超声靶向微泡破坏技术在心血管疾病治疗中应用的研究进展

吕霖漪,刘学兵

心血管疾病是全球范围内发病率和致死率较高的疾病之一,其中药物治疗效果差及难治性心脏病病人逐年增加。随着超声分子影像及精准医疗的发展,超声靶向微泡破坏技术(UTMD)联合基因治疗具有简便、微创性、靶向性、安全性等优点,已成为近年来研究的热点之一。相关研究表明,UTMD搭载基因治疗心血管疾病,在基因或分子靶向精准传递方面具有安全、可重复的特点[1],可提高基因转染率[2-3]、促进血管再生[4]、改善心室重构[5]、恢复心功能,在心脏疾病治疗中显示出良好的发展前景。现对UTMD应用于心脏疾病治疗的研究进展进行综述。

1 UTMD的作用原理

因微泡中气体强反射超声的物理特性,常作为超声造影剂,在可视情况下超声辐照微泡可实现被动靶向爆破;另外一种在微泡上连接靶向物质,使微泡向靶组织聚集,实现主动靶向,高能超声辐照使微泡“爆破”,在组织局部产生“空化效应”“机械效应”及“温热效应”等多种生物学效应。其中“空化效应”中的“瞬态空化”或称“惯性空化”,使微泡内部产生能量的局部聚集融合,内部温度与压力不断增大,微泡自身发生振动,不断膨胀与缩小,达到临界直至爆裂释放出能量[6]。该过程可产生一定程度的高振幅震荡、冲击波、内切力等,对血管环境造成一定影响,改变血管内皮细胞状态,使内皮细胞膜产生短暂的孔隙,增强细胞膜、血管通透性,破坏血管内血栓等。若微泡内结合其他物质,如基因、药物等,在空化效应的作用下实现可视化靶向治疗。因微泡可吸收和散射比周围组织更大的超声信号,故可改变超声信号压力,有效提高成像对比度,增强图像质量[7]。超声波辐照微泡可降低超声空化阈值,产生的机械刺激、热效应及生物效应,诱导心肌细胞膜通透性改变、钙离子浓度改变及血流量增加,最终促进心肌细胞正性肌力作用[8]。根据超声靶向爆破微泡这一原理,该技术在临床工作中应用,尤其是在心血管疾病的治疗中取得了显著的进展。

2 心脏疾病靶向微泡的研究进展

靶向微泡材料多样,多由气核和外壳组成。常用的包括蛋白质类、脂类物质、糖类物质、高分子聚合物等,不同材质的微泡在应用中发挥着不同的作用。目前临床应用中的微泡多数含有氟化气体。有研究表明,人血清清蛋白中加入蔗糖并通入低溶解性的惰性气体如全氟丙烷气体,可获得稳定的清蛋白微泡[8],当其组成达到一定比例、浓度达到一定数值时,有较好的心肌显影,常作为分子成像造影剂。因清蛋白带有正电荷的氨基和带负电荷的羧基,当心肌发生炎症时,该区域的酸碱度及电荷发生变化,清蛋白微泡的电荷与该区域的电荷相吸,发生微泡延迟清除,从而达到靶向显影。与通入可溶性气体比较,通入低溶解性惰性气体的微泡在血液中具有较好的稳定性,可获得较长的存留时间[9]。与蛋白质类微泡比较,脂类微泡具有较好的稳定性、选择性、靶向性,因其能在水中形成脂质体,可在某特定部位大量快速聚集,显著增强回声信号,达到更佳造影效果,常用于基因荷载、无创评价心肌功能、定位病灶部位并评估严重程度等。Phillips等[10]研究显示,靶向血管细胞黏附分子1(VCAM-1)微泡可增强图像强度,有助于早期发现动脉粥样硬化。相关研究显示,采用磷脂杂化法技术制备的微泡具有的稳定性和显影效果[11]。阳离子脂质制备的微泡具有较好的基因携带能力[12]。Zhang等[13]研究显示,由于阳离子微泡(CMBs)具有较高的阳性电位,其DNA结合能力显著增强,每5×108CMB的DNA装载量为(17.81±1.46)μg。糖类物质组成的微泡具有较好的安全性及生物相容性。高分子聚合物组成的微泡具有稳定性的膜成分,可有效抵御巨噬细胞的吞噬,用于免疫系统造影,如淋巴循环。通过制备淋巴细胞-微泡复合物,探讨移植心脏早期的急性淋巴细胞排斥反应[14]。因重组人尿激酶原可特异性靶向溶栓,有研究将尿激酶与精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丝氨酸(RGDS)按一定比例结合,并与微泡联合组成的复合物用于血栓的溶解再通,结果显示再通率高达93%[15]。

