乙二醇壳聚糖自愈合水凝胶的制备及性能

徐文静，梁建荣，曲萌菲，王艺璇，侯冰娜，赵琳琳，张杭*，李征征，3*

（1 天津科技大学 化工与材料学院，天津 300457；2 天津理工大学 材料科学与工程学院，天津 300457；3 复旦大学 聚合物分子工程国家重点实验室，上海 200433）

水凝胶是由亲水聚合物制成的交联聚合物网络，能够吸收并保留高含量的水，同时保持其三维结构完整性［1-2］。传统水凝胶材料在使用过程易发生结构变化或机械损伤，且损伤后性能大大降低，无法继续满足使用要求。自愈合水凝胶是指水凝胶体系承受外界应力而被部分破坏后，能自发地或在一定外界刺激下恢复体系原有的部分力学性能和形态的一类水凝胶，是一类重要的新型耐久性材料，常通过物理交联或化学交联两种策略制备［3-4］。然而某些自我修复过程需要在非生理条件下进行刺激［5］，对细胞或组织可能造成不可逆转的损害。目前关于自愈合水凝胶的研究集中在自主修复上［6］，即在没有任何外部刺激的情况下恢复其原始结构和功能、延长使用寿命并提高安全性。

壳聚糖是一类具有良好的生物相容性和生物降解性的天然碱性多糖［7-8］。与壳聚糖相比，乙二醇壳聚糖（GC）是一种水溶性壳聚糖衍生物。GC 含有氨基（─NH2）和羧基（─COOH），使其易于进行化学改性，因此研究人员在生物医学领域，如药物传递载体、抗菌材料、基因传递系统和组织工程等领域对GC 进行了大量研究［9-10］。Zhao 等［11］利用1，6-二异氰酸根合己烷和聚乙二醇形成交联剂，以乙二醇壳聚糖（GC）为原料，制备一种能够应用于软骨治疗的壳聚糖水凝胶。将该壳聚糖水凝胶构建的组织工程化软骨移植到有缺陷的兔关节软骨中，术后的形态学结果表明，再生组织与正常组织紧密相连且边界模糊，二者软骨腔极为相似，达到修复缺损关节软骨的目的。Huang 等［12］通过全原子模拟研究了由乙二醇壳聚糖（GC）和遥爪双功能聚乙二醇（DF-PEG）合成的GC-DP 自愈合水凝胶用于递送抗癌药物吉西他滨。在不同药物浓度下构建了两种药物递送系统的全原子模型，证实GCDP 水凝胶和吉西他滨之间的主要相互作用机制为范德华吸附，并确定不同浓度（10%，40%，80%，质量分数，下同）的GC-DP 水凝胶对吉西他滨表现出1.76×10-5～2.34×10-5cm2/s 的药物扩散速率。

海藻酸钠（SA）具有良好的生物相容性和生物降解性，在药物载体领域引起了关注［13］。SA 在一定条件下会被氧化引入醛基，从而增强自身的功能性。醛基（─CHO）和氨基（─NH2）之间形成的希夫碱键是一种动态共价键，在中性条件中，亚胺键可以不断地断裂与重组，快速达到化学平衡。侯冰娜等［14］利用羧甲基壳聚糖与氧化海藻酸钠（OSA）为原料，通过席夫碱反应形成动态亚胺交联网络，使得水凝胶在损伤后6 h 内完成自愈合。Qiao 等［15］采用二苯甲醛改性的聚乙二醇（PEG-CHO）交联己二酸二肼改性的海藻酸钠（ALG-ADH），在不破坏吡喃环结构的前提下制备PEG-CHO/ALG-ADH 自愈合高强度水凝胶。当交联剂浓度为5%时，基于动态酰腙共价键和多重氢键的天然海藻酸盐水凝胶的剪切模量可达0.234 MPa。

本工作以通过NaIO4为氧化剂制得的氧化海藻酸钠（OSA）与乙二醇壳聚糖（GC）为原料，制备了一种基于亚胺键交联的OSA-GC 自愈合水凝胶，并探究OSA 与GC 的质量比对OSA-GC 自愈合水凝胶的微观形貌、溶胀性能、降解速率等理化性质的影响。此外，本研究以吉西他滨为模型药物，考察了OSA-GC自愈合水凝胶的体外药物释放性能。

1 实验材料与方法

1.1 试剂

乙二醇壳聚糖购于和光制药工业株式会社，纯度为60%，聚合度＞400；吉西他滨，纯度＞99%，购于上海阿拉丁生物科技有限公司；海藻酸钠、高碘酸钠均购于天津市大茂化学厂，分析纯；乙二醇购于天津市晶鑫化学试剂厂，分析纯；鸡蛋清溶菌酶购于上海阿拉丁试剂有限公司。

