翁布总黄酮提取工艺的优化及体外抗氧化研究

陈海娟，曾阳，张国燕，尚军*

（1.青海师范大学 生命科学学院 青海省青藏高原药用动植物资源重点实验室，青海 西宁 810008；2.高原科学与可持续发展研究院，青海 西宁 810008）

低共熔溶剂（Deep eutectic solvents， DESs）是由氢键受体和供体按合适的比例混合加热而成的低共熔混合物，近年来，在天然产物有效成分的提取中的应用受到了广泛关注［1］。和传统的有机提取溶剂乙醇、氯仿等相比，低共熔溶剂在提取分离方面更加高效、安全、环保［2-3］。

翁布为柽柳科水柏枝属多种植物的嫩枝叶，为藏族习用药材之一，主治风湿痹痛［4］。前期研究表明，翁布总黄酮（Myricaria germanicatotal flavonoids， MGFs）是翁布治疗类风湿性关节炎的有效组分［5］，其主要是通过降低大鼠体内炎症介质的释放，调节氧化应激的网络平衡来改善佐剂性关节炎大鼠的症状［5-6］。

因此，本研究将结合DESs的优点，采用响应面优化法对DESs提取MGFs的工艺进行了优化，并考察了MGFs体外抗氧化的活性，以期为MGFs的合理开发和利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

翁布嫩枝叶采自青海省海东市民和县古鄯镇，经青海师范大学生命科学学院尚军副教授鉴定为水柏枝［Myricaria germanica（L. Desv.）］。

1.2 试剂

芦丁对照品（纯度≥98%，成都普菲特生物科技有限公司）；氯化胆碱、丙三醇、1，3-丁二醇、1，4-丁二醇、乙二醇均为分析纯（上海阿拉丁试剂有限公司）；其余试剂均为分析纯（天津市富宇精细化工有限公司）。

1.3 仪器

KQ-100WS超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；DFT-200A高速粉碎机（温岭市林大机械有限公司）；BSA2202S电子天平（德国Sartorius）；V-5100型紫外-可见分光光度计（上海精科实业有限公司）。

1.4 试验方法

1.4.1 不同种类的DESs的制备

如表1所示，氯化胆碱和多元醇按不同的摩尔比例混合，磁力搅拌器（80℃）加热搅拌制备。

表1 不同摩尔比例的DESs的制备Tab.1 The preparation of DESs with different molar ratio

1.4.2 MGFs的提取

取晒干的翁布枝条，去除多余的杂质，粉碎过筛备用。精密称取翁布药材粉末10份，每份1 g，分别置50 mL离心管中，其中8份加入上述1.4.1制备的不同摩尔比例的DESs 30 mL，另2份分别加入30 mL的纯水和70%的乙醇，超声，离心（4000 r/min）10 min，吸取上部澄清的液体，即为MGFs提取液。

1.4.3 MGFs得率的测定

标曲的制作参考王丽丽［7］的方法，线性回归方程为Y= 5.7343X+ 0.0113，R2= 0.9988。

MGFs提取液总黄酮的测定：精密吸取MGFs提取液1 mL，参照标准曲线的制作方法测得。

1.4.4 单因素试验

参照1.4.2所述的方法提取MGFs，选取DES-4（氯化胆碱∶乙二醇 = 1∶2）为提取溶剂，设计如表2所示的单因素试验，考察不同的因素对MGFs得率的影响。

表2 单因素试验设计Tab.2 Single factor experimental design

1.4.5 响应面优化试验

根据1.4.4所述的单因素试验的结果，以MGFs的含量为响应值，设计3水平4因素的Box-Behnken响应面优化试验，具体如表3所示。试验数据用响应面分析软件Design Expert 11进行分析。

表3 响应面试验设计因素与水平Tab.3 Factors and levels of response surface experiment design

1.4.6 抗氧化活性

1.4.6.1 DPPH自由基清除能力测定

参考敖珍［8］等的测定方法：分别取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL的MGFs提取液和阳性对照抗坏血酸溶液2 mL于棕色具塞试管中，与DPPH溶液（0.1 mmol/L）2 mL混合后测得的溶液的吸光度（517 nm，A1）；将上述不同浓度的MGFs溶液和抗坏血酸溶液与2 mL的无水乙醇混合后测定溶液的吸光度（517 nm，A2）；将2 mL蒸馏水与2 mL DPPH溶液（0.1 mmol/L）混合后测定溶液吸光度（517 nm，A0）。

