经典名方开心散不同粉碎方式下成分含量差异研究*

李胜，李超，丁辉，宋新波，2，3

（1.天津中医药大学制药工程学院，天津 301617；2.省部共建组分中药国家重点实验室，天津 301617；3.现代中药海河实验室，天津 301617）

经典名方开心散（KXS）最初记载于唐代孙思邈所著的《备急千金药方·卷十四》，由远志、人参、茯苓、石菖蒲4 味药物组成。经文献考证4 味药物的比例为远志∶人参∶茯苓∶石菖蒲=1∶1∶2∶1[1]。其中远志安神益智，交通心肾，祛痰消肿；人参补气固脱，生津养血，宁心益智；茯苓利水渗湿，健脾宁心；石菖蒲开窍豁痰，醒神益智，化湿开胃[2]。各味药物活性物质之间相互协同，配伍主治好忘。临床常被用来治疗阿尔茨海默病[3-4]、血管性痴呆[5]、认知障碍[6]等以记忆功能障碍为主要表现的疾病，同时对抑郁[7-8]、失眠[9]、疲劳[10]、糖脂代谢紊乱[11]等疾病亦有积极的治疗效果。

散剂作为中药常用剂型之一，是指将药物粉碎后混匀成粉末状，具有制备简单、起效迅速、服用方便、有效成分利于溶出、药材利用度高、节约药物资源等优势，在历代方剂中使用频率颇高，历史悠久[12-13]。《中华人民共和国药典》2015年版记载的粉碎方法有“用时捣碎”“用时打碎”“切碎”“碾碎”“砸碎”“打成碎块”“研粉”“研末”“挫成粉末”“水飞”等方法[14]。目前，KXS 的相关研究主要集中于化学成分[15-16]、药理机制[17-18]及体内代谢[19]方面，而关于KXS 制备工艺方面的研究相对较少，其粉碎方式的研究未见文献报道。因此，本研究以KXS 为研究对象，以传统捣碎、传统碾碎、现代机器粉碎对药材进行处理，采用高效液相-二极管阵列检测器（HPLCPDA）法检测非挥发性成分，顶空固相微萃取-气质联用（HS-SPME-GC/MS）法检测挥发性成分，旨在探究不同粉碎方式对KXS 成分含量的影响，为KXS药材粉碎工艺提供参考依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器 手持式红外测温仪，苏州特安斯电子有限公司；DLS 粒径测定仪，美国布鲁克海文仪器公司；LC 高效液相色谱仪，SHIMADZU日本岛津公司；HyPURITY C18色谱柱（250 mm×4.6 mm），塞默飞世尔科技有限公司；7890B-7000D 三重四极杆气质联用仪，美国Agilent 公司；手动固相微萃进样器，德国Gerstel 公司；HP-5MS 毛细管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），美国Agilent 公司；SPME 萃取纤维（100 μm PDMS，85 μm Polyacrylate，65 μm PDMS/DVB，50/30 μm DVB/CRA/PDMS），美国Supelco 公司；AL204 型电子天平，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；KQ2200DB型数控超声波清洗器，昆山超声仪器有限公司；CascadaTM超纯水机，美国PALL 公司；中药捣药罐（纯铜），中药碾药槽（纯铜），天津市宏兴铸造厂；中草药粉碎机，天津市泰斯特仪器有限公司。

远志（批号190601）、人参（批号190704）、茯苓（批号190609）及石菖蒲（批号047-2017122902）均由天津中一制药有限公司提供，经天津中医药大学张丽娟教授鉴定，远志为远志科植物远志Polygala tenuifoliaWilld.的干燥根，人参为五加科植物人参Panax ginsengC.A.Mey.的干燥根和根茎，茯苓为多孔菌科真菌茯苓Poria cocos（Schw.）Wolf 的干燥菌核，石菖蒲为天南星科植物石菖蒲Acorus tatarinowiiSchott 的干燥根茎。

2 方法与结果

2.1 KXS 散剂的制备 按比例称取各单味药，混合，以不同粉碎方式（传统捣碎、传统碾碎、现代机器粉碎）处理，将细粉过6 号筛，直至95%质量以上的药材均已过筛，即得KXS 散剂，每种粉碎方法制备3 份。

2.2 KXS 粉碎过程中温度变化及成品粒径考察

2.2.1 温度测定 粉碎前记录各单味药材的初始温度，粉碎过程中30 s 进行1 次测温（共测5 次），结果见表1 及表2。

表1 各单味药物的初始温度℃

表2 KXS 在不同粉碎过程中的温度变化

2.2.2 粒径测定 精密称取3 种粉碎方式制得的KXS 0.01 g，置于10 mL 容量瓶中，加少量纯水摇匀，再加纯水定容至刻度线，超声混合30 min，拿出冷却至室温，粒径仪测定粒径，结果见表3。