1.2 OSA-GC 水凝胶的制备

在室温避光条件下将2.0 g 海藻酸钠和2.5 g 高碘酸钠添加到200 mL 去离子水中。6 h后，添加5 mL乙二醇以中和过量高碘盐。然后，将产物在透析管（MWCO，3500）中用蒸馏水渗析3天，经FD-1型冷冻干燥机，冷冻干燥后，得到白色絮状的氧化海藻酸钠（OSA）。

根据一定的质量比移取GC 和OSA 于烧杯中，加入1 mL 去离子水，用TDZ4-WS 型磁力搅拌器，搅拌5～10 s，倒入圆柱形模具中后放置成型，制得OSAGC 水凝胶样品。

1.3 测试与性能表征

1.3.1 傅里叶变换红外光谱（FT-IR）

普通词汇重复表达专门词汇的已有之义也会导致一词多译,如“担保责任”的一个译名“guarantee liability”,从《元照英美法词典》中查证得知“guarantee”一词本身已经含有“保证人的责任”的含义,“liability”在此就显得有些多余,降低了术语翻译的简洁性。

采用MAGNA560型傅里叶红外光谱仪（FT-IR）对OSA，OSA-GC 进行表征。样品用KBr压片，测试波数范围为400～4000 cm－1，在4 cm－1分辨率下扫描32 次。

1.3.2 流变学测量

通过RS6000 旋转流变仪测试OSA-GC 水凝胶的动态黏弹性。将厚度为1.0 mm 的水凝胶样品放置于直径为20 mm 旋转流变仪的平行板之间，测试37 ℃时OSA-GC 水凝胶的储能模量（G'）与损耗模量（G''）随应变（γ）的变化曲线，测试条件为频率1 Hz；应变1%。

1.3.3 微观形貌

采用JSM-7000F 型场致发射扫描电子显微镜观察OSA-GC 水凝胶的微观形貌。将冷冻干燥的样品放入液氮中淬断，进行喷金处理，用场致扫描电子显微镜观察OSA-GC 水凝胶样品的微观形貌。

1.3.4 自愈合性能

使用刀片将水凝胶（直径20 mm，厚3 mm）切成两段，分别用亚甲基蓝和罗丹明B 染色。将水凝胶碎片重新组装，并使其在没有其他处理的情况下，在环境条件下自愈合2 h，然后进行手动拉伸。将自愈合的OSA-GC 水凝胶浸入PBS 溶液（pH＝7.4）中以观察水凝胶的完整状态。

1.3.5 溶胀特征

式中：Wt和Wd分别表示在时间为t时，溶胀和干燥的水凝胶的质量。

1.3.6 体外降解性能

将冷冻干燥的OSA-GC 水凝胶样品使用分析天平称重（M），浸于含有鸡蛋清溶菌酶（10 mg/mL）的pH 值为7.4 的PBS 中培养，通过质量变化来计算水凝胶的体外酶降解情况。在固定时间点取出OSA-GC水凝胶样品，用去离子水冲洗后吸干表面水分，并冷冻干燥称重（m），根据下式（2）计算水凝胶的质量损失率Ma：

1.3.7 体外药物释放

以吉西他滨为药物模型，采用Mini-1024 型紫外光-可见分光光度计测试OSA-GC 水凝胶对抗癌药物吉西他滨的体外药物释放性能。将负载吉西他滨（0.01 %）的OSA-GC 水凝胶在低温条件下溶于PBS溶液中。在5 mL 的试管中配制浓度为10 mg/mL 吉西他滨溶液。将OSA-GC 载药水凝胶放置在装有10 mL PBS 缓冲液的试管中，然后在37 ℃的水浴摇床中以60 r/min 的振荡速度培养。在一定时间后，取出1 mL PBS，加入等量新鲜PBS 以补偿释放介质。每个样品测量3 次，取平均值进行药物释放研究［16］。通过Mini-1024 型紫外光-可见分光光度计绘制关于释放介质中药物浓度和累积释放量的标准曲线。累积的药物释放速率Ar可以通过式（3）计算［17］。

式中：V0为释放介质的总体积；ct是在某个时间点测量的吉西他滨在PBS 中的浓度；V是每次采集的PBS 体积；b是开始采集的次数；t是结束采集的次数；c是每次PBS 浓度的求和；m是OSA-GC 水凝胶的载药量。