3 用于经皮冠状动脉介入(PCI)术后并发症的治疗

PCI手术常用于治疗冠状动脉狭窄,通过经皮置入支架或球囊扩张建立血管再通。急性ST段抬高型心肌梗死(STEMI)病人PCI术前、术后,向微血管内注入微泡,并在超声换能器的高或低机械指数脉冲下,评估进门至扩张时间,与急诊采取PCI手术比较,可显著提高左室射血分数,且1个月后微血管阻塞比例明显减小,有助于改善早期心外膜通畅率,提高微血管流量[16]。无复流、再狭窄是PCI术后常见并发症,导致远端心肌细胞无法维持血流灌注,严重影响病人预后。近年来PCI术后并发症防治的研究逐渐增多。Phillips等[10]研究表明,VCAM-1靶向微泡能特异性与术后急性损伤的炎症血管平滑肌细胞结合,进行基因与药物传递,为早期检测和治疗支架内再狭窄提供思路。王宇豪等[17]在大鼠颈动脉球囊损伤模型中携Pik3cb shRNA的纳米微泡联合UTMD转染,14 d后,内膜与中膜面积(I/M)比值为(0.48±0.08),低于建模对照组的(0.96±0.12)和Pik3cb shRNA组的(0.66±0.07),结果表明携Pik3cb shRNA微泡可显著下调磷酸化蛋白激酶B(AKT)表达,进而抑制新生内膜增生。

4 作为基因载体改善心功能

临床基因载体常应用病毒。病毒载体因具有高转染性,能在体内高效、长期、稳定表达,临床科研中常用于基因转染,同时具有易被免疫系统识别并清理、易被体内溶酶体降解、难与细胞表面结合、难以穿透细胞或组织等缺点,临床应用存在局限。近年来,人工制备的微泡一定程度克服了病毒载体应用的困难,微泡可参与介导基因转染,提高基因表达,用于心力衰竭的治疗,改善心功能,具有高靶向性、特异性结合靶细胞,毒副作用低,避开免疫系统,高效率运载基因等优点,可用于血管注射,在基因治疗、基因转染等分子生物学中应用广泛。目前,UTMD逐渐应用于心力衰竭的基因治疗,如用于传递腺病毒或质粒DNA到心肌[18]。Erikson等[19]将UTMD用于传递反义寡核苷酸(AS-ODN)至缺血心肌内,对抗TRAF3IP2(缺血/再灌注能诱导TRAF3IP2在心脏的表达,产生不良后果),结果显示,TRAF3IP2 AS-ODN能有效抑制心室不良重构。炎性小体(NLRP3)是糖尿病心肌病(DCM)的发病因素之一。肖雯婧等[20]研究SD大鼠发现,在DCM中,通过制备负载siNLRP3(NLRP3小干扰RNA)的纳米微泡并结合UTMD沉默NLRP3,具有增强对心肌的保护作用。Cao等[21]在心肌梗死24 h后犬体内输注含血管生成素1(Ang1)质粒的微泡,并使用直径为1 cm的换能器在心脏区域进行超声基因转染,采用300 kHz和2 W/cm2的连续波照射,每次间隔10 s,共20 min;与对照组比较,UTMD-Ang1组心功能改善,且心肌梗死后1个月时血浆去甲肾上腺素和N端B型利钠肽(NT-BNP)水平显著降低。

5 减少心肌细胞损伤及凋亡

Cui等[22]将UTMD与核定位信号多肽(NLS)结合组成新型基因转染系统,将Ang1基因转染到犬心肌梗死模型中,结果显示,Ang1 mRNA和蛋白质仅在UTMD结合NLS实验组与单独使用UTMD实验组中表达,且UTMD结合NLS实验组较单独使用UTMD实验组高出1.6倍,NLS参与协助DNA进入细胞核内,为UTMD用于基因转染的研究提供了思路。随着年龄的增长和心肌损伤的发生,生长分化因子11(GDF11)表达降低。Du等[23]通过UTMD介导的GDF11转染有效保护老龄小鼠心脏免受缺血-再灌注损伤,改善了衰老心脏的活力。Zhang等[24]通过UTMD结合搭载非有丝原酸性成纤维细胞生长因子(NM-aFGF)纳米微泡至DCM大鼠体内,观察到该过程激活了AKT/糖原合酶激酶(GSK)/核因子E2相关因子2(Nrf-2)信号通路,抑制由糖尿病引起的心肌氧化应激损伤,最终逆转DCM大鼠心肌结构和功能。微小核糖核酸(miRNA)在病理性心肌肥厚中表达失常。通过搭载抗miR-23a的微泡联合UTMD对左心室肥厚大鼠进行治疗,发现其可抑制心肌细胞肥大,保留心脏功能,首次发现通过UTMD给药较全身给药所需剂量低200倍以上[25]。Sun等[26]研究显示,UTMD搭载miR-21进入阿霉素诱导的心脏毒性小鼠体内可恢复心功能,减少细胞凋亡,为预防与治疗化疗后的心脏毒性提供思路。Zhong等[27]将UTMD搭载miR-150-5p用于治疗心肌细胞损伤,通过抑制四肽重复结构域5(TTC5)表达,减轻糖氧剥夺(OGD)诱导的原发心肌细胞损伤,同时调节细胞因子水平抵消OGD治疗对炎症反应的影响。