表3 不同粉碎方式制得的KXS 粉末平均粒径nm

2.3 HPLC-PDA 法测定不同粉碎方式下非挥发性成分含量

2.3.2 供试品溶液的制备 精密称取KXS 2.0 g，置于10 mL 容量瓶中，加适量75%甲醇，超声45 min，冷却15 min，再次超声45 min，冷却至室温，加75%甲醇定容至刻度，抽滤，取滤液，用0.22 μm 微孔滤膜过滤，即得。

2.3.3 色谱条件 色谱柱：HyPURITY C18色谱柱（250 mm×4.6 mm）；柱温：30 ℃；流动相：0.05%磷酸水溶液-乙腈，梯度洗脱：0～25 min，19%～21%乙腈；25～35 min，21%～21%乙腈；35～40 min，21%～32%乙腈；40 ～55 min，32%～40%乙腈；55 ～60 min，40%～95%乙腈；60～65 min，95%～95%乙腈；65～75 min，95%～19%乙腈；流速1 mL/min；进样体积50 μL；检测波长203 nm。混合对照品溶液、供试品溶液色谱图见图1。

图1 混合对照品和KXS 样品液相色谱图

2.4 方法学考察

2.4.1 线性关系考察 精密量取系列质量浓度的标准品溶液，75%甲醇配制成6 个不同浓度的混标溶液，按照“2.3.3”项中的色谱条件进样，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，计算回归方程及相关系数，结果见表4，表明其线性关系良好。

表4 KXS 各指标成分的线性关系考察结果

2.4.2 精密度实验 精密量取“2.3.1”项中5 种标准品溶液各1 mL，置于5 mL 容量瓶中，加75%甲醇定容至刻度线，按照“2.3.3”项中的色谱条件连续进样6 次，记录峰面积，计算远志酮Ⅲ、3，6’-二芥子酰基蔗糖、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1 峰面的RSD 值，结果分别为1.24%、1.48%、1.06%、1.11%、1.35%，RSD 值均小于3.0%，表明仪器精密度良好。

2.4.3 重复性考察 取“2.1”项中制备的KXS，按“2.3.2”项中的方法制备供试品溶液，按“2.3.3”项中的色谱条件进样，记录各组指标成分的峰面积，计算RSD 值，该条件下各指标成分的峰面积RSD 值分别为2.64%、0.54%、2.49%、2.78%、1.47%，RSD 值均小于3.0%，表明该方法重复性良好。

2.4.4 稳定性考察 取“2.1”项中制备的KXS，按“2.3.2”项中的方法制备供试品溶液，按“2.3.3”项中的色谱条件进样，分别在0、2、4、8、12、24 h 分别进样1 次，记录各组指标成分的峰面积，计算RSD 值。远志酮Ⅲ、3，6’-二芥子酰基蔗糖、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1 的峰面积RSD 值分别为1.14%、0.52%、1.47%、1.49%、1.46%，RSD 值均小于3.0%，表明该供试品溶液在24 h 内稳定。

2.4.5 加样回收率考察 精密称取已知指标成分含量的KXS 2.0 g，分别加入约与样品等量的各对照品，按“2.3.2”项中的方法制备供试品溶液，按“2.3.3”项中的色谱条件进样。计算远志酮Ⅲ、3，6’-二芥子酰基蔗糖、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1 的平均加样回收率并计算RSD值，平均加样回收率分别为96.56%、97.88%、99.32%、98.37%、99.20%，RSD 值分别为0.77%、0.83%、1.62%、1.37%、0.96%。

2.4.6 不同粉碎方式对KXS 非挥发性成分的影响 精密称取传统捣碎、传统碾碎、现代机器粉碎条件下制备的KXS 样品每份2.0 g，按“2.3.2”项中的方法制备供试品溶液，每种粉碎方法制备3 份供试品，按“2.3.3”项中的色谱条件进样检测，记录峰面积，代入标准曲线方程，计算出各指标成分的含量，结果见表5。

表5 不同粉碎方式下5 种成分的含量测定结果 μg/g

结果显示，传统捣碎及碾碎制得的KXS 中各指标成分含量均高于由现代机器粉碎制得的KXS，而捣碎与碾碎相比，由碾碎制备的KXS 中各指标成分含量较高。

2.5 HS-SPME/GC-MS 法测定不同粉碎方式下挥发性成分含量

2.5.1 顶空固相微萃取条件 分别称取“2.1”项中的KXS 粉末各0.1 g 于20 mL 的顶空瓶中，迅速压紧瓶盖，备用。

2.5.2 色谱质谱条件 色谱柱：Agilent HP-5MS 毛细管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；进样口温度：250 ℃；载气为氦气（＞99.999%）；载气流速：1 mL/min；分流比为2∶1；程序升温条件：以初温45 ℃保持2 min，以12 ℃/min 的速率升至117 ℃，以1 ℃/min 的速率升至138 ℃，再以4 ℃/min 的速率升至142 ℃，保持0.5 min，最后以20 ℃/min 的速率升至230 ℃，保持3 min。孵化温度为55 ℃，孵化时间为55 min，吸附时间为40 min，解吸时间为300 s；质谱检测器离子源为EI 离子源，电离电压为70 eV，离子源温度为230 ℃，四极杆温度为150 ℃，质量扫描范围为30～500 amu，全扫描模式采集，质谱标准库为NIST17。