2 结果与分析

2.1 OSA 及OSA-GC 水凝胶的制备与表征

在室温条件下，先将海藻酸钠（SA）通过高碘酸钠进行氧化得到氧化海藻酸钠（OSA），再以GC 与OSA为原料，通过GC 的氨基与OSA 的醛基进行席夫碱反应，得到以亚胺键交联的OSA-GC 水凝胶，反应式如图1 所示。如表1 所示，通过改变OSA 与GC 的质量比（3∶3，3∶4 及3∶5）调节OSA-GC 水凝胶体系中的亚胺键含量，从而调节OSA-GC 水凝胶的物理化学性质。

图1 OSA-GC 合成路线示意图Fig.1 Synthetic route of OSA-GC hydrogels

通过1H NMR 和FT-IR 表征OSA 和OSA-GC 的化学结构。OSA 的核磁共振氢谱图如图2（a）所示，D2O 峰（δ=4.65）作为参考峰，δ=3.2～4.0 处的重叠峰是糖醛酸上H2～H5 的质子峰。与SA 相比，δ=4.1～5.2 处的重叠峰是氧化糖醛酸上H6～H7 的质子吸收峰，而δ=5.37 和δ=5.64 处是醛基与羟基结合形成的半缩醛的质子吸收峰，表明成功制备了OSA。

OSA 和OSA-GC 的FT-IR 光谱如图2（b）所示，与SA 谱图相比，OSA 谱图在1730 cm－1处出现了新的特征峰，为醛基的伸缩振动吸收峰，证实通过氧化反应成功制备OSA。与GC 相比，OSA-GC 在1675 cm－1处出现了亚胺基的伸缩振动吸收峰，1425 cm－1处的氨基吸收峰减弱，而与OSA 相比，OSA-GC 在1735 cm－1处的醛基吸收峰消失，表明GC 分子链上的氨基与OSA 的醛基发生席夫碱反应，成功制备了OSAGC 水凝胶。

2.2 OSA-GC 水凝胶的微观形貌

通过扫描电子显微镜观察到OSA-GC 水凝胶微观形貌。图3 为不同配比的OSA-GC 水凝胶的SEM图。OSA-GC 水凝胶具有孔隙之间相互连通的结构特点。OSA-GC1，OSA-GC2 和OSA-GC3 水凝胶样品的孔径分别为150～280，120～210 μm 和50～120 μm。随着GC 浓度的增加，OSA-GC 水凝胶体系中亚胺键的数量不断增加，从而使得OSA-GC 水凝胶交联密度增加，孔隙逐渐缩小，孔隙结构更为致密。结果表明，通过改变OSA/GC 的质量比能够调节OSAGC 水凝胶的孔径。OSA-GC 水凝胶在药物释放及组织工程领域具有较好的应用前景。

图3 OSA-GC1（a），OSA-GC2（b）和OSA-GC3（c）水凝胶的SEM 图Fig.3 SEM images of surface morphology of lyophilized OSA-GC1（a），OSA-GC2（b）and OSA-GC3（c）hydrogels

2.3 OSA-GC 水凝胶自愈合性能

图4 展示了OSA-GC 水凝胶的自愈合性能。如图4（a）所示，将使用亚甲基蓝和罗丹明B 染料染色的两部分OSA-GC 水凝胶放置在室温条件下，OSA-GC水凝胶在无外界刺激时2 h 实现自愈合。如图4（b）所示，两部分OSA-GC 水凝胶被完全染色，并且当手动拉伸修复的水凝胶时，OSA-GC 水凝胶不会从中间的拼接处分离。将自愈合的OSA-GC 水凝胶浸入PBS 溶液中后，未观察到OSA-GC 水凝胶发生分离，其形态结构仍保持完整状态。实验结果表明，OSA-GC 水凝胶能够在无外界刺激2 h 实现自愈合，从而证明了亚胺键的动力学特性及OSA-GC 水凝胶的自愈合性能。

图4 OSA-GC2 水凝胶的自愈合示意图（a）罗丹明B 和亚甲基蓝染色水凝胶；（b）2 h 后拉伸OSA-GC2 水凝胶；（c）将自愈合OSA-GC2 水凝胶浸入PBS 溶液中Fig.4 Self-healing schematic diagram of OSA-GC2 hydrogel（a）rhodamine B and methylene blue stained hydrogel；（b）stretched self-healing hydrogel after 2 h；（c）immersed self-healing hydrogel in PBS solution

2.4 OSA-GC 水凝胶的力学性能

通过流变学实验研究了OSA-GC 自愈合水凝胶的力学性能。图5 显示了不同配比的OSA-GC 水凝胶的储能模量（G'）和损耗模量（G''）随应变的变化曲线。在整个应变范围内，OSA-GC 水凝胶的G'值大于G''值，表明OSA-GC 始终处于凝胶状态。随着GC 含量的增加，OSA-GC 水凝胶的G'值逐渐升高，OSAGC3 水凝胶的弹性明显高于其他水凝胶，而这些水凝胶的G''相似，这是由OSA-GC 水凝胶的交联密度所决定的。GC 浓度的增加使得体系中氨基与醛基形成的亚胺键数量增多，交联密度增大，因此在OSA-GC水凝胶中形成了更具弹性的交联网络。结果表明通过增加OSA-GC 水凝胶的交联密度能够增强OSAGC 水凝胶的力学性能。