6 有助于心肌血管再生并抑制心肌纤维化

急性心肌梗死是由于冠状动脉急性收缩导致供血区域的心肌缺血缺氧,心功能急剧下降,严重可致坏死。向梗死区域内输注与血管再生相关细胞、因子、特定药物等可协助血管再生以恢复局部血供,精确运送骨髓干细胞。Xu等[28]研究表明,超声微泡联合骨髓间充质干细胞输注可诱导血管内皮生长因子(VEGF)分泌,提高梗死心肌的血管再生率,改善区域血流灌注,相较于对照组,心肌纤维化面积减小了46.8%,提示具有抑制心肌纤维化和重构的作用。Chen等[29]研究显示,再灌注成功后的急性心肌梗死病人,若于2～4周后仅给予骨髓细胞,无法改善心功能,若联合超声微泡,可有效促进心肌c-kit+细胞增殖,增强延迟的骨髓细胞向缺血心肌的特异性聚集,改善心功能,减轻心室重构。因脯氨酰羟化酶结构域蛋白2(PHD2)可降解在缺血心肌中具有保护作用的缺氧诱导因子1α(HIF-1α)。Zhang等[13]使用UTMD介导传递shRNA至缺血区域以沉默PHD2基因,结果显示,实验组增强型绿色荧光蛋白(EGFP用于评估转染效率)阳性细胞约占33.10%,高于单纯质粒组(0.51%)和质粒+超声组(5.21%),实验组区域内促血管生成因子如HIF-1α、VEGF和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)表达增加;与对照组比较,实验组细胞凋亡率降低,梗死瘢痕减少,毛细血管密度和心肌灌注增加。Sun等[30]将脯氨酰羟化酶结构域蛋白2(PHD2)shRNA修饰的骨髓干细胞在UTMD作用下输入急性心肌梗死区域,可有效提高细胞存活率,增加血管再生。基质细胞衍生因子1α(SDF-1α)已被证实是重要的干细胞趋化因子之一,在心肌梗死后,干细胞通过趋化作用进入到梗死心肌内参与修复。SDF-1α/CXCR4通路在趋化过程发挥起着关键作用。Su等[31]研究显示,在心肌梗死大鼠体内运用UTMD转染SDF-1α基因,转染后发现梗死区CXCR4 mRNA表达水平升高,外周血SDF-1α水平增高,骨髓间充质干细胞向梗死区归巢增多,且随着SDF-1α表达的增加而增加,重复操作可循环增加。Yu等[32]研究进一步发现UTMD联合phSDF-1α-核因子-κB(NF-κB)转染可提高SDF-1α表达。Zhou等[33]研究显示,在频率4 MHz、脉冲频率20 Hz的低强度超声下,联合微泡,在8、18、26周期的脉冲长度(PL)治疗,结果显示,DCM模型大鼠磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)-AKT-内皮型一氧化氮合成酶(eNOS)信号通路被激活,血管细胞活力增强,促进血管生成,心功能改善,显著抑制心肌纤维化;与对照组比较,UTMD脉冲长度为3个周期,声压级为50%,机械指数为0.82,治疗时间为3 min,是增加血管内皮细胞活力的最佳条件。Zhang等[34]研究显示,UTMD可增强DCM大鼠的心肌血管活性,促进再生,其中以脉冲长度为26个周期的亚组效果最显著。Zhu等[35]研究显示,UTMD参与治疗的心肌梗死大鼠体内VEGF、eNOS表达及一氧化氮表达均升高,梗死面积较治疗前缩小,射血分数较治疗前升高,证实UTMD是一种潜在的治疗心肌梗死的物理方法。Yu等[36]研究显示,UTMD与亚硝酸盐协同治疗,通过增加eNOS恢复血管功能,同时亚硝酸盐参与可防止氧化应激。

7 小结与展望

在难治性及药物疗效较差的心脏疾病(如难治性心力衰竭、心肌梗死后的恢复及冠状动脉微血管再通等)治疗方面,UTMD可作为一种将目标基因传递到活体动物器官的新疗法,应用于心血管疾病中显示出治疗潜力,为难治性心脏病提供了一种治疗新思路。尽管UTMD显示出广阔的应用前景,但该技术相关目标基因的选择、微泡特定靶向能力、靶向显影效果、提高靶向微泡的穿透能力及基因携带能力,超声辐照的强度、时间及治疗后产生的长期副作用等有待进一步研究。