2.5.3 不同粉碎方式对KXS 挥发性成分的影响 KXS总离子图如图2所示，根据匹配度、保留指数及参考文献对各色谱峰进行定性分析，采用峰面积归一法确定各成分的相对百分含量[20]，结果见开放科学（资源服务）标识码（OSID）。从不同粉碎方式处理的KXS 中共鉴定出56 种共有化合物，分别占总挥发性成分的93.19%（捣碎）、94.16%（碾碎）、94.04%（现代机器粉碎），可将其分为8 类化合物，包括醚类、萜类、醇/酸/醛类、酯/酮类、碳氢化合物。其中醚类占比最高，达80.38%，种类有7 种；萜类种类最多，有36 种，占比为12%；醇/酸/醛类6 种、酯/酮类4 种、碳氢化合物3 种，分别占比为0.99%、0.24%、0.19%。

图2 KXS 挥发性成分的总离子流图

选取8 种相对百分含量较高的化合物进行分析，结果显示，（+）-长叶环烯、β-石竹烯、β-细辛醚在传统捣碎条件下占比最大，分别为1.09%、1.15%、43.98%。其中（+）-长叶环烯、β-石竹烯在传统捣碎、碾碎条件下占比差异不大，在现代机器粉碎条件下占比最小，分别为0.93%、1.02%。β-细辛醚在传统碾碎、现代机器粉碎条件下占比差异不大，在传统碾碎条件下占比最小，为43.22%；白菖烯、异丁香酚甲醚、γ-细辛醚在碾碎条件下占比最大，分别为1.45%、4.84%、24.32%。其中白菖烯在传统捣碎、碾碎条件下占比差异不大，在现代机器粉碎条件下占比最小，为1.27%。异丁香酚甲醚、γ-细辛醚在传统碾碎、现代机器粉碎条件下占比差异不大，在传统捣碎条件下占比最小，分别为4.21%、23.62%；甲基丁香酚和α-细辛醚在现代机器粉碎条件下占比最大，分别为6.58%、1.40%。甲基丁香酚在传统碾碎、现代机器粉碎条件下占比差异不大，在传统捣碎条件下占比最小，为5.54%。α-细辛醚在传统捣碎、碾碎条件下占比差异不大，在传统碾碎条件下占比最小，为1.16%。

3 讨论

粉碎方式作为中药材前处理的一种，对其药效的影响不容忽视，在粉碎过程中温度与粉末粒径可能对KXS 的成分含量有所影响，因此本实验对这两个因素进行了考察。结果表明，虽然散剂粉末均通过6 号筛，但由于机器粉碎在粉碎过程中混合更加均匀，粉碎力度更大，同时由于机器刀头剧烈摩擦，因此粒径较其他两种粉碎方式要小且在粉碎过程中升温非常明显，温度最高达55 ℃，传统碾碎比传统捣碎制得的散剂粒径更小，在温度方面差异不大且各批次间基本没有差异。

对于5 种非挥发性成分，现代机器粉碎制得的KXS 均低于其他两种制法，推测由于高温使各种物质之间发生了相互作用，导致其部分成分发生了变化，且粉碎过程中的剧烈搅拌更加加剧了这种情况。而传统捣碎、碾碎均为人工操作，在粉碎过程中温度相差不大，但碾碎制得的KXS 成分含量略高于捣碎，推测是由于碾碎更加能够将各单味药物混合均匀，也更加能够将其充分粉碎，所得粉末粒径更小所造成；HS-SPME/GC-MS 法鉴定出的56 种共有成分均占总挥发性成分的90%以上，其中由传统碾碎制备的KXS 挥发性成分占比最高，为94.16%。除3 种细辛醚外，（+）-长叶环烯、β-石竹烯、白菖烯、异丁香酚甲醚、甲基丁香酚的占比也高于其他成分，推测在KXS 发挥药效时起到潜在作用。此8 种成分中，有6 种在由传统捣碎、碾碎制得KXS 中的相对百分含量较高，虽然某些成分在传统捣碎、现代机器粉碎制得的KXS 中占比较高，但均与传统碾碎相差不大。因此，综合两种检测KXS 成分含量的方法，在其前处理过程中，以传统碾碎制备KXS 能够较大程度保留其成分。对于本方，从目前的结果来看不同的粉碎方式已对其成分含量产生了一定影响，此种差异是否会在药效方面产生影响，还有待进一步研究证实。