图5 OSA-GC 水凝胶的应变依赖性流变行为Fig.5 Strain-dependent rheological behavior of OSA-GC hydrogel

2.5 OSA-GC 水凝胶的溶胀性能

OSA-GC 水凝胶的溶胀性能如图6 所示。在37 ℃下，OSA-GC 水凝胶的溶胀率随时间延长逐渐增加，并在120 h 达到溶胀平衡。OSA-GC 水凝胶的平衡溶胀率分别为112.1，89.2 和71.3。随着GC 浓度的增大，OSA-GC 水凝胶的平衡溶胀率降低。OSA 的醛基与GC 的氨基发生交联反应形成OSA-GC 水凝胶，较高的GC 含量使OSA-GC 水凝胶的交联密度增加，孔隙率增加，孔径减小，从而使得OSA-GC 水凝胶的溶胀率随交联密度增大而减小［18］。

图6 OSA-GC 水凝胶的溶胀性能Fig.6 Swelling property of OSA-CMCS hydrogels in PBS

2.6 OSA-GC 水凝胶的体外生物降解性能

为研究OSA-GC 自愈合水凝胶的体外生物降解性能，在37 ℃的条件下，将OSA-GC 水凝胶在含有溶菌酶（10 mg/mL）的PBS 中培育。如图7 所示，随降解时间的延长，OSA-GC 水凝胶的质量损失逐渐增大，降解速率逐渐减慢。在降解12 天后，OSA-GC 水凝胶的质量损失分别达到51.9%，47.2%和43.1%。结果表明，OSA-GC 水凝胶的交联度增大使OSA-GC 水凝胶交联网络的空间位阻效应增强，从而导致OSA-GC水凝胶的酶促降解反应速率降低。OSA-GC 水凝胶的生物降解性能够使其应用于药物载体或组织工程等生物医学领域。

图7 OSA-GC 水凝胶的体外降解速率曲线Fig.7 In vitro degradation rate of OSA-GC hydrogel

2.7 OSA-GC 水凝胶的体外药物释放性能

将抗癌药物吉西他滨作为模型药物载入OSAGC 水凝胶中，并进行了体外药物释放性能研究。图8显示了负载吉西他滨的OSA-GC 水凝胶的累积释放曲线。在初始阶段，OSA-GC 水凝胶负载的吉西他滨释放速率较快。随着释放时间的延长，吉西他滨的释放速率逐渐减慢，曲线斜率接近零，表明OSA-GC 载药凝胶的药物释放达到平衡。在释放初期，吉西他滨在OSA-GC 水凝胶表面和释放介质之间的浓度梯度较大，从而导致突释现象的出现，有利于初期控制肿瘤的生长，随着时间的延长，OSA-GC 水凝胶内部的吉西他滨向介质中不断扩散，OSA-GC 水凝胶表面和释放介质中吉西他滨的浓度梯度逐渐降低，使得吉西他滨的释放速率减缓。负载吉西他滨的OSA-GC 水凝胶的药物释放量达到72.6%～89.5%，药物释放时间达到48 h。OSA-GC 水凝胶对吉西他滨的药物释放具有一定的缓释作用，在可注射药物载体领域具有较好的应用前景［19-21］。

图8 OSA-GC 水凝胶的药物释放性能Fig.8 Drug release property of OSA-GC hydrogel

3 结论

（1）利用氧化海藻酸钠（OSA）与乙二醇壳聚糖（GC）发生席夫碱反应，制备具有自愈合性能的OSAGC 水凝胶。在室温条件下，OSA-GC 水凝胶能够在2 h 后实现自愈合，且该过程无需外界刺激。

（2）OSA-GC 水凝胶具有三维网络状微孔结构。通过控制OSA 与GC 的质量比，OSA-GC 水凝胶的孔径处于50～280 μm。OSA-GC 水凝胶在120 h 达到溶胀平衡，溶胀率达到71.3～112.1。OSA-GC 水凝胶在含有溶菌酶（10 mg/mL）的PBS中发生降解，在12天后OSA-GC水凝胶的质量损失达到43.1%～51.9%。

（3）OSA-GC 自愈合水凝胶对抗癌药物吉西他滨具有缓释作用，药物释放时间可达48 h，药物释放量达到72.6%～89.5%。OSA-GC 自愈合水凝胶在药物递送领域具有较好的应用前景。