1.4.6.2 ABTS+自由基清除能力测定

参照吴均［9］的测定方法：分别取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/mL的MGFs提取液和阳性对照抗坏血酸溶液2 mL于棕色具塞试管中，与 ABTS+溶液（7 mmol/L）4 mL混合后测得溶液的吸光度（734 nm，A1）；将上述不同浓度的MGFs溶液和抗坏血酸溶液与4 mL的超纯水混合后测定溶液的吸光度（734 nm，A2）；将2 mL超纯水H2O与4 mL ABTS+工作液混合后测定溶液的吸光度（734 nm，A0）。

1.5 数据处理

采用响应面分析软件Design Expert 11设计响应曲面模型，并进行显著性统计计算和分析；采用GraphPad Prism 7绘制柱状图和散点图。

2 结果与分析

2.1 不同类型的DESs对MGFs得率的影响

本实验以8种不同类型的DES，纯水和70%乙醇为提取溶剂考察了对MGFs得率的影响，结果如图1显示。由图可见，以不同类型的DESs为提取溶剂，MGFs的得率明显优于纯水和70%乙醇，其中DES-4最为明显，MGFs得率为23.292 mg/g。这可能是由于DESs溶剂的溶解性、黏性、密度等物理化学性质与纯水和70%乙醇均具有一定的的差异造成的［10］。

图1 不同摩尔比例的DESs对MGFs得率的影响Fig.1 Effects of different molar ratio DESs on the yield of flavonoids

2.2 单因素试验结果

2.2.1 不同料液比对MGFs得率的影响

如图2所示，随着提取溶剂DES的增加，MGFs的得率也随之增加，当料液比增加到1∶25 g/mL时，MGFs得率达到最大值；随后随着料液比的增大，总黄酮含量逐渐降低。适当的料液比可以使药材粉末被充分浸润，有利于细胞内的有效成分扩散到溶剂中；当提取溶剂中DESs的比例增加到一定程度时，反而会阻碍有效成分的溶出［11］。

2.2.2 DESs的含水量对MGFs得率的影响

如图3所示，当DESs溶剂的含水量在10% ～30%的范围内时，MGFs的含量随着提取溶剂中含水量的增加而增加，在含水量达到30%时，MGFs的得率最高（19.622 mg/g）；随着提取溶剂中水的比例进一步增加，MGFs得率逐渐下降，并趋于平稳。提取溶剂中水的比例的增加，一方面导致溶剂极性增加，另一方面改变溶剂的氢键结合力，含水量过高导致溶剂的黏性降低［12］，不利于黄酮的溶解，导致黄酮得率降低。

图3 不同含水量对总黄酮得率的影响Fig.3 Effect of different water content on the yield of flavonoids

2.2.3 超声温度对MGFs得率的影响

如图4所示，当超声温度从40℃升高至60℃时，MGFs含量逐渐增加，60℃时达到最大值（23.401 mg/g），随后随着温度升高，MGFs的含量逐步下降。适当的升高温度一方面可以改变DESs的物理性质，另一方面可以加剧物质分子运动，进而导致MGFs得率的增加，但是进一步升高温度，热不稳定黄酮类化合物会受热分解，得率下降［11］。

2.2.4 超声时间对MGFs得率的影响

如图5所示，当超声时间从20 min延长到60 min时，MGFs得率先增加后减小，在超声时间为60 min时，MGFs含量达到最大值（21.112 mg/g）。超声提取的机械作用和空化现象增加了溶剂的穿透力［2，12］，因此适当的延长超声时间有利于有效成分的溶出，所以MGFs的得率逐渐增大。但是，长时间的超声会使非有效成分的溶出增加，得率降低，杂质增多。

图5 不同超声时间对总黄酮得率的影响Fig.5 Effect of different ultrasonic time on the yield of flavonoids

2.3 响应面法优化MGFs提取工艺

2.3.1 响应面试验设计及结果

响应面试验设计与实验结果见表4，利用分析软件 Design Expert 11对结果进行多元回归拟合，回归方程为：Y = 27.56 - 0.6999A + 4.19B - 1.11C +1.86D+ 1.1AB -0.3905AC - 0.091AD +1.69BC+1.38BD + 0.7357CD - 4.08A2- 4.69B2- 4.33C2-3.31D2

