原位电离质谱快速筛查猪肉中10 种磺胺

郝莉花，巩凡，李存良，冯琳琳，罗莉，杨龙松

（河南省产品质量检验技术研究院，河南 郑州 450000）

磺胺类药物是指带有氨基苯磺酰胺结构的一类药物，被用于预防和治疗各种细菌感染性疾病，在畜牧业和动物疾病的治疗中广泛使用。长期食用含有超过规定限量的磺胺类药物的动物源性食品可能导致泌尿系统和肝脏受损，过量摄入可能增加患癌风险[1-2]。因此，对于动物源性食品中磺胺类药物检测显得尤为重要。

目前检测磺胺类药物常用的方法有高效液相色谱法以及液相色谱串接质谱法[3-5]、微生物法[6]、表面荧光免疫检测法[7]和表面增强拉曼光谱法[8]等。高效液相色谱法和液相色谱串接质谱法特异性强且灵敏度好[9]，但样品前处理复杂，检测时间长。微生物法主要利用磺胺类有效抑制特异微生物代谢，从而测定样品中磺胺类的残留量，方法成本较低但灵敏度差，易受其他抗生素的干扰[6，10]。上述方法存在前处理繁琐、检测时间周期长等缺陷，已经不能满足如今快速、精准、简便的检测要求。因此，开发磺胺的快速检测方法具有较高的应用价值。

磺胺药物残留的快速检测方法包括荧光免疫层析技术、表面增强拉曼光谱法和原位直接电离质谱等。荧光免疫层析技术是一种新兴的膜检测技术，其原理基于抗原抗体的特异性免疫反应，方法操作简便但易出现假阳性或假阴性，灵敏度较低。表面增强拉曼光谱法具有样品前处理简单和灵敏度高等优点，广泛用于农产品中抗生素残留检测[11-12]，但同样易出现假阳性或假阴性。原位直接电离质谱法无需复杂的样品制备过程，可在常压环境中实现原位、直接、快速的样品分析，目前在药物分析、代谢组学的快速筛查方面应用广泛[13-17]。实时直接分析(direct analysis in real time，DART) 离子源是一种非表面接触的热解析大气压电离的原位质谱，具有简单性和灵敏性特点，可直接分析固体、液体和气体[18-20]。DART 离子源具有高检测速度和抗基质干扰性。它不需对样品进行预处理，可以直接电离样品，缩短了样品的分析周期，提高了质谱分析通量，实现样品的原位、无损、实时、直接快速分析[18]。李无双等[21]建立了DART 串联三重四极杆质谱直接分析桑叶γ-氨基丁酸，此方法前处理快速、简单，降低了检测成本和操作难度。此外，DART 质谱方法还能够实现对乳制品的高通量和全自动检测，以及用于检测火锅底料、调味料中的罂粟壳生物碱。DART质谱法操作简单省时，为食品安全监测工作提供了重要的技术支持[22]。

本研究利用DART 串联三重四极杆质谱的方法快速筛查猪肉中10 种磺胺。猪肉经过溶剂提取和简单净化后，通过DART 源串接三重四极杆液质仪技术进行分析测定，以实现磺胺类药物残留的实时、快速、直接分析。本方法免去了液相色谱分离时间、简化了前处理操作步骤，适用于大量样品中筛查磺胺类药物，在风险监测和监督抽检工作中具有重要的应用价值。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

猪肉（肌肉组织）：市售；乙腈（色谱纯）：德国Merck 公司；兽药残留试剂盒（5982-0032/4950）、有机微孔滤膜（0.45 μm）：美国Agilent 公司；PRiME HLB 固相萃取小柱：美国waters 公司；磺胺类混标[磺胺喹恶啉标准品（99.8 μg/mL）、磺胺氯哒嗪标准品（100.1 μg/mL）、磺胺嘧啶标准品（100.0 μg/mL）、磺胺间二甲氧嘧啶标准品（100.1 μg/mL）、磺胺邻二甲氧嘧啶标准品（99.9 μg/mL）、磺胺甲基嘧啶标准品（99.8 μg/mL）、磺胺二甲基嘧啶标准品（100.0 μg/mL）、磺胺间甲氧嘧啶标准品（100.1 μg/mL）、磺胺吡啶标准品（99.8 μg/mL）、磺胺噻唑标准品（100.2 μg/mL）]：天津阿尔塔科技有限公司。

