大学完成。

1.3 数据处理

试验材料基因分型结果的统计用Excel软件和Origin2018软件完成,聚类图采用类平均法(UPGMA)进行绘制并在iTOL网站进行优化处理。

2 结果分析

2.1 适应性相关基因的检测

在株高相关基因检测中,主要对主效株高基因Rht-B1和Rht-D1进行KASP标记检测,供试材料中携带2个矮秆基因的优势单倍型分别有58份和76份,其中Rht-B1矮秆单倍型在陕西育成材料中比例较低,Rht-D1矮秆单倍型在陕西育成材料中比例较高;光周期和春化基因与小麦的适应性密切相关,在光周期基因的KASP标记检测中,光周期不敏感单倍型Ppd-A1a、Ppd-B1a在供试材料中的比例分别为83.18%和94.39%(图1),在陕西和其他地方育成的材料中比例较为接近,而供试材料全部含有Ppd-D1优异等位基因;春化基因Vrn-A1和Vrn-B1晚开花的单倍型在供试材料中占比都达到了90%以上,Vrn-D1晚开花单倍型在陕西和其他地方育成的材料中比例分别为76.06%和63.89%(表2),Vrn-D1是主要的春化基因;早熟基因中,同时携带3个早开花基因单倍型在供试材料中只有航麦247和轮选987;小麦品种中携带1BL/1RS易位系可以提高品种的适应性,供试材料有44份含有1BL/1RS易位系,占41.12%,陕西育成的材料中携带1BL/1RS的比例较低。

图1 供试材料部分KASP标记等位基因占比

图2 107份小麦种质基于KASP标记的聚类分析结果

表2 不同地方育成种质部分农艺性状相关基因的KASP标记检测

2.2 籽粒性状相关基因的检测

籽粒大小和千粒重是小麦籽粒产量的重要影响因素,本研究利用12个与籽粒大小和千粒重相关的基因对供试材料进行检测,在供试材料中没有检测到千粒重高的单倍型TaCKX-D1a,而供试材料含有TaSus1-7A、TaGW2-6B和TaTGW6-4A高千粒重单倍型的比例都较高;TaSus1-7B、TaSus2-2A、TaSus2-2B、TaGS-D1、TaGW2-6A在陕西和其他地方育成的材料中高千粒重单倍型的比例相差不大,TaCwi-A1优异单倍型的比例在陕西和其他地方育成的材料中占比分别为40.85%和69.44%(表2),差别较大;籽粒大优异单倍型TaGASR7-A1-H1c在陕西育成的材料中占比较低,而其他地方的材料都携带了这个基因的优异单倍型,TaGS5-A1b优异单倍型在陕西和其他地方育成材料中的比例分别为92.96%和69.44%(表2),相差较大。

2.3 抗穗发芽相关基因的检测

TaPHS1是白粒小麦中的抗穗发芽基因,供试材料携带该基因穗发芽抗性单倍型的比例为82.24%,在陕西和其他地方育成的品系中抗性比例差别不大。TaMFT-A1、Vp-B1和TaSdr-B1也是小麦穗发芽抗性基因,这些基因的优异单倍型在陕西和其他地方育成材料中的比例都不高,聚合这些优异等位基因对小麦抗穗发芽品种选育具有重要意义。

2.4 抗旱基因的检测

供试材料大多都携带抗旱基因CWI-5D和TaSST-A2优异单倍型,CWI-4A和TaMoc-A1在干旱情况下能使品种维持较高的穗粒数,CWI-4A优异单倍型比例在供试材料中较高,而TaMoc-A1优异单倍型的比例较低,这2个基因优异单倍型在陕西育成材料中的比例较低;TaSST-D1和1-feh-w3优异单倍型在其他地方育成材料的比例较高,分别为80.56%和47.22%(表2),而陕西育成的材料含有Dreb-B1的比例较高,占29.58%。