表4 响应面优化试验Tab.4 Response surface experimental design and results

由表5可知，该模型具有较好的拟合性，F值为26.77（P＜ 0.0001，极显著）；失拟项不显著（P=0.19477 ＞ 0.05）；根据F值可以判断，4个影响因素对MGFs提取率大小的影响分别为：料液比、超声温度、超声时间、含水量；B、C、D、AB、 BC、BD、A2、B2、C2、D2对MGF提取效果影响显著；R2= 0.9640，Radj2= 0.9288表明回归模型具有较好的拟合度。

表5 方差分析表Tab.5 Variance analysis of test results

2.3.2 双因素交互作用的影响

如图6所示，AB、BC、BD的等高线有较大的倾斜度，说明两者的交互作用对MGFs的得率影响较大（P＜ 0.05）；而AC、AD、CD的等高线比较平缓，说明两者交互作用对MGFs得率的影响不显著（P＞ 0.05）。

图6 各因素交互作用的响应面图Fig.6 Response surface graph of the interaction between various factors

经响应面分析，最优提取工艺为：含水量29.78%，料液比1∶27.51，超声时间40.03 min，超声温度63.87℃，在此条件下模型预测的MGFs的提取率为 28.974 mg/g。为方便操作，将上述条件微调为：含水量30%，料液比1∶27.5，超声时间为40 min，超声温度64℃，所得MGFs得率为29.722 mg/g，与预测值的拟合度较好，MGFs提取工艺条件简单可行。

2.4 体外抗氧化活性试验

2.4.1 MGFs对DPPH自由基的清除能力

如图6所示，随着MGFs提取液的浓度的增加（0.2～1.0 mg/mL），其对DPPH自由基的清除能力也逐渐增加；当MGFs提取液浓度为1.0 mg/mL时，与相同浓度的抗坏血酸对DPPH自由基的清除率接近，分别是98.13%和98.99%。

2.4.2 MGFs对ABTS+自由基的清除能力

如图7所示，随着MGFs提取液的浓度的增加（0.2～1.0 mg/mL），其对ABTS+自由基的清除能力也逐渐增加；当MGFs提取液浓度为1.0 mg/mL时，与相同浓度的抗坏血酸的清除率接近，分别是98.31%和99.36%。

图7 总黄酮对DPPH自由基的清除能力Fig.7 Clearance activity of total flavonoids on DPPH radical

图8 总黄酮对ABTS+自由基的清除能力Fig.8 Clearance activity of total flavonoids on ABTS+ free radicals

3 讨论与结论

翁布作为常用的藏药，其来源为柽柳科水柏枝及其同属多种植物的干燥嫩枝［14］。目前已报道的水柏枝属的植物的化学成分主要有黄酮类，萜类、酚酸类和木质素等［15-18］。DESs作为一种绿色溶剂，环保无毒，在野生植物有效成分的提取和分离中有广泛的应用前景。

本研究以青海省海东市民和县古鄯镇河沟漫滩边的翁布为研究对象，以8种不同类型的DESs、纯水和70%乙醇为提取溶剂，结果表明以多元醇类化合物为配体的DESs对MGFs的提取效果明显优于纯水和70%乙醇，究其原因可能与多元醇类化合物结构中的羟基对黄酮有很好的溶解性，可以大大提高黄酮类化合物的提取效果有关［8］。利用超声波辅助低共熔溶剂法，以含水量、料液比、超声时间、超声温度为单因素，以藏药MGFs得率为响应值，采用响应面法优化MGFs的提取工艺，最终得到的MGFs的最佳提取工艺为：DESs的含水量为30%，翁布粉末与DESs的料液比为1∶27.5，超声时间为40 min，超声温度为64℃，MGFs得率为29.722 mg/g。根据方差分析结果显示，影响MGFs得率大小的因素依次为料液比、超声温度、超声时间和含水量。

体外抗氧化实验表明，当MGFs的浓度为1.0 mg/mL时，对DPPH自由基、ABTS+自由基的清除率分别可达到相同浓度Vc清除率的98.13%，98.31%。表明翁布黄酮类化合物具有较强的体外抗氧化能力［13］。本研究可以为翁布的合理开发利用提供理论依据。