1.2 仪器与设备

ME104E 电子天平（0.1 mg）、XA205 电子天平（0.01 mg）：METTLER TOLEDO 公司；Milli-Q 去离子水发生器：美国Millipore 公司；QL 866 漩涡混合器：海门市其林贝尔仪器制造公司；SB-25-12DT 超声波发生器：宁波新芝生物科技有限公司；Velocity 18R Pro 离心机：澳大利亚Dynamica 公司；N-Evap 氮吹仪：上海安谱实验科技股份有限公司；4500 三重四极杆质谱仪：美国AB SCIEX 公司；DART SVP 离子源：美国Ion-Sense 公司。

1.3 试验方法

1.3.1 样品前处理

市售猪肉经粉碎后制成猪肉样品。

提取：称取猪肉样品2.5 g 于50 mL 塑料旋盖离心管中，使用移液管准确加入10.00 mL 乙腈，涡旋振荡2 min 并超声辅助提取20 min，上清液即为提取液。

净化：净化分为不净化、分散固相萃取净化和固相萃取柱净化3 种方式。

直接提取法（不净化）：将提取液于冷冻离心机中10 000 r/min 离心5 min。准确量取2.00 mL 上清液，于氮吹仪中40 ℃氮吹至干，经溶剂转换后待测。

分散固相萃取净化：将提取液加入5 g 兽药残留试剂盒盐包，涡旋振荡2 min 混匀，于冷冻离心机中10 000 r/min 离心5 min。准确量取6.00 mL 上清液于内含兽药残留试剂盒净化包的10 mL 塑料旋盖离心管中，涡旋振荡30 s，4 000 r/min 离心10 min。准确量取2.00 mL 上清液，40 ℃氮吹至干，经溶剂转换后待测。

固相萃取柱净化：提取液于10 000 r/min 离心5 min。准确量取5.00 mL 上清液转移至PRiME HLB固相萃取小柱上，收集洗脱液2 mL，40 ℃氮吹至干，经溶剂转换后待测。

溶剂转换：加入0.5 mL 的20%乙腈水复溶，涡旋振荡30 s，超声5 min 充分溶解，过0.45 μm 有机微孔滤膜，得到提取液。

1.3.2 仪器参数

仪器参数条件：预备气体为高纯度氮气，工作气体为高纯度氦气；碰撞气设定为Medium；气帘气设定为20 psi；碰撞室入口电压10 V，出口电压6 V；离子源温度为250 ℃，解离工作气体温度350 ℃；栅网电极电压200 V；隔膜泵压力12.0 kPa；扫描模式为多反应监测。待测化合物定量离子对、定性离子对及碰撞能量见表1。

表1 待测化合物定量离子对、定性离子对及碰撞能量Table 1 Quantitative ion pair，qualifier ion pair and collision energy of the analyte compound

1.3.3 标准溶液配制

混标储备液：取1 mL 磺胺类混标于10 mL 容量瓶中，用乙腈定容并混匀，配制成10 μg/mL 混标储备液。

混标中间液：取1 mL 混标储备液于10 mL 容量瓶中，用乙腈定容并混匀，配制成1 μg/mL 混标中间液。

混标工作液：取10、20、50、80、100 μL 混标中间液分别用乙腈、不净化基质提取液、净化包提取液、固相萃取柱提取液定容至1 mL，配制10、20、50、80、100 μg/L 混标工作液。

1.4 数据处理

取1 mL 试样测定，将混标工作液分别测定定量离子相应的丰度，以磺胺类的浓度为横坐标，以磺胺类定量离子丰度为纵坐标，做线性回归，绘制标准曲线，采用外标法定量。

前处理过程总基质效应以基质效应（matrix effect，ME）值评价，方法基质效应计算参照文献[23]的方法，计算公式如下。

X=B/A×100

式中：X 为前处理过程总基质效应，%；A 为目标化合物在纯溶剂基质中检测的峰面积；B 为目标化合物在阴性样品处理液基质中检测的峰面积。

2 结果与分析

2.1 前处理净化效果分析

空白猪肉样品按照方法1.3.1 得到不净化提取液、净化包提取液和固相萃取柱提取液。分别取100 μL 混标中间液用溶剂（乙腈）、不净化提取液、净化包提取液、固相萃取柱提取液定容至1 mL，按照方法1.3.2 对上述3 种基质标准溶液进行测定，每个样品测定4 次，最终结果以平均值计。ME 值的计算结果见表2。典型的色谱图见图1。