2.5 抗病虫基因的检测

Fhb1是小麦赤霉病抗性的主效基因,在供试材料中没有携带赤霉病抗性基因。小麦秆锈病抗性基因Sr2和Sr36在陕西育成的材料都没有检测到,Sr36抗性基因在其他地方育成的材料只有3份,比例偏低。抗叶锈病基因Lr21、Lr34、Lr47、Lr67在供试材料中均没有检测到抗性等位基因,只有4份含有Lr9抗性基因,而Lr14a抗叶锈病基因在陕西育成的材料中的比例较低,仅为15.49%。Sbm1是抗土传黄花叶病的基因,仅有5份材料携带抗性基因,陕西育成材料中携带抗褐斑病基因Tsn1的比例较高,达到85.92%。抗禾谷孢囊线虫病基因Cre8在供试材料中的比例较低,仅有6份材料携带抗性基因,Rlnn1是小麦抗根腐线虫病基因,在陕西育成材料中的比例较高,占26.76%。

2.6 基于KASP标记聚类分析

为了深入了解供试材料之间的亲缘关系,采用功能基因的KASP标记对107份小麦种质进行聚类,航麦247、轮选987和淮麦22聚为一类,中优9507单独聚为一类,一些种质基于功能基因KASP的遗传关系较近,如秦鑫216与小偃22、武农36与武农3号等,不同地方选育出的种质在聚类的不同分支中均有出现,材料之间出现了较强的融合,没有明显的分离现象。

3 讨 论

小麦1BL/1RS易位系与小麦抗病、抗逆等密切相关,携带该1BL/1RS易位系能够提高小麦品种的产量和增强对环境的适应能力,但是对小麦品质性状有不利的影响,会使面团粘性增大,烘烤品质变劣[13]。本研究供试材料中1BL/1RS易位系的比例占41.12%,陕西育成的材料中比例相对较低,占38.03%,这与本地区小麦品种选育重视品质育种有关。株高对小麦产量影响较大,在小麦品种后代选择中是重要指标,应用矮秆基因降低株高和提高籽粒产量是小麦高产育种的主要育种策略之一[14],本研究中2个主效矮秆基因Rht-B1和Rht-D1优势单倍型在陕西和其他地方育成的材料中占比差别较大,对育成材料影响较大。Vrn-D1是主要的春化基因,在供试材料中多态性较高。小麦产量性状可利用的功能标记较少,目前主要研究集中于小麦籽粒性状功能标记的开发,本研究中小麦籽粒性状的KASP标记都为微效基因控制,基因效应较小,聚合多个有利基因位点能够增加粒重。同样,抗穗发芽也都是微效基因,本研究中陕西育成的材料中有8份材料聚合了4个微效穗发芽抗性基因,可以作为抗穗发芽的重要亲本来源。在抗旱基因检测中,大部分材料没有携带多个抗旱基因,师栾02-1和金禾9123聚合了多个抗旱基因,这与河北地区重视抗旱育种有关[15]。小麦抗病基因可以利用的功能标记较少,本研究在多份种质中检测到Lr14a基因,该基因位于小麦7BL染色体上,可以作为抗叶锈的种质,但葛润静等[16]研究发现,该基因已经丧失对叶锈病的抗性。本研究利用功能标记对育种亲本进行优异等位基因的检测,通过分子标记辅助选择聚合优异性状基因,为品种选育提供依据。

随着小麦高通量测序技术的不断发展,许多性状的功能基因得到克隆,功能基因的KASP标记数量逐步增多,但是在小麦分子育种中应用还面临着许多挑战[17]。本研究利用功能基因的KASP标记对试验种质检测中发现部分功能基因标记的多态性较低,不能有效区分材料,这可能与试验选用的种质有关。基因聚合是小麦分子育种的主要策略,本研究中抗病和产量性状基因较少,随着小麦基因定位的不断深入,更多的KASP标记加入到分子标记辅助育种体系中。筛选出育种价值较高的功能基因标记是小麦分子标记辅助选择育种的主要程序,使用功能基因KASP标记对育种亲本进行检测,明确育种材料中重要性状的优异等位基因分布,通过不同的育种手段将多个有利等位基因聚合,为后续实现常规育种与分子标记辅助育种结合提供重要参考。