图1 0.1 μg/mL 乙腈中磺胺喹恶啉色谱图Fig.1 Chromatogram of sulfaquinoxaline in 0.1 μg/mL acetonitrile

表2 不同净化方式的ME 值Table 2 ME value of different purification methods

研究通过ME 值反映基质效应的强度，即基质增强效应（ME 值＞100%）、基质减弱效应（ME 值＜100%）。表2 中ME 值范围是0.19%～26.69%，为基质减弱效应。不净化基质提取液ME 值范围为0.19%～1.35%，平均值0.74%；净化包提取液ME 值范围为5.45%～17.49%，平均值10.97%；固相萃取柱提取液ME 值范围为11.02%～26.69%，平均值15.58%。通常ME 值接近100%净化效果好[23]，通过比较ME 平均值可以看出净化效果为固相萃取柱＞净化包＞不净化基质提取液。

2.2 检出限结果分析

空白猪肉样品按照方法1.3.1 得到不净化基质提取液、固相萃取柱提取液和净化包提取液。取10 μL 混标中间液分别用乙腈、不净化基质提取液、净化包提取液、固相萃取柱提取液定容至1 mL，配制成10 μg/kg基质标准溶液，按照方法1.3.2 对上述3 种基质标准溶液进行测定，每个样品测定4 次，最终结果以平均值计。另取空白基质提取液检测，各化合物定量离子对响应结果见表3。

从表3 可以看出，10 种磺胺在10 μg/kg 时均有响应，在0 μg/kg 时，均没有响应。因此，上述3 种前处理净化方法，10 种磺胺均能够在10 μg/kg 检出，满足GB 31650—2019《食品安全国家标准食品中兽药最大残留限量》中的判定要求（磺胺类限量值为100 μg/kg），因此本方法能够实现磺胺类不合格产品的筛查。

2.3 线性范围结果分析

将1.3.3 配制的混标工作液按照方法1.3.2 测定4 次，最终结果以平均值计，同时拟合线性回归方程并计算相关系数和精密度，结果见表4。

表4 磺胺类化合物线性回归方程及相关系数Table 4 Linear regression equations and correlation coefficients of sulfonamide compounds

由表4 可知，在10～100 μg/L 范围内，不净化基质提取液配制混标工作液，10 种磺胺线性相关系数R2为0.009～0.982，平均值为0.642；以固相萃取柱提取液配制混标工作液，10 种磺胺线性相关系数R2为0.845～0.994，平均值为0.962；以净化包提取液配制混标工作液，10 种磺胺线性相关系数R2为0.545～0.960，平均值为0.782。由此可见，相关系数R2固相萃取柱提取液＞净化包提取液＞不净化基质提取液，因此以固相萃取柱提取液配制标准曲线准确性最高，以不净化基质提取液配制标准曲线准确性最低。

3 结论

本研究通过对猪肉基质的溶剂提取和简单净化，采用DART 源串接三重四极杆质谱仪实现10 种磺胺的实时快速检测分析。

本研究比较了不净化基质提取液、净化包提取液和固相萃取柱提取液中基质对目标物检测的基质效应。结果表明，产生的基质效应类型为基质减弱效应，净化效果为固相萃取柱＞净化包＞不净化基质提取液。上述3 种前处理方法10 种磺胺均能够在10 μg/kg 检出，满足GB 31650—2019《食品安全国家标准食品中兽药最大残留限量》判定要求，能够实现不合格产品的快速筛查。10 种磺胺在10～100 μg/L 时进行线性回归，相关系数为固相萃取柱提取液＞净化包提取液＞不净化基质提取液，以固相萃取柱提取液配制混标工作液时，R2平均值为0.962，线性较好，以不净化基质提取液配制混标工作液和以净化包提取液配制混标工作液时，R2平均值分别为0.642 和0.782，线性较差。

本研究建立了一种快速检测猪肉样品中磺胺类药物的方法。与GB 31658.17—2021《食品安全国家标准动物性食品中四环素类、磺胺类和喹诺酮类药物残留量的测定液相色谱-串联质谱法》中的液相色谱质谱方法相比，该方法免去了液相色谱分离时间、简化了前处理操作步骤，操作简单快速，同样达到了该标准中10 μg/kg 的检出限。另一方面，经过固相萃取柱净化后，该方法具有较好的灵敏度和准确性，可广泛应用于猪肉样品中磺胺类药物的快速筛查和准确检测。